韋佳妮 趙慧函 蔣慶娟 文萃 黃欣欣 凌瑛 應(yīng)燕萍

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（南寧 530021）

中心靜脈導(dǎo)管（central venous catheter，CVC）是經(jīng)外周靜脈置入頸內(nèi)靜脈、鎖骨下靜脈或股靜脈等大中心靜脈且末端腔位于右心房?jī)?nèi)、上腔靜脈及下腔靜脈的血管留置裝置[1]。CVC 在全世界醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的普遍使用導(dǎo)致許多導(dǎo)管相關(guān)并發(fā)癥出現(xiàn)，其中導(dǎo)管相關(guān)性血栓（catheter related thrombosis，CRT）是最常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[2]。CRT 的發(fā)生可能會(huì)危及患者生命安全，導(dǎo)致患者就醫(yī)費(fèi)用增加，加重社會(huì)醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)負(fù)擔(dān)。目前治療CRT 的方法主要包括抗凝、溶栓治療和導(dǎo)管處理。抗凝治療僅能防止血栓擴(kuò)展，并不能加速其溶解，血凝塊仍需靠機(jī)體自身緩慢溶解；而溶栓治療的療效和安全性目前仍然存在爭(zhēng)議[3，4]。靜脈血栓的最終吸收和溶解主要依賴機(jī)體自身慢性自然溶解機(jī)制，因此，增加血栓的機(jī)化和血管新生有助于血栓的溶解吸收。此外，目前的指南均不推薦在發(fā)生血栓后常規(guī)拔除導(dǎo)管，并且如果患者治療仍需使用導(dǎo)管，拔管后另選部位重新置管后出現(xiàn)新發(fā)CRT的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)86%[5]。循證指南中指出置管側(cè)早期有效的上肢運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)血液循環(huán)，降低CRT的發(fā)生率[6]。近些年有研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可通過提高血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）表達(dá)及其活性水平來提高抗氧化能力[7]。而HO-1是血管內(nèi)皮重要保護(hù)因子，通過介導(dǎo)復(fù)雜的炎癥反應(yīng)及炎癥依賴性，在血管新生過程發(fā)揮重要作用[8]。此外，前期研究已表明運(yùn)動(dòng)預(yù)防CRT 形成[9，10]，但關(guān)于運(yùn)動(dòng)促進(jìn)CRT 溶解再通的研究較少。因此，本研究通過建立大鼠CRT 模型，通過抗阻運(yùn)動(dòng)、注射HO-1激動(dòng)劑鈷原卟啉（cobalt protoporphyrin，COPP）及抑制劑錫原卟啉（tin protoporphyrin IX，SnPP）干預(yù)，并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，為抗阻運(yùn)動(dòng)輔助治療CRT 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

7～8 周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠144 只，體重200～220g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物房（SYXK 桂2020-0004）。飼養(yǎng)環(huán)境室溫20℃～25℃，濕度60%～70%，12 h 光/暗周期循環(huán)，通風(fēng)、光線良好，大鼠自由進(jìn)食、飲水。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則，并通過廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（審批號(hào)：202008006）。

1.2 構(gòu)建大鼠CRT模型

前期研究發(fā)現(xiàn)，置管7天后血栓高發(fā)，10天后血栓形成穩(wěn)定[11]。因此，本研究選用置管10 天后經(jīng)B 超確診血栓形成的大鼠CRT 模型，采用動(dòng)物隨機(jī)分組軟件將大鼠隨機(jī)分為CRT 對(duì)照組（n=36）、CRT 抗阻運(yùn)動(dòng)組（n=36）、CRT+COPP 組（n=36）、CRT+SnPP 組（n=36）。大鼠CRT模型參照課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[12]，采用3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，待麻醉滿意后，右側(cè)頸部備皮，常規(guī)消毒、鋪巾，沿氣管右側(cè)0.5 cm 處縱切1～2 cm，逐層鈍性分離并游離右頸外靜脈，在結(jié)扎點(diǎn)下將靜脈剪一斜形切口，將導(dǎo)管送入至右心房上部，使用加入0.9%生理鹽水的注射器回抽血液，見回血后確認(rèn)導(dǎo)管在靜脈血管中，并且血流通暢。用配套堵頭封閉導(dǎo)管末端，縫合傷口，常規(guī)消毒。大鼠麻醉復(fù)蘇后放回鼠籠，正常進(jìn)食飲水。

1.3 干預(yù)方法

CRT+COPP 組和CRT+SnPP 組在置管10天后分別腹腔注射CoPP（c1900；Sigma）及SnPP（sentacruzBiotechnology）5mg／kg 進(jìn)行干預(yù)，CRT 對(duì)照組不做干預(yù)。CRT+抗阻運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)方案參考前期研究方法[10]。所有大鼠術(shù)前1 周進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練無負(fù)重預(yù)爬，每天能完成6次預(yù)爬的大鼠納入實(shí)驗(yàn)，否則予剔除[13]。大鼠置管10 天后采用鼠尾捆綁負(fù)重砝碼的方式進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)，爬梯高度1.1 m，階梯間隔2.0 cm，傾斜度為85°。大鼠從梯子底部開始往上爬到頂端，每周訓(xùn)練6天，休息1天，1組/天，6次/組，2 min/次，每次到達(dá)梯子頂端休息20 秒，15 min 完成一次抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，必要時(shí)刺激大鼠尾部促使其運(yùn)動(dòng)，總共訓(xùn)練4 周?？棺柽\(yùn)動(dòng)過程中，砝碼的重量根據(jù)大鼠每周的體重調(diào)節(jié)，砝碼為標(biāo)準(zhǔn)砝碼，以達(dá)到負(fù)重準(zhǔn)確量化。第1 周負(fù)重為大鼠自身體重的10%，第2周為30%，第3周為50%，至第4周負(fù)荷增加至體重的70%。

1.4 樣本采集

各組干預(yù)后的1、4、7、10、14、28 天，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取6 只大鼠，待大鼠麻醉滿意后，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，離心收集血清后放置于-80°冰箱，用于ELISA檢測(cè)血清HO-1、白介素（interleukin，IL）-6、IL-10 濃度。剪開大鼠置管側(cè)皮膚，逐層鈍性分離，取穿刺點(diǎn)至右心房上段約5 cm 靜脈血管，一部分用于病理切片HE 染色；另一部分用于qPCR 檢測(cè)。干預(yù)后的1、7、14、28天，取各組大鼠穿刺處至右心房約5 cm 靜脈血管，用于免疫組化CD31染色。

1.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.5.1 血栓溶解再通情況

血管組織經(jīng)脫水包埋、切片，行蘇木精伊紅（H&E）染色，染色切片由數(shù)字病理切片掃描儀（NanoZoomer S60）采集圖像，應(yīng)用Image-ProPlus圖像分析軟件進(jìn)行分析，使用以下公式計(jì)算各組血栓溶解率：血栓溶解率=[（靜脈管腔面積-血栓面積）/靜脈管腔面積]×100%[14]。

1.5.2 ELISA檢測(cè)

大鼠腹主動(dòng)脈采血后，室溫放置30 min，離心10 min，得到血清。使用ELISA 試劑盒檢測(cè)HO-1（ml003108）、IL-6（ml064292）、IL-10（ml002813）濃度，試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀（Synergy H1）檢測(cè)吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 熒光定量PCR檢測(cè)

使用Trizol（Invitrogen，CA，USA）提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，用SYBR Green 法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，設(shè)置復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3 次，使用2-△△Ct 法對(duì)qPCR 結(jié)果進(jìn)行分析。以大鼠RPLP1 為內(nèi)參，引物均由上海生物工程有限公司合成，引物序列為：

HO-1-F：5’-TCTGCAGGGGAGAATCTTGC-3’；

HO-1-R：5’-TTGGTGAGGGAAATGTGCCA-3；

RPLP1-F：5’-AAAGCAGCTGGTGTCAATGTT-3’；

RPLP1-R：5’-GCAGATGAGGCTTCCAATGT-3。

1.5.4 CD31免疫組化染色

血管組織石蠟包埋切片，使用0.1%檸檬酸鈉進(jìn)行熱修復(fù)，自然恢復(fù)室溫后加入anti-CD31（AF6191，Affinity Biosciences），4°孵育過夜。使用通用二步法試劑盒（PV-9000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）滴加反應(yīng)增強(qiáng)液、封閉、孵育二抗，DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）顯色，蘇木素復(fù)染。使用數(shù)字病理切片掃描儀采集圖像，應(yīng)用Image pro plus圖像分析軟件分析，計(jì)算平均光密度值，分析血管新生情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。不同組別之間采用方差分析比較，若方差齊，則使用LSD 法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，則使用Tamhane T2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠基本情況及CRT病理形態(tài)

大鼠置管后存活率為100%，置管成功率為100%，導(dǎo)管留置期間無導(dǎo)管脫出，無出血、感染、肺栓塞等并發(fā)癥。干預(yù)1 天后可觀察到各組CRT 形成趨于穩(wěn)定，血栓膠原蛋白成分增多，并可見新生的肉芽組織由血管壁向血栓內(nèi)生長(zhǎng)，將纖維蛋白等血栓成分逐漸溶解、吸收，血栓開始機(jī)化。隨著時(shí)間推移，可見血栓體內(nèi)部裂隙擴(kuò)大，新生管腔樣結(jié)構(gòu)形成，恢復(fù)部分再通。至28天后，CRT 對(duì)照組血栓內(nèi)部形成新的血管相互吻合再通，被阻塞的血管部分重建血流，其中CRT+COPP組及CRT+抗阻運(yùn)動(dòng)組接近完全再通，CRT+SnPP 組中管腔內(nèi)仍有紅細(xì)胞形成，僅部分再通（圖1）。

圖1 各組大鼠干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)血管HE染色（n=6，50×）

2.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血栓溶解率比較

各組血栓溶解率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加（表1）。其中，CRT+COPP組各時(shí)間點(diǎn)血栓溶解率均高于CRT對(duì)照組（P＜0.01），而CRT+SnPP組均低于CRT對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01）。CRT+抗阻運(yùn)動(dòng)組干預(yù)第28天血栓溶解率高于CRT對(duì)照組（P＜0.01），與CRT+COPP組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)血栓溶解率比較（n=6，%）

2.3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清HO-1、IL-6、IL-10 濃度比較

與CRT 對(duì)照組相比，CRT+COPP 組各時(shí)間點(diǎn)血清HO-1及IL-10含量上升、IL-6含量降低，CRT+SnPP組血清HO-1 及IL-10 含量降低、IL-6 含量上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；CRT+抗阻運(yùn)動(dòng)組第28天血清HO-1及IL-10升高，IL-6降低至與CRT對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而與CRT+COPP 組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清HO-1（A）、IL-6（B）、IL-10（C）濃度比較（n=6）

2.4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)HO-1 mRNA表達(dá)比較

與CRT 對(duì)照組相比，CRT+COPP 組各時(shí)間點(diǎn)HO-1mRNA 表達(dá)均顯著增加（P＜0.01）；CRT+SnPP 組各時(shí)間點(diǎn)HO-1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）；CRT+抗阻運(yùn)動(dòng)組第28天HO-1表達(dá)量升高至與CRT對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而與CRT+COPP 組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

圖3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)HO-1 mRNA表達(dá)情況（n=6）

2.5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)CD31表達(dá)比較

免疫組化結(jié)果顯示，CD31 表達(dá)于血管內(nèi)皮間隙。與CRT對(duì)照組比較，CRT+COPP組各時(shí)間點(diǎn)CD31表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；CRT+SnPP 組中CD31 表達(dá)顯著減少（P＜0.01）。CRT+抗阻運(yùn)動(dòng)組第28天CD31表達(dá)顯著高于CRT 對(duì)照組（P＜0.01），與CRT+COPP 組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 各組大鼠干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)免疫組化CD31染色（100×）（A）和各組大鼠干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)平均光密度值（B）（n=6）

3 討論

正常情況下，HO-1在大多數(shù)細(xì)胞組織內(nèi)呈低水平表達(dá)，但在多種氧化應(yīng)激和炎癥信號(hào)誘導(dǎo)下高表達(dá)，并發(fā)揮抗炎和抗氧化作用[15]。IL-6 是一種炎癥反應(yīng)因子，能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)；而IL-10作為一種抗炎因子，能夠抑制炎癥反應(yīng)和促炎因子的釋放[16]。HO-1 被IL-6高度誘導(dǎo)，而HO-1 負(fù)調(diào)控IL-6，這表明HO-1 和IL-6之間存在負(fù)反饋循環(huán)；而IL-10 和HO-1 通過正反饋環(huán)相互聯(lián)系，IL-10 誘導(dǎo)可促進(jìn)HO-1 高表達(dá)，從而可發(fā)揮其抗炎作用[17，18]。HO-1 具有保護(hù)血管的功能，可抑制血管中炎癥反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞使其免受氧化應(yīng)激損傷[19]。有研究證實(shí)HO-1 在血栓溶解再通過程中扮演著重要角色，與未敲除HO-1基因小鼠相比，敲除HO-1 基因小鼠血栓機(jī)化再通過程明顯受到抑制[20]。Gabre 等[21]發(fā)現(xiàn)深靜脈血栓（deep venous thrombosis，DVT）形成小鼠，注射活化蛋白C 可通過HO-1 依賴的機(jī)制顯著加速血栓溶解。此外，HO-1 還可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）高表達(dá)，從而促進(jìn)DVT溶解再通[22]。本研究顯示，COPP 和SnPP 能明顯影響HO-1 mRNA 的表達(dá)，同時(shí)，與CRT 對(duì)照組自然溶解過程相比，HO-1高表達(dá)的CRT+COPP組血栓溶解再通明顯加快，而抑制HO-1后，其血栓溶解再通速度明顯減慢，說明抗阻運(yùn)動(dòng)28 天后血栓溶解再通能起到與激動(dòng)劑一樣的效果，由此證明抗阻運(yùn)動(dòng)28 天可上調(diào)HO-1 表達(dá)并促進(jìn)CRT溶解再通。

運(yùn)動(dòng)應(yīng)激通過自身調(diào)節(jié)及HO-1 代謝產(chǎn)物對(duì)HO-1系統(tǒng)產(chǎn)生影響，研究顯示運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)與HO-1的表達(dá)密切相關(guān)[23]。我們前期發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管置入后改變血流的方向及速度，引起CRT 的發(fā)生，增加促炎細(xì)胞因子表達(dá)，導(dǎo)致HO-1 含量降低[24]。而抗阻運(yùn)動(dòng)可以改變血流切應(yīng)力，發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用，抑制炎癥反應(yīng)，從而改善血管內(nèi)皮的功能，減少CRT 形成[25]。前期研究發(fā)現(xiàn)CRT大鼠進(jìn)行8 周抗阻運(yùn)動(dòng)后，HO-1 表達(dá)增加，修復(fù)氧化應(yīng)激，從而改善血管內(nèi)皮功能，在一定程度上預(yù)防CRT形成[10]。據(jù)報(bào)道，在健康志愿者中，HO 活性隨著運(yùn)動(dòng)的增加而增加，循環(huán)血液中的HO-1mRNA和蛋白表達(dá)升高[26]。動(dòng)物研究同樣表明，運(yùn)動(dòng)可以增強(qiáng)心臟和血管平滑肌細(xì)胞中HO-1mRNA 的表達(dá)[27]。還有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)eCl3化學(xué)誘導(dǎo)小鼠動(dòng)脈損傷后，運(yùn)動(dòng)通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、基質(zhì)重塑和減少血管壁炎癥以及通過增加細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶活性來促進(jìn)血栓消退和血管壁重塑[28]。本研究顯示，抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)28天可上調(diào)HO-1并降低IL-6 水平，提高IL-10 水平，從而抑制炎癥反應(yīng)，加速CRT 溶解再通。同時(shí)，CRT+抗阻運(yùn)動(dòng)組大鼠運(yùn)動(dòng)28 天后CRT 溶解率與對(duì)照組相比增加18.30%。由此推測(cè)，運(yùn)動(dòng)可上調(diào)HO-1表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用，在一定程度上影響血栓溶解再通。

血栓溶解是一個(gè)復(fù)雜的過程，其過程與正常的傷口愈合過程大致相同，均伴隨炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及新生毛細(xì)血管的形成[29]。目前已證實(shí)新生血管對(duì)血栓溶解再通產(chǎn)生顯著影響，促進(jìn)血管新生可以加速血栓的溶解再通。血栓機(jī)化初期，血栓從血管壁回縮，血栓主體和靜脈壁內(nèi)膜之間形成內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)襯的口袋樣及裂縫結(jié)構(gòu)，形成新的血管腔相互融合并擴(kuò)大形成管道，逐漸恢復(fù)成血栓前狀態(tài)，使堵塞靜脈重新恢復(fù)血流[30]。如機(jī)體對(duì)血栓的吸收和溶解徹底，血管可完全再通，否則將出現(xiàn)血管狹窄或閉塞，引起血栓后綜合征（postthrombotic syndrome，PTS）的發(fā)生[31]。因此，促進(jìn)血栓的早期溶解和吸收有助于血栓的治療，減少PTS 的發(fā)生。作為新生血管標(biāo)志物，CD31存在于早期內(nèi)皮細(xì)胞的邊緣，在血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗血栓/抗炎表型中起重要作用[32]。本研究通過免疫組織化學(xué)CD31染色發(fā)現(xiàn)，抗阻運(yùn)動(dòng)28 天誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)可促進(jìn)CRT 溶解再通，其機(jī)制可能與其促進(jìn)新生血管形成有關(guān)。一項(xiàng)研究表明，HO-1 可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖動(dòng)員及遷移，并聚集至損傷區(qū)域向新生內(nèi)皮細(xì)胞分化，從而促進(jìn)血管修復(fù)及抗氧化應(yīng)激損傷能力，這可能是HO-1促進(jìn)血管新生的關(guān)鍵機(jī)制[33]。

綜上所述，抗阻運(yùn)動(dòng)、HO-1、抗炎、促血管新生、血栓溶解再通均存在相互關(guān)系?？棺柽\(yùn)動(dòng)作為一種生理刺激，可調(diào)節(jié)許多分子、信號(hào)通路，能明顯改善血管內(nèi)皮功能，修復(fù)血管內(nèi)皮損傷，減少血管炎癥。運(yùn)動(dòng)可能經(jīng)血流動(dòng)力學(xué)刺激介導(dǎo)HO-1生物學(xué)活性，從而發(fā)揮血管保護(hù)作用。而HO-1 作為機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)因子能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成活性，促進(jìn)新生血管形成，對(duì)多種血管源性損傷發(fā)揮保護(hù)作用。因此，本研究通過聚焦運(yùn)動(dòng)上調(diào)HO-1表達(dá)，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面表明抗阻運(yùn)動(dòng)加速CRT 溶解再通的安全性及有效性，并為臨床抗阻運(yùn)動(dòng)輔助治療CRT的實(shí)施提供有力證據(jù)及經(jīng)濟(jì)、科學(xué)、有效的輔助治療方案。

本研究也存在一定局限性，如未能運(yùn)用B 超對(duì)大鼠CRT溶解再通過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)及從其他分子信號(hào)通路驗(yàn)證血栓溶解再通機(jī)制，這些有待進(jìn)一步深入研究。

4 總結(jié)

抗阻運(yùn)動(dòng)28天可誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，發(fā)揮抗炎、促血管新生作用，最終加速CRT溶解再通。