張 瑜 ，李夢妍 ，王捍英 ，郭艷芳 ，馬加慶 ，王衛(wèi)群

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2）科技成果孵化中心，云南 昆明 650500）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種單細(xì)胞真菌，是發(fā)酵工業(yè)中常用的菌株之一[1-2]。闡明真菌細(xì)胞壁合成和組裝的機理是真菌在工業(yè)上應(yīng)用和發(fā)展的迫切需要，釀酒酵母被認(rèn)為是研究真菌細(xì)胞壁生物學(xué)反應(yīng)的理想模型。釀酒酵母的細(xì)胞壁是維持細(xì)胞形狀和保護內(nèi)環(huán)境所需的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[3]，當(dāng)釀酒酵母生長、發(fā)育或受到外界環(huán)境的干擾時，細(xì)胞壁的完整性被破壞。此時，細(xì)胞壁以高度調(diào)控和極化的方式重塑，這一過程主要受CWI 信號通路的調(diào)控[4]。YLR358C 是釀酒酵母未知的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。前期研究發(fā)現(xiàn)YLR358C 缺失株對細(xì)胞壁干擾劑敏感，提示YLR358 C 可能參與細(xì)胞壁完整性的調(diào)控[5]。但YLR358C 在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)中的作用機制尚不清楚。本研究觀察釀酒酵母YLR358C缺失對細(xì)胞壁完整性的調(diào)控作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

酵母基因組DNA 提取試劑盒、YPD 培養(yǎng)基組分蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、瓊脂購自上海生工生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞壁干擾劑Calcofluor White （CFW）、剛果紅（CR）和十二烷基硫酸鈉（SDS）分別從BioFroxx 公司和生工生物技術(shù)有限公司獲得。

1.2 菌株和培養(yǎng)條件

野生型釀酒酵母（WT）保存于本實驗室；敲除酵母庫購于Horizon Discovery 有限公司。WT 酵母在YPD 固體和液體培養(yǎng)基中穩(wěn)定繁殖，為了保持遺傳穩(wěn)定性，敲除酵母需要在YPD 培養(yǎng)基中加入200μg/mL G418 進行培養(yǎng)。

1.3 YLR358C 基因敲除株的驗證

將YLR358C 敲除酵母以200 r/min 的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜，離心1 min 收集酵母，用上述試劑盒提取基因組DNA。以獲得的基因組為模板，以A、KanB、KanC 和D 為引物，對YLR358C 敲除酵母進行PCR 驗證，成功敲除的酵母命名為YLR358CΔ。為了探討YLR358C 是否參與釀酒酵母細(xì)胞壁完整性的調(diào)節(jié)，用不同濃度的細(xì)胞壁干擾劑處理YMR253CΔ 和WT 酵母，以檢測兩種酵母菌株的細(xì)胞生長狀態(tài)。

1.4 點板實驗

挑取WT 和YLR358CΔ 酵母單克隆，分別接種于10 mL 的YPD 液體培養(yǎng)基和含有200 μg/mL G418 的YPD 液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u瓶中培養(yǎng)過夜。酵母液離心后，在新鮮的YPD 培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞至OD600=1.0。然后分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，取2.5 μL 的稀釋液斑點于含有不同濃度CFW、SDS、CR 的YPD 板上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 d，觀察生長情況。

1.5 CFW 染色

WT 和YLR358CΔ酵母單克隆在28 ℃、200 r/min 的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至對數(shù)期。離心后，將細(xì)胞重懸于10 mL 含有30 μg/mL CFW 的YPD培養(yǎng)基中。酵母CFW 染色后，將細(xì)胞重懸于適量PBS 中，轉(zhuǎn)移至孔板上，靜置10～15 min 后倒置熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.6 顯微形態(tài)觀察

WT 和YLR358C 敲除酵母在28 ℃和200 r/min恒溫?fù)u瓶下培養(yǎng)過夜。通過透射電子顯微鏡（美國Titan 公司）觀察酵母的顯微形態(tài)。

1.7 轉(zhuǎn)錄組測序與分析

將酵母離心后，提取總RNA，以mRNA 為模板合成并純化cDNA，最后通過PCR 富集獲得最終的cDNA 文庫。對cDNA 文庫進行測序，并將其與指定的參考基因組進行比較，獲得的圖譜數(shù)據(jù)進行文庫質(zhì)量評估及生物信息學(xué)分析。

1.8 酵母總RNA 提取及實時定量PCR

離心收集酵母后，用Trizol 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 并進行實時定量PCR。獲取的結(jié)果使用公式2-ΔΔCt進行計算。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0 軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較用t檢驗，P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 敲除YLR358C 干擾釀酒酵母細(xì)胞壁

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除YLR358C 后釀酒酵母的生長在含CFW、CR 和SDS 的培養(yǎng)基上受到明顯抑制，提示敲除YLR358C 影響釀酒酵母細(xì)胞壁完整性（圖1）。

圖1 敲除YLR358C 提高了釀酒酵母對細(xì)胞壁干擾劑的敏感性Fig.1 The YLR358C knockout increases the sensitivity of S.cerevisiae to cell wall interference reagents

2.2 YLR358CΔ 酵母細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的異常分布

經(jīng)細(xì)胞壁干擾劑CFW 和SDS 處理后發(fā)現(xiàn)，與WT 酵母相比，YLR358CΔ 敲除酵母的幾丁質(zhì)在細(xì)胞壁周圍積累更多（圖2A）。

對WT 菌株和YLR358CΔ 菌株進行了透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞壁呈雙層結(jié)構(gòu)。與WT 酵母相比，電子密度較低的YLR358CΔ 酵母突變體的細(xì)胞壁內(nèi)部結(jié)構(gòu)變?。▓D2B）。上述結(jié)果提示，YLR358CΔ 突變體對細(xì)胞壁干擾更敏感。

圖2 酵母細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)受YLR358C 調(diào)控Fig.2 The chitin in the yeast cell wall is regulated by YLR358C

2.3 YLR358C 調(diào)控多種信號通路

用于轉(zhuǎn)錄組分析的組內(nèi)樣本間相關(guān)系數(shù)R2的最小值為0.947，組間樣本間R2的最大值為0.848（圖3A）。因此，本研究的樣本選取是合理的。利用DESeq2 軟件，以P＜ 0.05，變化倍數(shù)≥2.0 倍為差異表達的閾值，篩選出的差異表達基因共1 659 個，其中下調(diào)基因931 個，上調(diào)基因728 個 （圖3B，3C），YLR358C 敲除后的釀酒酵母差異基因的氣泡圖顯示了KEGG 富集分析結(jié)果（圖3D）。

圖3 R358C 基因敲除和轉(zhuǎn)錄組分析Fig.3 YLR358C knockout and transcriptome analysis

2.4 細(xì)胞壁完整性途徑可能受到Y(jié)LR358C 的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果提示CWI 信號通路中的WSC3、SWI4 和HSP12 等幾個關(guān)鍵因子異常表達。SWI4 和WSC3 mRNA 在YLR358CΔ 酵母中的表達量上調(diào)，其中WSC3 的上調(diào)更為明顯。與WT酵母相比，HSP12 的表達降低（圖4）。

圖4 R358C 調(diào)控細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路中WSC3、SWI4 和HSP12 的表達水平Fig.4 YLR358C regulates the expression levels of WSC3，SWI4，and HSP12 in the cell wall stress response pathway

3 討論

釀酒酵母是一種存在細(xì)胞壁的單細(xì)胞真核生物。當(dāng)酵母細(xì)胞面臨各種環(huán)境壓力時，細(xì)胞壁不斷地重構(gòu)[6-8]。酵母甘露蛋白在改善葡萄酒品質(zhì)方面具有防止渾濁、降低澀味、保留香氣成分、刺激乳酸菌生長等優(yōu)點[9]。因此，明確釀酒酵母細(xì)胞壁相關(guān)基因的作用，可以改變酵母特性，優(yōu)化發(fā)酵工藝，對食品、醫(yī)藥和發(fā)酵行業(yè)具有重要意義[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，YLR358C 基因缺失的釀酒酵母在含有細(xì)胞壁干擾劑的培養(yǎng)基上生長受到抑制。YLR358C 基因敲除株對細(xì)胞壁干擾劑敏感。CFW 染色顯示細(xì)胞壁幾丁質(zhì)合成增加，細(xì)胞側(cè)壁積累過多。轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析表明，YLR358C 基因可能參與了釀酒酵母CWI 信號通路的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)CWI 信號通路中的WSC3、SWI4和HSP12 基因在YLR358CΔ 酵母中異常表達。PCR 結(jié)果顯示，WSC3 和SWI4 在YLR358CΔ酵母中表達上調(diào)，而HSP12 在YLR358CΔ 酵母中表達下調(diào)，這與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)YLR358C 參與細(xì)胞壁完整性的調(diào)節(jié)，其作用可能是通過調(diào)節(jié)CWI 信號通路介導(dǎo)的。對YLR358C 進行更深入的功能和機理研究，希望為食品、醫(yī)藥、發(fā)酵等行業(yè)的發(fā)展提論理論依據(jù)。