楊永銳 ，王麗媛 ，李海雯 ，趙智蓉 ，普 瑞 ，吳貴帥 ，李樹德

（1）昆明市第三人民醫(yī)院肝病科 云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，云南 昆明 650041;2）昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系;3）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

在大部分慢性肝病的晚期，由于膠原纖維蛋白（collagen fibrin，CF）的過度表達(dá)，形成細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肝臟組織損傷后修復(fù)障礙引起肝臟的纖維化發(fā)生[1-2]。早期的肝臟纖維化是一個(gè)可逆的病理過程，隨著進(jìn)一步的進(jìn)展，會(huì)增加患者的死亡率[3]。在纖維化發(fā)生和發(fā)展的過程中，由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）和異常炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活是肝纖維化的中心驅(qū)動(dòng)因素[4]。氧化應(yīng)激的發(fā)生是由于抗氧化能力和活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生之間的不平衡導(dǎo)致，由還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NOX）產(chǎn)生的ROS 在氧化應(yīng)激中占據(jù)主導(dǎo)地位。在哺乳動(dòng)物中NOX 的亞型有NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5 和DUOX1-2。在肝臟中，NOX 以吞噬形式和非吞噬形式進(jìn)行功能性表達(dá)，近年來的研究表明，吞噬NOX2 和非吞噬NOX 亞型，包括NOX1 和NOX4，都介導(dǎo)HSC中不同的促成纖維作用[5]。然而，通過NOX2 和NOX4 介導(dǎo)的ROS 產(chǎn)生在NAFLD 誘導(dǎo)肝臟纖維化的調(diào)控機(jī)制有待深入研究。

燈盞乙素（scutellarin，SCU）是從菊科短葶飛蓬植物燈盞花中提取出來的生物活性黃酮類化合物，在云南省分布占全球的95%以上[6]。SCU 具有多種藥理特性，包括抗炎、抗氧化、減少心肌缺血大鼠的梗死面積、減輕心肌纖維化和功能障礙、抑制心肌肥厚，防止阿霉素誘導(dǎo)的急性心臟毒性等。在臨床上，SCU 主要被運(yùn)用于腦卒中和心肌梗死治療[7]。既往研究表明，在豬血清誘導(dǎo)的大鼠肝臟纖維化中，SCU 可以通過抑制HSC 的活化，調(diào)節(jié)ECM 的合成和降解而起到抗纖維化的作用[6]。在高脂喂養(yǎng)的雄性C57BL/6 小鼠以及在油酸誘導(dǎo)脂質(zhì)積累的HepG2 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)SCU 能通過PPARc/PGC-1a-Nrf2 信號(hào)通路增強(qiáng)抗氧化劑的水平，減少脂質(zhì)過氧化作用從而起到保護(hù)肝臟的作用[8]。然而，SCU 是否能在肝臟纖維化中通過抑制NOX 的生成起調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的作用尚不清楚。因此，在本研究中，通過高脂高糖飲食喂養(yǎng)SD 大鼠建立NAFLD 動(dòng)物模型，依據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9]建立SCU 低、中、高劑量治療組，探討SCU 能否在NAFLD 動(dòng)物模型中降低氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白NOX2 和NOX4 的表達(dá)，減少ROS 的生成，抑制氧化應(yīng)激，從而改善肝臟的纖維化程度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重為180～220 g 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK（滇）K2020-0004，SPF 級(jí)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)條件為：恒溫（22±2）℃，恒濕（55±5）%，晝夜明暗交替時(shí)間12/12h。本研究通過大理大學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.1.2 主要試劑燈盞乙素（云南植物藥業(yè)有限公司）；大鼠ROS 檢測(cè)試劑盒（鈺博生物）；NOX2、NOX4 一抗（Affinity Bioscience）；二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；PVDF 膜（Millipore Corporation）；ECL 化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（Biosharp）等。

1.1.3 主要設(shè)備半干轉(zhuǎn)膜儀221BR 51253（美國(guó)BIO-RAD 公司）；冰凍切片機(jī)CM1950（德國(guó)徠卡相機(jī)股份有限公司）；直流電泳儀（北京六一儀器廠）；全波段酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）；石蠟包埋機(jī)（Leica Biosystems）等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將180～220 g 的雄性SD大鼠60 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后隨機(jī)分為6 組，每組10 只，分別為正常組、模型組、SCU 低劑量治療組、SCU 中劑量治療組、SCU 高劑量治療組、姜黃素陽(yáng)性藥物治療組。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模除了正常組給予正常飼料24 周外，其余各實(shí)驗(yàn)組給予高脂高糖飲食喂養(yǎng)24 周。

1.2.3 SCU 灌胃治療及取材造模24 周后，SCU低、中、高劑量治療組分別采用25 mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）的SCU 灌胃治療，姜黃素陽(yáng)性藥物治療組采用200 mg/（kg·d）的姜黃素灌胃治療；治療期間，模型對(duì)照組，SCU 低、中、高劑量治療組以及姜黃素陽(yáng)性藥物治療組繼續(xù)給予高脂高糖飲食喂養(yǎng)。8 周后，大鼠禁食8～12 h，1%戊巴比妥鈉麻醉狀態(tài)下取血，4 000 r/min，離心5 min 獲得血清；取部分肝臟組織及4%多聚甲醛固定24 h，流水沖洗3 h，進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明和石蠟包埋，用于形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。部分肝臟組織液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 大鼠體重、肝重和肝臟指數(shù)的測(cè)定灌胃治療8 周后，稱取各組大鼠體重。麻醉狀態(tài)下，稱取各組大鼠肝重，并計(jì)算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)（%）=肝臟重量（g）/體重（g）×100%[10]。

1.2.5 血清ROS 測(cè)定取各組大鼠的血清，嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行。通過酶標(biāo)儀檢測(cè)各組血清的OD 值，按照說明書要求計(jì)算出血清中ROS的含量。

1.2.6 肝臟組織ROS 的測(cè)定稱取一定量的新鮮大鼠肝臟組織于預(yù)先加入預(yù)冷PBS 的EP 管中置于超聲破碎儀中，制備成10%的組織勻漿，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)其OD 值，根據(jù)標(biāo)曲公式計(jì)算出組織中ROS 的含量。

1.2.7 肝臟組織油紅“O”染色10 μm 的冰凍切片置于常溫中平衡30 min 后，用甲醛鈣固定液固定10 min，油紅“O”染液染色10 min，60%異丙醇分化，流水終止分化，蘇木素復(fù)染核3 min，自來水返藍(lán)，甘油明膠封片，在光學(xué)顯微鏡在觀察分析。

1.2.8 肝臟組織Masson 染色石蠟包埋的肝臟組織制備4 μm 的組織切片，常規(guī)脫蠟至水。切片入Bouin 液于60 ℃恒溫溫箱媒染2 h，然后流水沖洗至切片上的黃色消失，天青石藍(lán)滴染3 min，Mayer 蘇木素滴染3 min，酸性乙醇分化液稍分化后流水沖洗10 min，麗春紅品紅滴染10 min，磷鉬酸處理10 min，傾去上液直接滴加苯胺藍(lán)染5 min，最后弱酸處理2 min 后進(jìn)行95%乙醇快速脫水，無水乙醇脫水以及二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察分析。

1.2.9 Western blot 檢測(cè)肝臟組織中的NOX2、NOX4 的表達(dá)稱20～30 mg 的大鼠肝臟組織于1.5 mL 的EP 管中，每管加入RIPA 組織裂解液300 μL 與PMSF 3 μL，混勻，置于超聲細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行破碎，12 000 r/min，離心10 min，取上清液。BCA 法測(cè)定蛋白濃度。每組取40 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳結(jié)束后，根據(jù)所需目的因子分子量進(jìn)行切膠，半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后置于5%的脫脂奶粉中在37 ℃恒溫?fù)u床中封閉1 h，后分別加入NOX2、NOX4（1∶1 000）一抗于4 ℃冰箱孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入相應(yīng)的二抗結(jié)合一抗，常溫孵育2 h。洗膜后顯影并Image J 進(jìn)行灰度值分析。

1.2.10 肝臟組織免疫組織化學(xué)染色石蠟切片經(jīng)1%檸檬酸鈉抗原修復(fù)液修復(fù)后，用3%的H2O2孵育30 min，抗原提取后，用5%牛血清孵育30 min。最后滴加NOX2、NOX4（1∶200）一抗在4℃冰箱孵育過夜，PBS 洗滌3 次后滴加即用型免疫組化二抗，常溫孵育30 min，PBS 洗滌3次后滴加新鮮配制的DAB 顯色3～5 min 后用PBS 沖洗終止顯色；蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化10 s 后用流水8 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，在光學(xué)顯微鏡觀察及分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析；大鼠體重、肝重及肝臟指數(shù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間的比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜ 0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用GraphPad Prism6.0 進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、肝重及肝臟指數(shù)的變化

與正常組相比，模型組大鼠體重、肝重及肝臟指數(shù)增加明顯（P＜ 0.01）；與模型組相比，SCU各治療組大鼠體重，肝重及肝臟指數(shù)下降，且SCU-100 高劑量治療組大鼠的體重，肝重下降明顯（P＜ 0.01），陽(yáng)性藥物治療組大鼠體重、肝重及肝臟指數(shù)下降明顯（P＜ 0.01）。結(jié)果顯示，在高脂高糖飲食誘導(dǎo)的NAFLD 中，大鼠的體重、肝重及肝臟指數(shù)均增加，SCU 治療可以降低大鼠體重、肝重以及肝臟指數(shù)，見表1。

表1 大鼠體重、肝重及肝臟指數(shù)（±s）Tab.1 Body weight，liver weight and liver index of rats （±s）

表1 大鼠體重、肝重及肝臟指數(shù)（±s）Tab.1 Body weight，liver weight and liver index of rats （±s）

與正常組比較，## P ＜ 0.01，與模型組比較，*P ＜ 0.01，**P ＜ 0.01。

2.2 血清ROS 濃度

與正常組相比，模型組血清ROS 濃度增加明顯（P＜ 0.01）；與模型組相比，SCU 低治療組血清ROS 濃度降低（P＜ 0.05），SCU 中、高治療組血清ROS 濃度降低明顯（P＜ 0.01），陽(yáng)性藥物治療組血清ROS 濃度降低（P＜ 0.05）。結(jié)果表明，在高脂高糖飲食誘導(dǎo)的NAFLD 中，血清ROS 濃度增加，SCU 治療可以降低血清ROS 濃度，見圖1。

圖1 血清中ROS 的濃度Fig.1 Concentration of ROS in the serum

2.3 肝臟組織ROS 濃度

與正常組相比，模型組肝臟組織ROS 濃度增加明顯（P＜ 0.01）；與模型組相比，SCU 各治療組和陽(yáng)性藥物治療組的肝臟組織ROS 濃度降低明顯（P＜ 0.01）。結(jié)果表明，在高脂高糖飲食誘導(dǎo)的NAFLD 中，肝臟組織ROS 濃度增加，SCU 治療可以降低肝臟組織ROS 濃度，見圖2。

圖2 肝臟組織中ROS 的濃度Fig.2 Concentration of ROS in the liver tissues

2.4 肝臟組織油紅“O”染色

正常組大鼠肝臟組織僅有極少量脂質(zhì)沉積（圖3A）；模型組大鼠肝臟組織中脂質(zhì)沉積增加（圖3B）；SCU 各治療組大鼠肝臟組織中脂質(zhì)沉積現(xiàn)象逐漸減少（圖3C、D、E）；陽(yáng)性藥物對(duì)照組大鼠肝臟組織中脂質(zhì)沉積也減少（圖3F）。結(jié)果表明，SCU 可以減少NAFLD 肝臟組織的脂質(zhì)沉積。

圖3 肝臟組織油紅“O”染色（×400）Fig.3 Oil red "O" staining of liver tissue（×400）

2.5 肝臟組織Masson 染色

正常組匯管區(qū)僅有少量膠原纖維沉積（圖4A）；模型組匯管區(qū)有大量藍(lán)色膠原纖維沉積且開始向肝細(xì)胞延伸（圖4B）；與模型組相比，SCU 各治療組匯管區(qū)膠原纖維開始減少，肝臟纖維化的程度有所減輕（圖4C、D、E）；陽(yáng)性藥物治療組匯管區(qū)纖維化程度較輕（圖4F）。

圖4 肝臟組織Masson 染色（×400）Fig.4 Masson staining of liver tissue（×400）

2.6 NOX2、NOX4 蛋白質(zhì)的表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組NOX2 的蛋白表達(dá)增加（P＜ 0.05）；與模型組相比，SCU 各治療組NOX2 的蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）；陽(yáng)性藥物治療組NOX2 表達(dá)下降（P＜ 0.05）。與正常組相比，模型組NOX4 的蛋白表達(dá)增加（P＜ 0.05）；與模型組相比，SCU 各治療組NOX4的蛋白表達(dá)下降（P＜ 0.05）；陽(yáng)性藥物治療組NOX4 表達(dá)下降（P＜ 0.05），見圖5。

圖5 肝臟組織中NOX2、NOX4 的蛋白表達(dá)Fig.5 Protein expression of NOX2 and NOX4 in liver tissues

2.7 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：

NOX2、NOX4 在肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，呈黃棕色。與正常組相比，模型組肝臟細(xì)胞內(nèi)光密度升高，NOX2、NOX4 蛋白表達(dá)增加（P＜ 0.05）；與模型組相比，SCU 各治療組肝臟細(xì)胞光密度降低，NOX2、NOX4 蛋白表達(dá)下降（P＜ 0.05）；陽(yáng)性藥物治療組肝臟組織光密度降低，NOX2、NOX4 蛋白表達(dá)下降（P＜ 0.05）。免疫組織化學(xué)與Western blot 的NOX2、NOX4 趨勢(shì)一致（圖6）。

圖6 肝臟組織中NOX2、NOX4 蛋白的表達(dá)（×400）Fig.6 Expression of NOX2 and NOX4 proteins in liver tissue （×400）

3 討論

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）已經(jīng)成為全球最常見的慢性疾病之一，它是一種與肥胖相關(guān)的慢性肝病，由特定的遺傳背景、各種環(huán)境和代謝因素相互作用而導(dǎo)致的全身性疾病[11]。在NAFLD 的發(fā)生過程中常伴隨著伴有肝臟炎癥、纖維化以及晚期的肝硬化[12]。肝臟纖維化是各種慢性肝病發(fā)展過程中最常見的病理過程，也是決定肝病預(yù)后的關(guān)鍵因素[13]；早期的肝臟纖維化是一種可逆的傷口愈合過程，是以細(xì)胞外基質(zhì)的沉積為特征的反應(yīng)[14]。HSC 作為纖維化的主要媒介，在受損肝細(xì)胞產(chǎn)生的ROS 刺激下被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts，MFB）表型，參與到損傷修復(fù)中[15]。因此，在肝纖維化時(shí)期如果損傷因素持續(xù)存在，將會(huì)逐漸發(fā)展為肝硬化。肝纖維化可以通過抑制多種途徑（如：氧化應(yīng)激，肝細(xì)胞損傷和HSC 激活）來得到逆轉(zhuǎn)[16]。中藥及其主要成分對(duì)復(fù)雜疾病的病理機(jī)制可以發(fā)揮綜合性的優(yōu)勢(shì)，許多中藥都具有明顯的抗炎、抗氧化作用[17]。SCU是從傳統(tǒng)中草藥燈盞花中提取的主要成分，已經(jīng)有600 多年的使用歷史[18]。有研究表明，SCU 具有清除氧自由基和抗氧化的作用[19]。另外，姜黃素（curcumin，CUR）是從姜黃根莖中提取的主要活性成分，許多研究已經(jīng)表明姜黃素能夠改善脂肪變性、炎癥和纖維化進(jìn)展，并且能在體外阻止HSC 的激活[20]。因此，CUR 在本實(shí)驗(yàn)中作為陽(yáng)性對(duì)照。在本研究中，通過高脂高糖飲食構(gòu)建NAFLD 大鼠模型，在給予SCU 灌胃治療8 周后，發(fā)現(xiàn)不同濃度的SCU 和陽(yáng)性藥物姜黃素治療后大鼠的體重、肝重和肝臟指數(shù)均下降，SCU 高劑量和姜黃素的治療效果較為明顯。為了判斷SCU 對(duì)肝臟組織脂質(zhì)沉積的影響，筆者采用油紅“O”染色后表明，SCU 及姜黃素治療肝臟組織脂滴的面積減少，SCU 顯著改善脂質(zhì)的沉積。Masson 染色的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，SCU 和姜黃素均能減輕膠原纖維的沉積。

在肝臟的膠原纖維的沉積導(dǎo)致的纖維化中，ROS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激扮演關(guān)鍵的角色。目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激是抗氧化劑酶的活性不平衡，導(dǎo)致產(chǎn)生過量的ROS，過度的ROS 生成和積累參與了NAFLD 的進(jìn)展[21]。對(duì)于ROS 的來源，主要是在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中產(chǎn)生，其中線粒體是通過誘導(dǎo)電子運(yùn)輸和解耦聯(lián)而產(chǎn)生ROS 的主要細(xì)胞器[22]。研究表明，NOX 和細(xì)胞色素氧化還原酶的催化作用是生成ROS 的主要方式。NOX 是肝細(xì)胞ROS生成的主要酶，HSC 和kuffer 細(xì)胞是肝臟中NOX表達(dá)的兩個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞，KCs 促進(jìn)NOX2 表達(dá)，HSC 增加NOX1、NOX2 和NOX4 表達(dá)，NOX 的表達(dá)上調(diào)，增加ROS 的合成，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激在肝臟纖維化過程中發(fā)揮著重要作用[23]。因此，筆者在NAFLD 的動(dòng)物模型中，給予SCU 的治療后發(fā)現(xiàn)：NOX2 和NOX4 在NAFLD 的肝臟組織表達(dá)上調(diào)，ROS 在血清和肝臟組織的含量增加。通過不同濃度SCU 和姜黃素治療后：NOX2 和NOX4 在NAFLD 的肝臟組織表達(dá)下調(diào)，ROS 在血清和肝臟組織的含量降低。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAFLD 的肝臟纖維化與NOX2 和NOX4 的表達(dá)增加，促進(jìn)ROS 誘導(dǎo)買的氧化應(yīng)激有關(guān)；SCU 和姜黃素能夠通過下調(diào)NOX2 和NOX4 的蛋白表達(dá)，減少ROS 的合成，抑制氧化應(yīng)激，改善NAFLD 導(dǎo)致的肝臟纖維化。

綜上所述，SCU 能夠減輕NAFLD 的脂質(zhì)代謝紊亂，其機(jī)制可能是降低肝臟組織NOX2 和NOX4 基因的表達(dá)，減少ROS 的合成，抑制ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，改善肝臟的纖維化。該研究將為SCU 治療NAFLD 誘導(dǎo)的肝臟纖維化提供科學(xué)的理論依據(jù)。