李思琪，邰文琳

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 昆明 650101）

肝纖維化是各種慢性肝?。òǘ拘該p傷、病毒感染、自身免疫性疾病、代謝相關(guān)脂肪性肝病和遺傳性疾病、酒精性肝?。┻M(jìn)展過程中的動態(tài)病理過程，是肝臟對慢性損傷的病理性修復(fù)反應(yīng)。肝纖維化的特征是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM 即膠原、糖蛋白和蛋白多糖等）的過度積累，其被認(rèn)為是一個中間階段，可以逆轉(zhuǎn)或進(jìn)展為肝硬化和終末期肝病[1]。肝硬化是全球第11 大最常見的死亡原因，每年導(dǎo)致超過116 萬人死亡[2]。肝纖維化不僅增加了終末期肝病的發(fā)病率和死亡率，而且還增加了肝外疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝纖維化的病因之一，它增加了兒童和年輕人的心臟代謝死亡率[3]。新型冠狀病毒肺炎（novel coronavirus pneumonia，COVID-19）流行目前是全球存在的一個重要健康問題，肝纖維化是新冠肺炎患者不利結(jié)局的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4]。然而，迄今為止，尚無有效的藥物被批準(zhǔn)用于臨床預(yù)防肝纖維化的進(jìn)展。因此，在肝纖維化的研究中，仍需進(jìn)一步闡明肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，探索新的有效治療方法。

趨化因子（Chemotactic cytokines）是一種小的分泌蛋白，可以將免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞招募到炎癥或損傷部位。趨化因子在在肝臟中調(diào)節(jié)細(xì)胞傷口愈合反應(yīng)起著重要作用，包括從循環(huán)和骨髓中招募炎癥細(xì)胞，以及駐留的肝細(xì)胞向損傷部位遷移。在本文中，筆者將重點(diǎn)研究趨化因子C-XC 基序趨化因子10（CXCL10，也稱為IP-10），CXCL10 由免疫細(xì)胞（單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）和非免疫細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和肝細(xì)胞）分泌[5-6]。在肝臟內(nèi)，CXCL10 主要由肝纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞如肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞表達(dá)[7]。CXCL10 的獨(dú)特受體是CXCR3，它是一種跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，在效應(yīng)T 細(xì)胞上高度表達(dá)。CXCL10 在感染性疾病、自身免疫性疾病和代謝性疾病中作為炎癥介質(zhì)發(fā)揮關(guān)鍵作用，CXCL10還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞遷移，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和血管生成[8]。目前它已被證明會加重由ConA 引起的乙型肝炎、丙型肝炎、自身免疫性肝炎和T細(xì)胞性肝炎等肝病患者的肝臟炎癥狀況[9-10]。炎癥由氧化應(yīng)激和促炎趨化因子和細(xì)胞因子引起，從而導(dǎo)致肝損傷并促進(jìn)纖維化[11]。有研究發(fā)現(xiàn)血清和肝臟CXCL10 水平升高均與肝臟活組織檢查中的高活動度和纖維化嚴(yán)重程度相關(guān)[11]。CXCL10 在化學(xué)誘導(dǎo)的肝纖維化中發(fā)揮重要作用，CXCL10 可能會吸引肝星狀細(xì)胞到受損部位，參與肝細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用。CXCL10通過放大其他促炎細(xì)胞因子的作用來持續(xù)激活肝星狀細(xì)胞，包括TNF-α、白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、干擾素（IFN-γ）和toll 樣受體9（TLR9）。這些數(shù)據(jù)表明，CXCL10 在肝炎中作為一種促纖維化因子，而CXCL10 的阻斷可能是肝纖維化的治療靶點(diǎn)。

肝纖維化早期診斷具有重要的臨床意義，肝活檢是診斷和分期的金標(biāo)準(zhǔn)。然而肝活檢存在一些缺點(diǎn)，如盲穿刺或肝病變不均勻造成的誤差。此外，肝穿刺是一種不能動態(tài)觀察的有創(chuàng)檢查。因此，它可能不被大多數(shù)患者所接受[12]。血清學(xué)診斷是應(yīng)用最廣泛的無創(chuàng)診斷方法，其樣本采集方便，可動態(tài)觀察，但其特異性相對較低[13]，很少有參數(shù)可以被認(rèn)為與纖維發(fā)生直接相關(guān)。目前，有幾種無創(chuàng)或微創(chuàng)的方法，如瞬時彈性掃碼（TE）和磁共振彈性成像用于肝纖維化分期[14]，它們可以為纖維化患者提供高精度、無創(chuàng)的肝臟硬度測量方法，但受到肥胖等多種因素的限制，或受炎癥活動的影響[15]。傳統(tǒng)的CT 圖像和MRI 可以對肝硬化和門脈高壓進(jìn)行定量評價(jià)，但對早期肝纖維化無法進(jìn)行定量評價(jià)。本文研究了CXCL10 可否作為一種無創(chuàng)標(biāo)志物，以避免肝活檢引起的并發(fā)癥，可以動態(tài)監(jiān)測肝功能變化，這可能有助于識別有進(jìn)行性纖維化風(fēng)險(xiǎn)的患者，以便進(jìn)行早期干預(yù)或保持更密切的監(jiān)測，延緩肝硬化進(jìn)展，降低肝癌發(fā)病率，通過血清學(xué)檢測來協(xié)助臨床診斷和治療?；蛘咝枰Y(jié)合其他多種肝纖維化生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，以提高特異性。

本研究的目的是闡明CXCL10 作為肝纖維化診斷和進(jìn)展的無創(chuàng)生物標(biāo)志物的潛力。在肝纖維化炎癥的多個信號通路中阻斷CXCL10 信號通路，有助于開發(fā)新的抗纖維化策略為肝纖維化的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

收集2021 年3 月至8 月期間昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科肝硬化EDTA-K2 抗凝管外周血標(biāo)本64 管為實(shí)驗(yàn)組，并收集同期體檢中心的健康人群的外周血標(biāo)本64 管作為對照組。嚴(yán)格記錄患者的基本信息和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，以便進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。肝硬化組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）失代償期肝硬化；（2）原發(fā)性肝癌或其他惡性腫瘤；（3）合并其他重要臟器嚴(yán)重疾病、嚴(yán)重神經(jīng)及精神疾病患者。該研究得到了昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會的認(rèn)證。

1.2 ELISA 檢測血漿中CXCL10 的濃度

血漿和上清中C-X-C 基序趨化因子10（CXCL10）的水平采用ELISA 試劑盒（Sino Biological Inc.）根據(jù)試劑盒的方案檢測。用酶標(biāo)儀（BioTek，cytationl，美國）在450 nm 處讀取吸光強(qiáng)度。用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度和OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式為y=81.672X2-77.543X+35.031，R2=0.989 4。將樣品的OD 值代入方程式，即可計(jì)算出CXCL10 濃度。將肝硬化患者血漿CXCL10水平分為低表達(dá)組（≤中位數(shù)水平）和高表達(dá)組（＞ 中位數(shù)水平），比較2 組的肝功指標(biāo)和凝血五項(xiàng)有無差異。

1.3 肝功實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用TBA-120FR 全自動生化分析儀檢測，凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果用CS-5100 全自動血凝分析儀檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 25.0 軟件和GraphPad Prism 8 對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。計(jì)量資料首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)為正態(tài)分布時用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)；數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布時，用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman秩相關(guān)。進(jìn)一步采用受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析CXCL10 的診斷效能。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝硬化患者一般臨床資料

收集肝硬化患者的年齡、性別和檢驗(yàn)結(jié)果等臨床資料，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)分析，PT 和APTT 數(shù)據(jù)總體符合正態(tài)性分布，ALT、AST、LPS、GGT、TBA、TBIL、DBIL、IBIL、TT、FIB、DD 數(shù)據(jù)總體不符合正態(tài)分布，見表1。

表1 肝硬化患者的臨床資料[±s/M（P25，P75）]Tab.1 Clinical data of patients with cirrhosis[±s/M（P25，P75）]

表1 肝硬化患者的臨床資料[±s/M（P25，P75）]Tab.1 Clinical data of patients with cirrhosis[±s/M（P25，P75）]

2.2 2 組外周血中CXCL10 濃度比較

結(jié)果顯示，健康對照組（n=64）CXCL10 的濃度是20.94 ng/mL（16.96，27.78），肝硬化組（n=64）CXCL10 的濃度是81.07 ng/mL（28.09，196.17），P＜ 0.000 1，肝硬化患者血漿中CXCL10 水平顯著升高，2 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

圖1 肝硬化患者外周血中CXCL10 的表達(dá)Fig.1 Expression of CXCL10 in peripheral blood of patients with cirrhosis****P ＜ 0.000 1。

2.3 肝硬化患者肝功檢驗(yàn)結(jié)果與CXCL10 濃度相關(guān)性分析

Spearman 秩相關(guān)分析結(jié)果顯示：肝硬化患者血漿中CXCL10 濃度與ALT 和AST 成正相關(guān)關(guān)系，P＜ 0.05，與其余生化指標(biāo)之間未見相關(guān)性，見表2，圖2。

圖2 肝硬化患者血漿CXCL10 濃度與ALT、AST 關(guān)系Fig.2 The relationship between PLASMA CXCL10 concentration and ALT and AST in patients with cirrhosis

表2 肝硬化患者血漿CXCL10 濃度與肝功生化指標(biāo)關(guān)系Tab.2 Relationship between plasma CXCL10 concentration and liver function biochemical indexes in patients with cirrhosis

2.4 肝硬化患者凝血功能檢驗(yàn)結(jié)果與CXCL10 濃度相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析和Spearman 秩相關(guān)分析結(jié)果顯示：肝硬化患者血漿中CXCL10 濃度與PT、APTT、DD成正相關(guān)關(guān)系（P＜ 0.05），與TT 和FIB 之間未見相關(guān)性（P＞ 0.05），見表3，圖3。

圖3 肝硬化患者血漿CXCL10 濃度與PT、APTT、DD 關(guān)系Fig.3 Relationship between plasma CXCL10 concentration and PT，APTT and DD in patients with cirrhosis

表3 肝硬化患者血漿CXCL10 濃度與凝血指標(biāo)關(guān)系Tab.3 Relationship between plasma CXCL10 concentration and coagulation indexes in patients with cirrhosis

2.5 CXCL10 相關(guān)影響因素的線性回歸分析

以 ALT、AST、LPS、GGT、TBA、TBIL、DBIL、IBIL、PT、APTT、TT、FIB、DD 為自變量，CXCL10 為因變量，多重線性回歸分析結(jié)果顯示，DD 的標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)為1.922，P＜ 0.05，可認(rèn)為DD 對CXCL10 的影響最大，見表4。

表4 CXCL10 相關(guān)影響因素的線性回歸分析Tab.4 Linear regression analysis of CXCL10 related influencing factors

2.6 高表達(dá)CXCL10 組和低表達(dá)CXCL10 組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)差異分析

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，2 組ALT、AST、PT、APTT、DD 指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見表5。高表達(dá)CXCL10 組中的ALT、AST、PT、APTT、DD 值均大于低表達(dá)CXCL10 組，見圖4。

圖4 高表達(dá)CXCL10 組和低表達(dá)CXCL10 組ALT、AST、PT、APTT、DD 比較Fig.4 Comparison of ALT，AST，PT，APTT and DD between the high-expression CXCL10 group and the low-expression CXCL10 group

表5 高表達(dá)CXCL10 組和低表達(dá)CXCL10 組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)差異分析[±s/M（P25，P75）]Tab.5 Difference analysis of laboratory indicators between high and low expression groups of CXCL10 [±s/M（P25，P75）]

表5 高表達(dá)CXCL10 組和低表達(dá)CXCL10 組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)差異分析[±s/M（P25，P75）]Tab.5 Difference analysis of laboratory indicators between high and low expression groups of CXCL10 [±s/M（P25，P75）]

*P ＜ 0.05。

2.7 血漿CXCL10 水平對肝硬化的診斷價(jià)值

以AUC 大于0.70 作為判斷該指標(biāo)是否具有診斷價(jià)值的判斷標(biāo)準(zhǔn)。CXCL10 在預(yù)測肝硬化時，ROC 曲線下面積為0.826 4，大于0.7，約登指數(shù)為0.625，靈敏度值為0.833 3，特異度值為0.791 7，P＜ 0.000 1，具有較好的診斷效能，見圖5。

圖5 肝纖維化診斷的受試者工作特征曲線分析Fig.5 Analysis of operating characteristic curves of subjects in liver fibrosis diagnosis

3 討論

我國約有3 億肝病患者，包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝和酒精性肝病。每年有近40 萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡總?cè)藬?shù)的51%[16]。由于肝病加重了我國的社會和醫(yī)療負(fù)擔(dān)，因此動態(tài)監(jiān)測肝功能變化，延緩肝硬化進(jìn)展，降低肝癌發(fā)病率，并通過血清學(xué)檢測協(xié)助臨床診斷和治療十分重要[17]。肝纖維化與肝細(xì)胞癌的發(fā)展密切相關(guān)，準(zhǔn)確的纖維化評估對于肝細(xì)胞癌的篩查至關(guān)重要。區(qū)分晚期疾病患者，特別是肝硬化患者與輕度或無纖維化患者對于臨床治療決策很重要。目前，肝活檢組織病理學(xué)檢查仍是肝纖維化診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。由于肝活檢屬于創(chuàng)傷性檢查，少數(shù)病例可能會發(fā)生并發(fā)癥，如疼痛、出血、感染甚至死亡，不易被患者接受和費(fèi)用較高等缺點(diǎn)，限制了其普遍應(yīng)用。盡管在東亞人群中已發(fā)現(xiàn)了一些與肝纖維化相關(guān)的重要生物標(biāo)志物，如?；悄懰帷⑽蓙y的腸道微生物和糞便中的毛螺菌科[18-19]，但還需要確定更多的標(biāo)記物，以促進(jìn)肝纖維化檢測和預(yù)后預(yù)測的敏感性和特異性。除肝纖維化分期的病理檢查外，白蛋白、IV 型膠原蛋白、羥脯氨酸（Hyp）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血紅蛋白、膽紅素和腹水等生化指標(biāo)均可間接反映肝纖維化的程度。在這種情況下，將CXCL10確定為肝纖維化進(jìn)展的生物標(biāo)志物可能是有用的，盡管尚未在肝纖維化中研究。

在本研究中，筆者評估了CXCL10 作為一種無創(chuàng)性性生物標(biāo)志物來預(yù)測患者肝纖維化階段的能力。ALT 是肝臟炎癥最直接、最敏感、最經(jīng)濟(jì)的指標(biāo)，其水平升高通常提示肝臟炎癥的發(fā)生。筆者的數(shù)據(jù)顯示，肝硬化患者血漿CXCL10 水平與ALT、AST、PT、APTT、DD 呈正相關(guān)關(guān)系，說明肝功生化指標(biāo)不能代替CXCL10 的檢測，肝硬化患者血漿CXCL10 水平是獨(dú)立于生化指標(biāo)之外的。提示CXCL10 表達(dá)水平也可作為判斷有無肝臟損傷和凝血功能異常的指標(biāo)，與肝硬化患者的肝功能障礙相關(guān)。肝硬化患者的凝血酶原時間（PT）和部分凝血酶原時間（PTT）均會延長，說明在肝功能障礙的背景下，促凝因子的合成會減少，CXCL10 表達(dá)水平可能也與凝血因子有關(guān)。高表達(dá)CXCL10 和低表達(dá)CXCL10 的肝硬化患者的檢驗(yàn)結(jié)果如ALT、AST、PT、APTT、DD 存在顯著性差異，這表明肝臟損傷時肝細(xì)胞破壞釋放ALT、AST 的同時也促進(jìn)CXCL10 表達(dá)上調(diào)，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步的探索和研究。肝硬化患者血漿CXCL10 水平較健康對照組明顯上升，肝內(nèi)CXCL10 的表達(dá)隨著肝纖維化的進(jìn)展而增加，表明CXCL10 也參與了肝臟炎癥的發(fā)生和發(fā)展。CXCL10 的ROC 曲線下面積為0.826 4，具有較好的診斷效能。因此CXCL10 可作為一種無創(chuàng)標(biāo)志物，以避免肝活檢引起的并發(fā)癥。它可以反映肝臟動態(tài)變化，這可能有助于識別有進(jìn)行性纖維化風(fēng)險(xiǎn)的患者，以便進(jìn)行早期干預(yù)或保持更密切的監(jiān)測。目前，尚缺乏血清特異性肝纖維化診斷指標(biāo)，依單一血液指標(biāo)對肝纖維化評估作用有限，CXCL10 可以聯(lián)合其他指標(biāo)檢測和評估來提高診斷價(jià)值。然而，目前對CXCL10 缺乏相關(guān)的長期縱向臨床資料，難以在短期內(nèi)應(yīng)用于臨床。總之，根據(jù)本研究獲得的結(jié)果，CXCL10 可以作為反映肝臟功能障礙的生物標(biāo)志物，CXCL10 與肝硬化有顯著相關(guān)性，因此可作為肝硬化患者的敏感生物標(biāo)志物。