李青松

（四川省綿陽市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)動物疫病預防控制中心，四川 綿陽 621000）

賈第蟲是一種最常見的寄生生物，可感染人類和多種動物［1］。根據(jù)宿主和形態(tài)學分類，賈第蟲被分為六個種，其中只有腸賈第蟲（又名藍氏賈第鞭毛蟲、十二指腸賈第蟲）可感染人類。腸賈第蟲的基因型復雜，根據(jù)遺傳學和表型，至少分為8 個集聚體（A～H）［2］。奶牛主要感染集聚體E，其次是集聚體A和B［3］。近年來許多對奶牛犢牛感染腸賈第蟲的相關(guān)研究顯示，奶牛犢牛斷奶前后腸賈第蟲的感染率存在差異，斷奶前后犢牛感染腸賈第蟲的基因型也有差異［4-14］。

本研究以成都部分地區(qū)（崇州、青白江、邛崍）奶牛場中的斷奶犢牛為研究對象，采用巢式PCR擴增腸賈第蟲β-賈第素（bg）基因、磷酸丙糖異構(gòu)酶（tpi）基因和谷氨酸脫氫酶（gdh）基因位點，確定感染率，并對陽性樣品進行集聚體鑒定。隨后基于三個位點擴增出的序列，對斷奶犢牛腸賈第蟲進行亞型分析，最后建立系統(tǒng)發(fā)育樹。旨在為奶牛場防治腸賈第蟲感染以及腸賈第蟲人獸共患病的監(jiān)測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Power Soil?DNA Isolation Kit（糞便DNA提取試劑盒），2×Taq PCR Master Mix，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 樣品采集 在成都市崇州、青白江、邛崍的三個奶牛場采集圈養(yǎng)斷奶犢牛（2～12月齡）的新鮮糞便共計104份，每份糞樣約50 g，置于潔凈塑料采樣袋中，做好標記、編號，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品處理 取每份糞便樣品20 g，放入50 mL小燒杯中，加入適量蒸餾水，攪拌溶解并過濾。將濾液轉(zhuǎn)移到50 mL 離心管內(nèi)，以3 000 r/min 離心5 min，緩慢棄去上清液，保留沉淀物，一部分沉淀物直接用于DNA提取，另一部分沉淀物儲存于2.5%重鉻酸鉀，并于4 ℃冰箱中保存。

1.4 DNA提取 樣品處理后得到含糞便及卵囊的沉淀物，按照Power Soil?DNA Isolation Kit 說明書提取樣本DNA。提取的DNA 置-20 ℃環(huán)境中保存。

1.5 PCR擴增 基于β-賈第素（bg）基因位點對所有樣品進行檢測，引物設(shè)計及擴增條件參照Sulaiman 等［15］的報道。基于β-賈第素基因鑒定出的陽性樣品，使用磷酸丙糖異構(gòu)酶（tpi）、谷氨酸脫氫酶（gdh）基因位點進行基因亞型鑒定，引物設(shè)計及擴增條件參照Appelbee 等［16］和Cacciò等［17］的報道。PCR反應(yīng)體系均為25 μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、去離子水8.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 2 μL（第1輪PCR 產(chǎn)物為第2 輪PCR 的模板）。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測第2 套巢式PCR 產(chǎn)物，置于凝膠成像儀內(nèi)，使用Image Lab Version 3.0 軟件成像拍照。

1.6 測序及分析 將PCR 陽性產(chǎn)物進行雙向測序，通過DNAMAN Version 8.0 軟件進行拼接。將測序結(jié)果在GenBank中經(jīng)BLAST比對校正后，使用MEGA 7的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 巢式PCR擴增結(jié)果 基于巢氏PCR擴增β-賈第素（bg）基因位點、磷酸丙糖異構(gòu)酶（tpi）基因位點、谷氨酸脫氫酶（gdh）基因位點的目的基因條帶長度分別為511 bp、532 bp、520 bp。

2.2 斷奶犢牛腸賈第蟲感染情況 所采集的104 份樣品中共有42 份鑒定為腸賈第蟲陽性，總感染率為40.38%（42/104），其中崇州、青白江、邛崍三個奶牛場的感染率分別為46.88%（15/32）、41.94%（13/31）、34.15%（14/41），三個奶牛場皆發(fā)現(xiàn)了集聚體E和集聚體A感染。具體感染情況見表1。

表1 斷奶犢牛腸賈第蟲感染情況統(tǒng)計

2.3 bg、tpi和gdh基因序列分析 經(jīng)過多次巢氏PCR擴增bg、tpi、gdh三個位點，分別擴增出11、8、9 條基因序列，分別發(fā)現(xiàn)6 種基因亞型（A1、E1、E2、E9、E11、E13），5 種基因亞型（A1、E3、E6、E15、E22），6 種基因亞型（A1、E1、E8、E10、E12、E13）?；蛐秃突騺喰蜋z測結(jié)果見表2。

表2 基于bg、gdh和tpi位點的腸賈第蟲基因型和基因亞型檢測結(jié)果

基于bg 基因位點，11 條序列中以A1（n＝2）和E1（n＝2）基因亞型為主。形成的6 種基因亞型在NCBI的序列登錄號分別為A1（KR051222）、E1（KT922247）、E2（KT922248）、E9（KY769091）、E11（KY769089）、E13（MF671880），據(jù)此構(gòu)建出bg基因位點的系統(tǒng)進化發(fā)育樹。

基于tpi基因位點，8條序列中以A1（n＝3）和E3（n＝2）基因亞型為主。形成的5種基因亞型在NCBI 的序列登錄號分別為A1（KJ888991）、E3（KT922259）、E6（KY432850）、E15（KY432848）、E22（KY710748），據(jù)此構(gòu)建出tpi基因位點的系統(tǒng)進化發(fā)育樹。

基于gdh基因位點，9條序列中以A1（n＝2）、E1（n＝2）和E10（n＝2）基因亞型為主。形成的6種基因亞型在NCBI 的序列登錄號分別為A1（KT922255）、E1（KY769096）、E8（KT369785）、E10（KT698971）、E12（KY432840）、E13（KY432838），據(jù)此構(gòu)建出gdh基因位點的系統(tǒng)進化發(fā)育樹。

3 結(jié)論與分析

3.1 腸賈第蟲感染情況 我國斷奶犢牛感染腸賈第蟲的情況非常普遍，但感染率多數(shù)偏低。通過多基因位點分析結(jié)果可知，本研究中斷奶犢牛腸賈第蟲的總感染率為40.38%（42/104），其中崇州、青白江、邛崍三個奶牛場的感染率分別為46.88%（15/32）、41.94%（13/31）、34.15%（14/41），高于廣東（0.94%）［7-8］、吉林（4.39%）［9］、寧夏（2.53%）［9］、江蘇（7.48%）［10］、河北和天津（3.48%）［11］、河南（2.42%）［12］、陜西（17.54%）［13］、新疆（16.60%）［14］。表明這些場中斷奶犢牛感染腸賈第蟲的情況較為嚴重，可能是不同氣候生態(tài)條件、管理水平等因素綜合作用的結(jié)果。提示成都地區(qū)奶牛場中腸賈第蟲可能是一種常見的病原體，應(yīng)當引起重視。

3.2 腸賈第蟲基因型情況 本研究在bg、tpi、gdh三個基因位點分別擴增出了11、8、9條基因序列，分別形成6 種基因亞型（A1、E1、E2、E9、E11、E13），5 種基因亞型（A1、E3、E6、E15、E22），6 種基因亞型（A1、E1、E8、E10、E12、E13），均為已知亞型，且主要為集聚體E，其次為集聚體A，此項結(jié)果與國內(nèi)陜西［13］、新疆［14］地區(qū)的研究結(jié)果一致，故成都地區(qū)的奶牛場可參照這些地區(qū)的防控方法防治該病。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析，三個奶牛場中斷奶犢牛腸賈第蟲集聚體E 的遺傳種類多樣，可能與集聚體的遺傳重組有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)的所有集聚體A均為A1亞型，這種亞型主要在動物身上發(fā)現(xiàn)，但也可以感染人類，這提示成都地區(qū)奶牛場腸賈第蟲感染具有人獸共患風險，應(yīng)當引起高度重視?！?/p>