鄭怡雯 周永佳 羅夢(mèng)秋 劉金夢(mèng) 梁嬋嬋 王巧真 陳燕春 王箐

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2神經(jīng)疾病與再生修復(fù)實(shí)驗(yàn)室；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室)

肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，病變主要累及脊髓、大腦皮質(zhì)等部位的神經(jīng)元，表現(xiàn)為進(jìn)行性的肌力下降和肌萎縮，最后導(dǎo)致呼吸循環(huán)系統(tǒng)器官衰竭而死亡〔1〕。ALS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前無有效治療方法。Bar家族同源域因子(Barx)2，可調(diào)控細(xì)胞黏附分子表達(dá)，影響細(xì)胞在不同環(huán)境中的分化，在細(xì)胞黏附和細(xì)胞重構(gòu)中發(fā)揮重要作用〔2〕。有研究表明Barx2是胚胎和成人成肌細(xì)胞的新標(biāo)志物，是人出生后生長(zhǎng)和修復(fù)所必需的指標(biāo)〔3〕。有相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)Barx2參與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑〔2,4〕。軸向抑制蛋白(Axin)2是一種主要的支架蛋白，是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子〔5,6〕。Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑在ALS發(fā)病中發(fā)揮重要作用，該信號(hào)傳導(dǎo)途徑異常與ALS發(fā)病緊密相關(guān)〔7〕。但目前關(guān)于Barx2和Axin2在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓內(nèi)的表達(dá)變化尚未闡明。本研究選用SOD1-G93A基因突變的ALS轉(zhuǎn)基因小鼠，應(yīng)用分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)等方法檢測(cè)Barx2和Axin2在ALS小鼠脊髓內(nèi)的表達(dá)情況，探討其與ALS發(fā)病的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型(WT)及突變型超氧化物歧化酶(SOD)1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠即ALS轉(zhuǎn)基因小鼠，購自Jackson實(shí)驗(yàn)室(合格證編號(hào)為3100079226)。參照Chen等〔7,8〕方法嚴(yán)格按轉(zhuǎn)基因鼠飼養(yǎng)條件進(jìn)行飼養(yǎng)，將4周齡小鼠剪尾約0.5 cm，進(jìn)行DNA檢測(cè)，基因擴(kuò)增檢測(cè)鑒別ALS小鼠和WT小鼠。將33只成年ALS小鼠按照不同發(fā)病時(shí)期分為早(95 d)、中(108 d)、晚(122 d)期ALS組各11只，并且每組配以同窩WT小鼠作為對(duì)比參照，分別為早(95 d)、中(108 d)、晚(122 d)期WT組各11只。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器 小鼠源抗體Barx2購自Santa Cruz Blotechnology公司，兔源抗體Axin2購自Arigo Biolaboratories公司，小鼠源性和兔源性β微管蛋白(β-tubulin)Ⅲ抗體分別購自R&D公司和Abcam公司；小鼠源性 GAPDH 抗體購自Proteintech Group公司。羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)酶標(biāo)二抗、羊抗小鼠HRP酶標(biāo)二抗、驢抗小鼠Alexa fluor 488及羊抗兔Cy3熒光二抗試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Western印跡增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液購自Thermo Fisher Scientific公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自Millipore公司。Barx2、Axin2和內(nèi)參照β-actin引物均購自Samgon Biotech公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Toyobo公司。

1.3標(biāo)本制備 按照前期實(shí)驗(yàn)方法取發(fā)病不同時(shí)期ALS轉(zhuǎn)基因小鼠和WT小鼠脊髓〔7,8〕，其中一部分組織研磨提取RNA用于反轉(zhuǎn)錄(RT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，一部分組織超聲震碎提取蛋白用于Western印跡檢測(cè)；部分ALS小鼠和WT小鼠心臟灌注固定后制備脊髓冰凍切片，用于免疫熒光技術(shù)檢測(cè)。

1.4RT-PCR檢測(cè) 參照文獻(xiàn)〔7〕實(shí)驗(yàn)方法提取RNA和反轉(zhuǎn)錄cDNA。引物序列為：Barx2：上游GATGGTCCTTAAAGGTGGACAG，下游TGGGCTCC-TGGGTATCACAG；β-actin：上游GAGCTACGAGCTGCCTGACG，下游CCTAGAAGCATTTGCGGTGG；Axin2：上游ATGAGTAGCGCCGTGTTAGTG，下游GGG-CATAGGTTTGGTGGACT；以cDNA為模版分別進(jìn)行Barx2基因和Axin2基因擴(kuò)增，用β-actin作為內(nèi)參照。反應(yīng)體系如下：2×Master Mix 10 μl，目的基因上、下游引物各0.5 μl，β-actin內(nèi)參照基因上、下游引物各0.5 μl，cDNA 模板1 μl，用無菌水加至總體積為20 μl。在PCR儀中94℃ 3 min預(yù)變性，94℃ 30 s變性、58℃ 30 s退火和72℃ 30 s 延伸依次循環(huán)30次，最后1個(gè)循環(huán)延伸72℃ 3 min后冷卻至4℃。瓊脂糖凝膠電泳，將RT-PCR所得圖像應(yīng)用IPP6.0軟件測(cè)量分析。

1.5Western印跡檢測(cè) 參照文獻(xiàn)〔7〕實(shí)驗(yàn)方法提取脊髓組織并進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜。將完成轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放置在5%脫脂牛奶內(nèi)進(jìn)行抗原封閉2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗PVDF膜，裁膜后孵育一抗：小鼠Barx2(1∶500)，小鼠GAPDH(1∶2 000)，兔 Axin2(1∶1 000)。其余步驟參照Chen等〔8〕實(shí)驗(yàn)方法將結(jié)果應(yīng)用IPP6.0軟件分析Barx2、Axin2蛋白和內(nèi)參照GAPDH蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6免疫熒光標(biāo)記 將冰凍切片晾干，PBS沖洗后滴加0.3% Triton X-100，置于暗盒內(nèi)常溫放置10～15 min。PBS沖洗，滴加正常羊血清封閉抗原，37℃孵育30 min；取出后甩掉羊血清，分別滴加稀釋好的兔 Axin2(1∶80)與小鼠β-tubulinⅢ(1∶200)混合一抗工作液及小鼠Barx2(1∶100)與兔β-tubulinⅢ(1∶100)混合一抗工作液，置于暗盒中4℃過夜。次日，PBS中漂洗后滴加驢抗小鼠Alexa fluor 488(1∶400)和羊抗兔Cy3(1∶400)混合二抗，37℃ 孵育40 min，PBS清洗，甩干；Hoechst33258標(biāo)記細(xì)胞核，37℃溫箱中孵育15 min后，PBS沖洗。滴加熒光防淬滅劑，封片，應(yīng)用Olympus 熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組脊髓內(nèi)Barx2 mRNA及蛋白表達(dá)比較 RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與早、中、晚期WT組(100.2±9.8、98.3±8.3、97.7±15.1)相比，早、中、晚期ALS組脊髓內(nèi)Barx2 mRNA表達(dá)水平(39.3±5.5、54.9±5.3、67.7±4.2)均明顯下降(P<0.05)。Western印跡結(jié)果顯示，與早、中、晚期WT組(106.1±12.2、97.2±15.6、91.0±11.6)相比，早、中、晚期ALS組Barx2蛋白表達(dá)水平(66.6±10.4、32.8±5.1、65.1±8.4)均顯著下降(P<0.05)，見圖1、圖2。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在晚期ALS組及WT組脊髓中均可檢測(cè)到 Barx2陽性細(xì)胞，且與β-tubulinⅢ標(biāo)記的神經(jīng)元共表達(dá)，陽性細(xì)胞集中在灰質(zhì)前角，該處是病變損害所在部位。與晚期WT組相比，晚期ALS組脊髓中Barx2免疫陽性減弱，與Western印跡檢測(cè)結(jié)果一致，見圖3。

1～6：早期WT組，早期ALS組，中期WT組，中期ALS組，晚期WT組，晚期ALS組；圖2、4、5同圖1 RT-PCR檢測(cè)脊髓中Barx2 mRNA表達(dá)

圖2 Western印跡檢測(cè)各組脊髓中Barx2蛋白水平表達(dá)

2.2各組脊髓內(nèi)Axin2 mRNA及蛋白表達(dá)比較 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與早、中、晚期WT組(91.5±14.9、102.0±2.7、100.3±10.0)相比，早、中、晚期ALS組脊髓中Axin2 mRNA表達(dá)(24.9±3.9、71.0±13.2、68.7±8.3)明顯降低(P<0.05)。Western印跡檢測(cè)結(jié)果表明，與早、中、晚期WT組(78.3±6.3、86.2±8.8、76.7±2.9)相比，早、中、晚期ALS組Axin2蛋白表達(dá)(47.0±2.7、34.0±6.4、34.2±0.8)顯著下降(P<0.05)，見圖4、圖5。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在晚期ALS組及WT組脊髓中陽性細(xì)胞集中在灰質(zhì)前角，Axin2陽性細(xì)胞均與β-tubulinⅢ標(biāo)記的神經(jīng)元共表達(dá)。ALS組脊髓內(nèi)Axin2免疫陽性反應(yīng)較WT組減弱，與Western印跡檢測(cè)結(jié)果一致，見圖6。

圖3 免疫熒光檢測(cè)晚期WT及ALS組脊髓中Barx2的表達(dá)(×200)

圖4 RT-PCR檢測(cè)各組脊髓中Axin2 mRNA表達(dá)

圖5 Western印跡檢測(cè)各組脊髓中Axin2蛋白表達(dá)

圖6 免疫熒光檢測(cè)晚期WT及ALS組脊髓中Axin2的表達(dá)(×200)

3 討 論

ALS是一種影響上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退行性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種信號(hào)通路與多種調(diào)控因子，至今仍沒有很好的治療方法，進(jìn)一步探討ALS的發(fā)病機(jī)制與病變中的改變對(duì)于其治療尤為重要。

Barx2是Bar類的一種新的同源盒基因，在發(fā)育過程中表達(dá)于神經(jīng)和顱面結(jié)構(gòu)中。有絲分裂后神經(jīng)元所在的外套層、底板和背根神經(jīng)節(jié)中，Barx2顯著表達(dá)〔9〕。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過程中Barx2表現(xiàn)出與黏附分子(CAM)表達(dá)模式重疊的動(dòng)態(tài)表達(dá)，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞(N)-CAM啟動(dòng)子的區(qū)域〔10〕。有研究表明，Barx2和轉(zhuǎn)錄因子(Pax)6與HPD(L1基因調(diào)控區(qū)域中的一種DNA元素)特異結(jié)合在激活N-CAML1表達(dá)有重要作用，HPD通過同源域蛋白和Pax蛋白調(diào)控神經(jīng)組織L1的表達(dá)，其中HPD核內(nèi)的ATTA序列是與同源域蛋白Barx2結(jié)合所必需的〔11〕，提示Barx2在神經(jīng)的再生與發(fā)育中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，Chen等〔4〕發(fā)現(xiàn)Barx2能抑制細(xì)胞增殖、遷移，并通過有氧糖酵解抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑。Zhuang等〔12〕發(fā)現(xiàn)Barx2是Wnt信號(hào)通路效應(yīng)復(fù)合物新的組分，其在Wnt信號(hào)通路調(diào)控中的拮抗作用可能有助于介導(dǎo)成肌細(xì)胞從增殖向分化轉(zhuǎn)變。干擾Barx2基因能導(dǎo)致Wnt靶基因表達(dá)異常。有研究〔7〕證實(shí)，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路即Wnt/β-catenin信號(hào)途徑與ALS發(fā)病密切相關(guān)，在ALS發(fā)病過程中，Wnt信號(hào)通路被激活。本研究中Barx2降低導(dǎo)致其對(duì)Wnt信號(hào)通路拮抗作用減弱，與以往研究〔7〕結(jié)果相一致。

Axin2已經(jīng)被公認(rèn)為是抑制糖原合酶激酶(GSK)3β介導(dǎo)的Snail1降解的負(fù)調(diào)控因子，是E-鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制因子，Axin2還可通過β-catenin降解來阻止Wnt信號(hào)傳導(dǎo)〔13〕。Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)由3種多蛋白復(fù)合物控制，其中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的是β-catenin破壞復(fù)合物，其核心成分包括Axin支架蛋白、腫瘤抑制基因(APC)和2種絲氨酸蘇氨酸激酶〔GSK3和酪蛋白激酶(CK)1〕，該復(fù)合物在沒有Wnt信號(hào)的情況下具有活性，可磷酸化β-catenin的N-末端中的特定殘基，標(biāo)記該Wnt效應(yīng)子專用于泛素化和蛋白酶體降解，這確定了信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)閉狀態(tài)〔14〕。以往研究〔15〕發(fā)現(xiàn)CK1ε在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層中隨病程進(jìn)展而升高，表明CK1ε與ALS發(fā)病有密切聯(lián)系，推測(cè)同為復(fù)合物核心成分的Axin2可能在ALS中也有重要作用。本研究結(jié)果表明ALS小鼠脊髓中Axin2表達(dá)下調(diào)，減弱了對(duì)Wnt信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)從而達(dá)到對(duì)Wnt信號(hào)通路的激活作用。

有研究〔16〕表明，Barx2可通過與轉(zhuǎn)錄因子(TCF)/β-catenin復(fù)合物的相互作用促進(jìn)Axin2表達(dá)，終止對(duì)Wnt信號(hào)的應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示，在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病過程中，Barx2和Axin2表達(dá)均下調(diào)，推測(cè)Barx2可能通過調(diào)控Axin2影響Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)參與ALS發(fā)病，但是Barx2和Axin2的關(guān)系及通過何種方式調(diào)控Wnt信號(hào)通路影響病變過程有待于繼續(xù)深入研究，詳細(xì)的機(jī)制也有待于通過離體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明。