白 云，鐘蘭萍，張婷婷，吳月蓉，李 蕾

（云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650032）

在輔助生殖技術(shù)中，胚胎的質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性這2 個因素類似于“種子”和“土壤”的關(guān)系，是妊娠成功的關(guān)鍵因素。隨著體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization -embryo transfer，IVF）中實驗室技術(shù)的完善以及植入前遺傳學(xué)檢測技術(shù)（preimplantation genetic testing，PGT）的快速發(fā)展，目前在優(yōu)質(zhì)胚胎篩選方面已有較大進(jìn)展，但是仍有一部分患者依然面臨反復(fù)的優(yōu)質(zhì)胚胎無法成功植入（repeated implantation failure，RIF）的棘手狀況。決定成功妊娠的另一重要因素子宮內(nèi)膜容受性受到越來越多關(guān)注，子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜接受胚胎植入的能力，也表示內(nèi)膜處于的一種狀態(tài)。一般認(rèn)為在規(guī)律的月經(jīng)周期中，只有在周期的第20～24 天或黃體生成素峰（luteinizing hormone，LH）后第7 天（LH+7）或出現(xiàn)孕激素升高后5 d（P+5）子宮內(nèi)膜具備對胚胎的接受能力[1]。因此，常把這個時期形象地稱為胚胎著床的“窗口期”，顧名思義其僅在短期內(nèi)開放，之后及時關(guān)閉胚胎便難以植入。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)既往認(rèn)為的種植窗恒定并非在所有患者中都成立，而表現(xiàn)為種植窗提前退后或縮短，隨著以高通量測序技術(shù)為基礎(chǔ)的基因轉(zhuǎn)錄組分析、全基因組關(guān)聯(lián)研究等現(xiàn)代分子基因診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)所得的子宮內(nèi)膜容受性檢測（endometrial receptivity test，ERT）技術(shù)隨之誕生[2]。ERT 技術(shù)能夠準(zhǔn)確區(qū)分容受前期、容受期、容受后期三個時期樣本，容受前期和容受后期均被認(rèn)為種植窗口移位。依據(jù)結(jié)果為給RIF 患者定制更準(zhǔn)確的個體化胚胎移植（personalized embryo transfer，pET）方案。針對RIF 患者中可能影響種植窗的原因中，局部病理因素如宮腔內(nèi)占位病變、輸卵管積水、子宮腺肌癥、慢性子宮內(nèi)膜炎在行ERT 檢測前已行相關(guān)檢查排查且治療。那么ERT 結(jié)果中發(fā)生種植窗移位的反復(fù)移植失敗人群是否具有特定母體全身性因素影響子宮內(nèi)膜容受性，目前尚無相關(guān)研究。本研究比較發(fā)生種植窗移位與非移位患者的臨床指標(biāo)以探討種植窗移位的發(fā)病原因、應(yīng)對策略。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組

回顧性分析2020 年12 月至2022 年1 月在云南省第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科診斷為反復(fù)種植失敗[3]并行ERT 檢測的病例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）取卵年齡小于40 歲；（2）反復(fù)種植失敗的患者，即既往≥3 次的移植失敗，累積移植：優(yōu)質(zhì)D3 胚胎4～6 個或高評分囊胚（4BB 及以上囊胚）3 個及以上均失??；排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）男女雙方染色體核型異常；（2）有子宮內(nèi)膜病變者（包括宮腔粘連、子宮內(nèi)膜息肉、慢性子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜結(jié)核等）未治療；（3）有輸卵管積水且未行輸卵管近端結(jié)扎者；（4）有粘膜下肌瘤未處理。根據(jù)ERT 結(jié)果分為容受期組和非容受期組。

1.2 內(nèi)膜監(jiān)測及手術(shù)時間安排

月經(jīng)來潮10～12 d B 超監(jiān)測卵泡及內(nèi)膜厚度，若有優(yōu)勢卵泡發(fā)育監(jiān)測至排卵，排卵+5 d 或出現(xiàn)LH 峰+7 d 安排內(nèi)膜取材；若無優(yōu)勢卵泡發(fā)育，予激素替代周期，口服戊酸雌二醇（補(bǔ)佳樂，德國Bayer）2 mg，bid，用藥14 d，內(nèi)膜≥8 mm 時給予黃體酮陰塞（安琪坦，法國Capsugel）0.2 g，bid，及地屈孕酮口服（達(dá)芙通，荷蘭Abbott）10 mg，bid，轉(zhuǎn)化內(nèi)膜6 d 后安排內(nèi)膜取材。

1.3 內(nèi)膜取材手術(shù)

手術(shù)當(dāng)天行陰道分泌物、血常規(guī)檢查。手術(shù)室患者取截石位，消毒鋪巾，宮頸鉗鉗夾宮頸上下唇固定宮頸，探針探查宮深，順子宮位置方向輕柔插入內(nèi)膜取材取樣器，待取樣器底部達(dá)宮底處，左手握住并固定管套，右手握住手柄，快速向外拉管芯使宮腔形成負(fù)壓吸取內(nèi)膜組織。將取樣管中的子宮內(nèi)膜組織排除至無菌紗布上，挑選干凈無血污染的內(nèi)膜組織直接放入裝有RNA 保存液的保存管，放入-20 ℃保存，聯(lián)系送檢取樣。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 患者一般資料包括年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、不孕類型（原發(fā)不孕占比）、不孕年限。

1.4.2 胰島素抵抗指數(shù)Homa IR=空腹血漿葡萄糖（mmol/L）×空腹血漿胰島素（mIU/L）/22.5；Homa IR ＞2.69診斷為胰島素抵抗（insulin resistance，IR）[4]。

1.4.3 維生素D水平按照美國醫(yī)學(xué)研究所制定的在健康人群中維生素 D 的標(biāo)準(zhǔn)[5]，維生素 D 缺乏指25-OHD＜ 50 nmol/L。

1.4.4 血栓前狀態(tài)避開月經(jīng)期行凝血酶原時間（PT），活化部分凝血活酶時間（APTT），凝血酶時間（TT），D-二聚體，纖維蛋白/纖維蛋白原降解產(chǎn)物（FDP），蛋白C、蛋白S 活性，抗凝血酶Ⅲ活性，血漿凝血因子Ⅴ活性，同型半胱氨酸檢查，以上檢測項目一項或多項陽性診斷血栓前狀態(tài)（prethrombotic state，PTS）[6]。

1.4.5 抗磷脂抗體及抗核抗體抗磷脂抗體（antiphospholipid antibodies，aPLs，包括抗心磷脂抗體、抗β2-糖蛋白1 抗體，狼瘡抗凝物），抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）每12 周檢測2次，2 次抗體陽性視為陽性組。

1.4.6 甲狀腺功能促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）處于正常范圍，而甲狀腺自身抗體包括甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TGAb）陽性視為甲狀腺自身免疫（thyroid autoimmunity，TAI）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究統(tǒng)計分析采用SPSS（version 26），計量資料符合正態(tài)分布用（±s）表示。當(dāng)方差齊時，獨(dú)立樣本t檢驗比較組間差異，當(dāng)方差不齊時采用Cochran 矯正t檢驗比較組間差異。計數(shù)資料用頻數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗進(jìn)行分析。針對建模人群，采用Logistic 多元逐步回歸篩選預(yù)測指標(biāo)。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組患者一般臨床資料比較

接受ERT 檢測并得到結(jié)果的病例中，非容受期組19 例，容受期組38 例。2 組患者的年齡、BMI、原發(fā)不孕占比、不孕年限，內(nèi)膜準(zhǔn)備方案（替代周期占比）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 2 組病例一般資料的比較[±s/n（%）]Tab.1 Comparison of general data of cases between the two groups [±s/n（%）]

表1 2 組病例一般資料的比較[±s/n（%）]Tab.1 Comparison of general data of cases between the two groups [±s/n（%）]

2.2 2 組患者內(nèi)膜種植窗移位相關(guān)因素單因素分析

2 組患者間ANA 陽性、維生素D 缺乏發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），而IR 發(fā)生率、aPLs 陽性率、非容受期組明顯高于容受期組（P＜ 0.05），見表2。

表2 2 組病例種植窗移位相關(guān)因素比較[n（%）]Tab.2 Comparison of related factors of implant window displacement between two groups [n（%）]

2.3 內(nèi)膜種植窗移位相關(guān)因素Logistic 回歸分析

將單因素分析中IR、aPLs 陽性（P＜ 0.05）及TAI（P=0.056），PTS（P=0.067）進(jìn)行Logistic 多因素回歸分析，最終IR、易栓癥、TAI 陽性進(jìn)入回歸方程。三者為內(nèi)膜種植窗移位的獨(dú)立危險因素，見表3。

表3 影響種植窗移位的Logistic 回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of influencing the displacement of planting window

3 討論

目前有研究認(rèn)為，反復(fù)自然流產(chǎn)和反復(fù)種植失敗兩個綜合征可能有共同的發(fā)病機(jī)制[7]，免疫學(xué)因素、血凝因素、女性生殖道解剖結(jié)構(gòu)異常以及內(nèi)分泌異常被認(rèn)為是自然流產(chǎn)中最重要的4 種母體病因[8]。生殖道解剖異常易于診斷，但自身免疫因素、血凝因素以及內(nèi)分泌異常在反復(fù)種植失敗人群中所起的作用已逐漸引起重視，而上述因素是否通過對種植窗產(chǎn)生影響從而影響胚胎著床目前尚無研究。筆者的研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗、血液高凝狀態(tài)和甲狀腺自身免疫是種植窗移位的危險因素。

3.1 胰島素抵抗對子宮內(nèi)膜種植窗影響

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指外周組織對胰島素敏感性下降產(chǎn)生對葡萄糖的利用率降低的結(jié)果，為達(dá)到正常血糖水平機(jī)體代償性分泌胰島素，導(dǎo)致血液胰島素水平過高，即高胰島素血癥。既往的研究認(rèn)為IR 對IVF 結(jié)局的影響主要體現(xiàn)在卵母細(xì)胞質(zhì)量受損[9-11]，而本研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗是種植窗移位的危險因素之一，Chang 等[12]通過比較合并IR 的多囊卵巢綜合征與不合并IR 的多囊卵巢綜合征接受IVF 助孕的治療結(jié)局，發(fā)現(xiàn)2 組間獲卵數(shù)、卵子成熟度、卵裂率和胚胎質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但胚胎種植率、臨床妊娠率合并IR 組明顯低于不合并IR 組。有研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗、高雄激素與子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物如αvβ3 整合素、同源框基因A10（homeoboxA10，HOXA10）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBP-1）低表達(dá)有關(guān)[13-14]。分析其原因可能存在以下因素，高胰島素血癥會下調(diào)肝臟IGFBP-I，導(dǎo)致循環(huán)中游離IGF-I 升高。上述兩者水平升高可抑制子宮內(nèi)膜間質(zhì)分化的正常進(jìn)程即子宮內(nèi)膜蛻膜化，從而影響滋養(yǎng)層的侵襲和生長、免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與細(xì)胞因子環(huán)境[15]。近年來，子宮內(nèi)膜局部IR 逐漸受到關(guān)注，妊娠建立的條件包括具有容受性的子宮內(nèi)膜以及內(nèi)膜胚胎的交互作用，在這個過程中葡萄糖攝取以獲得能量[16]是前提。子宮內(nèi)膜局部IR 由于胰島素受體底物磷酸化、PI3K/蛋白激酶 B （Akt） 信號通路以及胰島素敏感的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT-4 表達(dá)三者異常，由此發(fā)生的IRS/PI3K/Akt/G LU T-4 通路受損破壞蛻膜化過程能量穩(wěn)態(tài)影響子宮內(nèi)膜的葡萄糖利用[17]。以上可能是胰島素抵抗干擾正常種植窗開放，導(dǎo)致種植窗移位的原因。

3.2 血栓前狀態(tài)對子宮內(nèi)膜種植窗影響

本研究單因素分析提示容受期與非容受期血栓前狀態(tài)比率無統(tǒng)計學(xué)差異，但放入多因素回歸分析則提示血栓前狀態(tài)是內(nèi)膜種植窗移位的危險因素。凝血系統(tǒng)異常會導(dǎo)致出血或血栓形成，血栓形成前的高凝狀態(tài)稱為血栓前狀態(tài)（prethrombotic state，PTS）[6]。近年來，越來越多的研究支持RIF 與PTS 有關(guān)[18]，PTS 可能在一定程度上影響凝血-纖溶系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致凝血功能增強(qiáng)。Bellver 等發(fā)現(xiàn)[19]，凝血因子缺陷發(fā)生率在RIF 病例中較正常生育婦女顯著增高，亦有系統(tǒng)評價提示[20]RIF 與凝血因子缺陷顯著相關(guān)。Wen[21]研究發(fā)現(xiàn)血栓前狀態(tài)在黃體中期子宮內(nèi)膜動脈血流得阻力明顯高于對照組，并且由于高凝狀態(tài)，子宮的血流速度處于高阻力狀態(tài)，從而導(dǎo)致內(nèi)膜血流灌注不足，對內(nèi)膜容受性產(chǎn)生影響，這也許是血栓前狀態(tài)影響內(nèi)膜種植窗的主要原因。基于上述，Yang 等[22]建立了預(yù)測中國女性RIF的凝血檢查指標(biāo)模型，發(fā)現(xiàn)凝血參數(shù)包括PT、APTT、TT 和AA 誘導(dǎo)的血小板聚集是RIF 的預(yù)測指標(biāo)，強(qiáng)調(diào)了抗凝治療降低RIF 風(fēng)險的潛力。

3.3 自身免疫性甲狀腺疾病對子宮內(nèi)膜種植窗影響

臨床甲狀腺功能障礙，主要是出現(xiàn)甲狀腺自身抗體，包括甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TGAb）。既往不少研究發(fā)現(xiàn)：不孕癥女性人群中，TAI 發(fā)病率較對照組增加[23-24]。TAI 對輔助生殖結(jié)局影響研究結(jié)果目前存在較大爭議，Patriza 等[25]研究發(fā)現(xiàn)：TAI 組患者接受輔助生殖治療受精率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率均低于對照組，推測卵泡液中就已存在的甲狀腺抗體干擾了女性生殖。2016 年一項系統(tǒng)評價分析提示TAI 在輔助生殖中不影響獲卵、受精、胚胎形成，而是增加了流產(chǎn)率[26]，綜上TAI 對于內(nèi)膜容受性影響并不明確。2017 年的一項研究[27]通過流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)對比了正常人群和甲狀腺功能正常TAI 女性患者之間外周血單核細(xì)胞表型，發(fā)現(xiàn)TAI 組外周血中先天免疫的Th1 型變化，升高的NK 和NKT 樣細(xì)胞比率和增強(qiáng)的天然細(xì)胞毒性解釋了可能對妊娠結(jié)局包括內(nèi)膜容受性具有負(fù)面影響的免疫狀態(tài)。

綜上所述，IR、PTS、TAI 是子宮內(nèi)膜種植窗移位的母體全身性危險因素，該結(jié)果對于RIF 的預(yù)防和治療提供了新的思路和方向。同時，本研究存在一定的局限性，因研究樣本例數(shù)的限制，使部分結(jié)果缺乏統(tǒng)計學(xué)差異，后期擬進(jìn)一步增加研究例數(shù)擴(kuò)大研究范圍，完善相關(guān)參數(shù)的比較。