趙鵬鵬 郄麗萍 馬婕,* 趙國忠 米貫東 任風芝 姜明星

(1 華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術研究中心，石家莊 050015；2 華北制藥集團華勝有限公司，石家莊 050015)

替考拉寧是與臨床相關的糖肽類抗生素，由游動放線菌產生，是5個化學結構相似化合物(T-A2-1、T-A2-2、T-A2-3、T-A2-4和T-A2-5)的混合物，其中，T-A2-2是主要有效成分。替考拉寧是治療成人和嬰兒的多重耐藥革蘭陽性病原體引起的嚴重感染的一線療法[1]。同時也是目前為數不多的臨床有效活性藥物之一，其未來具有廣闊的應用前景。但是目前存在著產量低等問題，限制了應用。

微生物產生次級代謝產物的能力主要由微生物的遺傳特性決定，遺傳特性可以通過誘變來改變。目前誘變的手段有很多，如熱處理、紫外照射、常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)等。已有大量關于熱處理、紫外照射等處理技術的研究[2]，但是關于替考拉寧產生菌的誘變處理應用相對較少，而且處理效果并不理想。因此，我們采用了ARTP誘變技術來進行菌種選育。

ARTP誘變技術是近年來新興的一種具有高效率特點的誘變手段，尤其是在微生物菌種改良選育領域。該技術主要是利用高濃度的活性粒子均勻地作用于微生物，從而改變細胞膜或細胞壁的結構并引起基因損傷，誘發(fā)生物細胞啟動SOS修復機制，最終導致微生物基因序列及其代謝網絡發(fā)生相應變化[3-4]。已有相關研究利用ARTP誘變技術來進行菌種選育工作，并且取得了一定的效果[5-6]。但是有關替考拉寧產生菌株方面的報道較少。

本研究利用ARTP誘變技術來進行替考拉寧產生菌株的選育工作，并從轉速、接種量、溫度和pH等因素進行了發(fā)酵工藝優(yōu)化。最后，成功篩選得到了一株新的高產突變株，形成了一個新的發(fā)酵工藝，顯著提高了替考拉寧的產量。這表明，ARTP誘變技術在替考拉寧產生菌菌種誘變方面擁有較大的應用潛力，發(fā)酵工藝的優(yōu)化對實際工業(yè)化生產具有指導性意義。

1 儀器與試藥

超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；ARTP-ⅡS型誘變育種儀(無錫源清天木生物科技有限公司)；DELTA 320型pH計(Mettler-Toledo有限公司)；Pico型高速離心機(賽默飛世爾科技有限公司)；LC-2030C型高效液相色譜儀(島津有限公司)。

替考拉寧標準樣品(純度為92.28%)。乙腈和甲醇為色譜級，其他試劑均為分析純，水為去離子水。

替考拉寧產生菌游動放線菌(Actinoplanes teichomycetics)T19，本實驗室保藏。

2 試驗方法

2.1 培養(yǎng)基的配制[7]

固體培養(yǎng)基(平板、斜面培養(yǎng)基)：精密稱量可溶性淀粉20 g，K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 1 g，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，瓊脂20 g，置于1000 mL量瓶中，加水溶解并定容，用6 mol/L的氫氧化鈉溶液調至pH為7.2。

種子培養(yǎng)基：精密稱量淀粉40 g，黃豆粉20 g，酵母粉5 g，蛋白胨5 g，NaCl 4 g，MgSO40.5 g，(NH4)2SO42 g，CaCO35 g，置于1000 mL量瓶中，加水溶解并定容，用6 mol/L的氫氧化鈉溶液調至pH為7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：精準稱量淀粉40 g，葡萄糖20 g，NH4Cl 3 g，NaNO32 g，黃豆粉20 g，MgSO40.5 g，玉米油5 g，CaCO35 g，置于1000 mL量瓶中，加水溶解并定容，用6 mol/L的氫氧化鈉溶液調至pH為7.2。

2.2 培養(yǎng)方法

固體培養(yǎng)：將保存的菌種T19(甘油管)用無菌水稀釋后，涂布于平板或斜面培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)室，培養(yǎng)7 d。

種子培養(yǎng)：從成熟斜面培養(yǎng)基挖塊(1 cm×0.5 cm)，轉接到裝液量為30 mL的250 mL三角瓶中，置于28℃培養(yǎng)室，搖床轉速為220 r/min，培養(yǎng)2 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)2 d的種子液以10%的接種量轉接到裝液量為40 mL的250 mL三角瓶中，搖床轉速為220 r/min，培養(yǎng)7 d。

單孢子懸液的制備：取生長狀態(tài)良好的T19新鮮斜面一支，加入10 mL無菌生理鹽水，用接種針刮下，玻璃珠打散，過濾，制成單孢子懸液。

2.3 抗性篩選濃度的確定

將出發(fā)菌株的單孢子懸液分別涂布于不同濃度(1、2、4、6和8 mg/mL)替考拉寧平板培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)室內，培養(yǎng)10 d，觀察平板上菌落的生長狀況，確定替考拉寧游動放線菌抗自身代謝產物替考拉寧的最小抑菌濃度。

2.4 ARTP誘變方法

取10 μL菌懸液滴加在無菌的不銹鋼載片上，將載片放于誘變育種儀中，按照一定的時間進行照射處理，照射間距為2 nm。設置誘變功率為100 W，氣流量為10 SLM。設置不同的處理時間分別為10、20、30、40、50、60、70、80和90 s。統(tǒng)計致死率、正突變率和負突變率，從而確定出最佳的誘變條件。

致死率=(未經誘變處理菌落數-經誘變處理菌落數)/未經誘變處理菌落數×100%。

正突變率=相對效價大于110%的菌落數/突變菌落數×100%。

負突變率=相對效價小于90%的菌落數/突變菌落數×100%。

2.5 遺傳穩(wěn)定性試驗

將突變高產替考拉寧菌株連續(xù)傳代5次，測定每一代突變菌株產替考拉寧的能力，從而驗證突變菌株生產性能的穩(wěn)定性。

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

以誘變后產量最高的菌株為實驗菌株，對原始發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。

轉速：考察不同轉速(200、210、220、230和240 r/min)對替考拉寧產量的影響。

接種量：考察不同接種量(2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%和15%)對替考拉寧產量的影響。

溫度：考察不同溫度(24℃、26℃、28℃、32℃和34℃)對替考拉寧產量的影響。

pH：考察不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5)對替考拉寧產量的影響。

2.7 發(fā)酵液的效價測定

發(fā)酵液的效價測定參考已有研究[8]。取發(fā)酵液3 mL，與乙醇以1:1(V:V)混勻，靜置1 h，3000 r/min離心10 min，取上清液，進行HPLC分析。

2.8 分析條件

HPLC檢測：C18柱(4.0 mm×250 mm，5 μm)；A相0.02 mol/L乙酸銨，B相色譜級乙腈，梯度洗脫(條件見表1)；檢測波長254 nm，進樣溫度40 ℃，進樣量20 μL；流速1 mL/min；tR7.3 min，tc14.6 min。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Gradiet elution condition

3 結果與討論

3.1 替考拉寧抗性篩選濃度的確定

為了確定替考拉寧的抗性篩選濃度，在替考拉寧濃度為1～8 mg/mL范圍內的平板上，觀察T19菌落生長狀況，發(fā)現菌株在1和2 mg/mL的替考拉寧抗性平板上生長狀態(tài)良好，在4 mg/mL替考拉寧抗性平板上呈現微弱生長的狀態(tài)，在6 mg/mL替考拉寧抗性平板上菌落完全不生長。這表明菌株T19的耐自身代謝產物替考拉寧濃度低于6 mg/mL，從而確定替考拉寧抗性篩選濃度為6 mg/mL，這與已有相關研究一致[9]。

3.2 ARTP處理時間的確定

為了確定最佳的ARTP處理時間，在固體平板培養(yǎng)基上涂布經ARTP誘變處理不同時間的菌懸液，在28℃培養(yǎng)室內培養(yǎng)7 d，以未誘變處理的菌懸液為對照，搖瓶篩選ARTP誘變處理不同時間的菌落，計算致死率和突變率，結果見圖1。

由圖1可知，隨著ARTP誘變處理時間的延長，菌株T19的致死率逐漸升高，在90 s以后，致死率增加速率減慢；正突變率隨著處理時間的延長呈現出先升高后降低的趨勢，在90 s時達到最高值(18.4%)；負突變率隨著處理時間的延長呈現逐漸上升的趨勢，在90 s以后，負突變率趨于平緩；綜合考慮，我們確定最佳ARTP誘變處理時間為90 s。

3.3 誘變菌株搖瓶篩選

以T19菌株為出發(fā)菌株，將經ARTP處理90 s后的孢子液混勻后，梯度稀釋涂布于含6 mg/mL替考拉寧平板上，挑選66株單菌落進行發(fā)酵生產替考拉寧效價分析，以出發(fā)菌株相對效價為100，計算突變株的相對效價，結果如表2所示，17株為正突變菌株(相對效價在110以上)，約占28.8%；35株為未突變菌株(相對效價在90～110)，約占54.5%；14株為負突變菌株(相對效價在90以下)，約占16.7%。正突變率較之前的18.4%高出了10.4%，這說明抗性篩選在一定程度上降低了非正突變率菌株的比例。

表2 替考拉寧抗性突變株篩選結果Tab.2 Screening results of teicoplanin-resistant mutants

通過多次復篩之后，有4株抗性突變菌株顯示出了很好的產替考拉寧能力，其發(fā)酵效價超過原始菌株T19的20%，且比較穩(wěn)定，其中T190226-2的發(fā)酵的相對效價最高，達到142%，為出發(fā)菌株T19的1.42倍，見表3和圖2。

表3 4株高產突變菌株的搖瓶發(fā)酵情況Tab.3 Shaking flask fermentation conditions of four highyielding mutant strains

3.4 突變菌株T190226-2的遺傳穩(wěn)定性考察

菌種的傳代穩(wěn)定性是決定其能否實現工業(yè)化生產的重要因素。采用斜面?zhèn)鞔u瓶驗證的方法，考察經過誘變和抗性篩選得到的這一株新的突變菌株T190226-2的傳代穩(wěn)定性。連續(xù)傳代5代，測定每一代菌株的相對效價，結果由圖3所示。從圖3中可以看出，高產菌株T190226-2經穩(wěn)定性傳代檢測，在第五代時相對效價(95.4%)稍有下降。由此可以表明，高產菌株T190226-2具有穩(wěn)定的遺傳特性。

3.5 誘變前后菌落形態(tài)變化

經過誘變篩選后，菌株內部的基因會發(fā)生一定的改變，從而導致其性狀的一些改變。如圖4所示，突變菌株與出發(fā)菌株相比，在形態(tài)上已經有了顯著的差異，在固體培養(yǎng)基上，出發(fā)菌株經培養(yǎng)后，顏色為橙色，褶皺較多；突變菌株的形態(tài)與出發(fā)菌株稍有差異，顏色為肉粉色，褶皺相對較少。這一新突變菌株也是首次報道。突變菌株的生長形態(tài)發(fā)生了一定的變化，表明經過誘變及抗性篩選，菌絲內部基因可能發(fā)生了一定的變化，具體發(fā)生變化的基因還需進一步驗證。

3.6 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

在搖瓶實驗中，通過對轉速、接種量、溫度和pH等因素的考察，確定最佳培養(yǎng)條件。結果如圖5所示。

(1)轉速對發(fā)酵效價的影響：研究了不同轉速(200、210、220、230、240 r/min)對菌株T190226-2發(fā)酵的影響。如圖5a所示，隨著轉速的增加，相對效價呈現出先增長和下降的趨勢，在轉速為220 r/min時，發(fā)酵的相對效價最高。有研究表明[10]，微生物發(fā)酵過程中所需的溶氧量各有差異，高轉速可以增加發(fā)酵液中的溶解氧含量。搖瓶實驗結果表明，菌株T190226-2在發(fā)酵過程中對溶氧的需求是有一定限度的。

(2)接種量對發(fā)酵效價的影響：研究了不同接種量(2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%和15%)對菌株T190226-2發(fā)酵的影響。接種量對微生物的發(fā)酵有著重要的影響，接種量的大小也受多個因素影響，包括菌種類別、發(fā)酵條件和種子液生長狀態(tài)。如圖5b所示，隨著接種量的增加，菌株T190226-2發(fā)酵的相對效價呈現出先增高后降低的趨勢，接種量為7.5%時，相對效價達到最高值(165%)。這表明，接種量過小或過大都會影響微生物的正常生長代謝，接種量過小會引起菌體生長緩慢，無法得到飽和的菌體密度，進而影響替考拉寧的產生；接種量過大會過早可能會引起營養(yǎng)物質匱乏，不利于次級代謝期替考拉寧的產生。

(3)溫度對發(fā)酵效價的影響：研究了不同溫度(24℃、26℃、28℃、30℃和32℃)對菌株T190226-2發(fā)酵的影響。從圖5c中可以看出，溫度對微生物的生長發(fā)育有著重要影響[11]，隨著溫度的升高，菌株T190226-2發(fā)酵的相對效價先增加后降低，在28℃時達到最大值。這表明菌株T190226-2具有嗜溫性，溫度過高會對菌株生長和替考拉寧生成產生負面影響。同時適宜的溫度，也能降低發(fā)酵過程中發(fā)酵液的蒸發(fā)。

(4)pH對發(fā)酵效價的影響：初始pH對微生物發(fā)酵有著重要的影響。研究了不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5)對菌株T190226-2發(fā)酵的影響。如圖5d所示，隨著pH的升高，替考拉寧的相對效價先增加后減少，在pH為6.5時，替考拉寧的相對效價達到最大值(180%)。這表明，pH過高或過低都會影響菌株的正常生長發(fā)育。

4 結論

以替考拉寧產生菌游動放線菌T19為出發(fā)菌株，通過ARTP誘變以及抗性選育等手段對替考拉寧產生菌T19進行了遺傳選育研究，得到了一株新的高產突變菌株T190226-2，并且具有較好的遺傳穩(wěn)定性，替考拉寧的效價水平為出發(fā)菌株的142%。通過發(fā)酵條件的優(yōu)化，包括轉速、接種量、溫度和pH等因素的考察，確定了最優(yōu)的發(fā)酵條件：轉速為220 r/min，接種量為7.5%，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為28℃，初始pH為6.5，替考拉寧的最高發(fā)酵相對效價可達180%，較出發(fā)菌株提高了80%。這表明ARTP技術可以有效用于替考拉寧產生菌游動放線菌的選育；同時，對新菌種優(yōu)化后的發(fā)酵工藝，可大幅度提高替考拉寧的產量，對其工業(yè)化生產有重要的意義。