楊 偉 ，陳洪艷 ，陳文棟 ，王燕瓊 ，白向鋒

（1）昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科;2）超聲科;3）心臟大血管外科，云南 昆明 650032）

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）是心肌冠狀動脈閉塞后，當血流恢復時再灌注可能導致比缺血本身更嚴重的心肌損傷，包括缺血損傷和再灌注損傷[1]。在心肌缺血再灌注時還會伴隨著大量炎性因子的釋放，當血流再灌注時隨著血液循環(huán)可對未受累心肌細胞造成損傷，也可加重受累心肌細胞的損傷，常常導致嚴重的不良后果，如心力衰竭、心律失常，甚至心臟驟停[2]。

microRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，可與多個靶信使 RNA（mRNA） 結合進而調(diào)節(jié)靶基因的表達，近來有研究顯示miRNAs 在心肌缺血再灌注損傷中起著重要的調(diào)控作用，表明miRNAs 參與了心肌缺血再灌注損傷過程[3]。miR-208a 是一種心肌特異性miRNA，由α-心肌肌球蛋白重鏈基因（Myh6）的內(nèi)含子編碼，可以參與多種心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。在大鼠缺血再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-208a 可引起心肌細胞凋亡增加，沉默miR-208a 可以減輕心肌細胞凋亡和心臟功能障礙[4]。

RNA 結合蛋白（QKI）屬于信號轉導與RNA 活化蛋白家族（signal transduction and activation of RNA，STAR）中的一員，是一類具有信號轉導功能的蛋白質(zhì)，此外還具有與mRNA 結合的功能，QKI 有三種主要亞型，即QKI5、-6 和-7[5]。QKI 蛋白的表達分布及功能在神經(jīng)系統(tǒng)的研究較多，有研究確認該蛋白在腦和心肌中均有高豐度表達，而QKI5 在心臟組織中大量表達，可以抑制缺血/再灌注（I/R）誘導的心肌細胞凋亡[5]。

根據(jù)miRNA 靶基因預測數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)心臟疾病相關基因QKI5 是miR-208a 候選靶基因，因此，筆者初步研究miR-208a 在大鼠心肌缺血再灌注損傷中表達變化對QKI5 的影響，探索miR-208a在MIRI 中的作用機制，為以后心肌缺血再灌注損傷尋找新的治療方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑儀器

miR-208a antagomir（廣州銳博生物有限公司）、Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司）、DNA 逆轉錄試劑盒（日本Takara 公司）、熒光定量檢測試劑（大連寶生物）、蘇木素染色（福建邁新公司）、RTqPCR 試劑盒及相關試劑（廣州東盛生物科技有限公司）、cTnT 及CK-MB 檢測試劑盒（上海佰曄生物公司）、IL-6 及IL-1β 和腫瘤壞死因α（TNFα）試劑盒（上海酶聯(lián)生物公司）、兔抗人QKI5 單克隆抗體（武漢Bioswamp 公司）、RNA 提取分離試劑盒（北京天根生化公司）、伯樂qT-PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）、TUNEL 凋亡試劑盒（ROCHE公司）、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（碧云梯生物研究所）、PVDF 膜（美國Millipore 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組選擇32 只SPF 級的雄性SD 大鼠（6～8 周齡，220～250 g），采用簡單隨機分組將大鼠分為Sham 組、I/R 組、I/R+anta-miRNC 組及I/R+anta-miR-208a 組，每組8 只。實驗動物購自于昆明醫(yī)科大學動物實驗中心，在動物舍中保持約22 ℃的室溫、55%的相對濕度和12 h 的交替光照，清潔養(yǎng)殖和飲用水定期供應。本研究動物實驗及處置符合昆明醫(yī)科大學實驗動物中心動物實驗倫理要求。

1.2.2 實驗動物模型構建稱重SD 大鼠，用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠后，將大鼠固定??；行氣管行插管術后連接RWD-407 小動物呼吸機，設置通氣頻率為60～80 次/min，潮氣量50 mL/kg，呼吸比2∶1，并將針刺電極插入四肢皮下進行全程監(jiān)測大鼠的肢體II 導聯(lián)心電圖（邁瑞）。將SD 大鼠胸前區(qū)去毛后，皮膚擦拭碘伏消毒，縱行切開皮膚在胸骨左緣第3～4 助間處，依次縱深行進。最后將心包剪開，心臟暴露后用6/0 線迅速在距離冠狀動脈前降支（left anteriordescending artery，LAD）的根部約2～3 mm處系一個拌，其間穿過一根塑料管后將拌拉緊，大鼠心電圖ST 段的抬高，缺血區(qū)域的左室壁顏色發(fā)紺或呈淺紅色，并伴有室壁運動減弱。結扎LAD 45 min 后，拔出塑料管，使冠狀動脈恢復血流，隨后迅速關閉胸腔，再灌注120 min。Sham組開胸后即縫合，I/R+anta-miR-NC 組和I/R+anta-miR-208a 組先經(jīng)尾靜脈連續(xù)注射antagomir miR-NC 和miR-208a antagomir 2 d 后于第3 天構建心肌I/R 模型。

1.2.3 實驗動物心功能檢測和標本采集再灌注120 min 后，使用Vivid 7.0 高頻探頭檢測左心室的長軸和靠近胸骨的左心室的短軸，記錄LVEF、LVFS 和SV。并在超聲檢測后常規(guī)麻醉，分離大鼠腹主動脈血液，離心（3 000 r/min，10 min），取血清，編號后存于-20 ℃冰箱內(nèi)，按照酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測心肌損傷標志物CK-MB 及cTnI 和炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α。分離出心臟，一部分置于4%多聚甲醛中固定，另一部分暫存于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.4 HE 染色檢測心肌組織損傷及TUNEL 檢測心肌組織細胞凋亡取留置于多聚甲酸固定的心肌組織，一部分進行常規(guī)的切片制作和HE 染色，另一部分進行TUNEL 染色，嚴格按照試劑盒說明進行操作，光鏡下觀察心肌組織病理變化和心肌組織細胞凋亡。

1.2.5 RT-PCR 檢測心肌組織miR-208a 表達取存于-80℃冰箱內(nèi)的心肌組織，勻漿后根據(jù)miRNA 提取試劑盒的說明書提取缺血心肌組織中總miRNA。再使用miRNA RT-PCR 試劑盒對miR-208a 的3' 末端加多聚A 尾Poly A，并對Poly A 修飾的miR-208a 進行逆轉錄反應生成1st Strand cDNA，再行RT-PCR 反應，操作參照試劑盒說明書。miR-208a 上游引物為 5 '-ATAAGACGAGCAAAAAGCTTGT-3'，下游引物為5 '-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3 '，以U6 為內(nèi)參，采用2-△△CT法檢測miR-208a 的相對表達量，每個樣品重復3 次。

1.2.6 RT-PCR 檢測心肌組織QKI5 mRNA 表達根據(jù)mRNA 提取試劑盒說明書提取缺血心肌組織中總mRNA。再使用mRNA 逆轉錄試劑盒對總mRNA 進行逆轉錄反應生成相應的cDNA，再進行RT-PCR 反應，操作參照試劑盒說明書。QKI5 上游引物5' -AACATTAAATCACCAGCCCT TGC-3'，下游引物為 5' -CAGCTGGCGTAGGA GTACG-3'，并以β-action 為內(nèi)參，采用2-△△CT法檢測QKI5 mRNA 的相對表達量，每個樣品重復3 次。

1.2.7 Western blot 檢測心肌組織中QKI5 和Caspase3 蛋白表達取存于-80 ℃冰箱中的大鼠心肌組織，提取總蛋白，進行凝膠電泳、轉膜，質(zhì)量分數(shù)5%脫脂牛奶室溫封閉30min，加入一抗稀釋液（QKI5，1∶1 000；Caspase3，1∶500），4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加HRP 標記的二抗，室溫孵育1 h，添加化學發(fā)光試劑，于暗室中顯影分析。采用TANON GIS 軟件進行灰度分析，以GAPDH 為內(nèi)參計算總蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間應用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK-q檢驗。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。兩變量之間的相關性采用Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 miR-208a 對I/R 大鼠心臟功能的影響

心臟超聲對心臟功能檢測結果顯示I/R 組大鼠LVEF、LVFS 和SV 值低于Sham 組（P＜ 0.05），I/R+anta-miR-208a 組大鼠的LVEF、LVFS 和SV明顯高于anta-miR-NC 組和I/R 組（P＜ 0.05），而I/R+anta-miR-NC 組與I/R 組大鼠LVEF、LVFS和SV 差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），見圖1。

圖1 miR-208a 對大鼠心臟功能的影響Fig.1 Effect of anta-miR-208a on cardiac function in rats（±s，n=8）

2.2 各組I/R 大鼠心肌組織病理變化

Sham 組大鼠心肌組織HE 染色中未見明顯異常的心肌細胞；而I/R 組和I/R+anta-miR-NC 組中顯示心肌細胞有明顯的的變性壞死，且伴有大量的炎性細胞浸潤；I/R+anta-miR-208a 組中變性壞死的心肌組織細胞較I/R+anta-miR-NC 組和I/R 組明顯減少，見圖2。

圖2 各組心肌組織病理變化（HE ×200）Fig.2 Pathological changes of myocardial tissue in each group （HE ×200）

2.3 miR-208a 對I/R 大鼠心肌損傷標注物和炎性因子的影響

I/R 組大鼠血清中的心肌損傷標志物CK-MB、cTnI 以及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平高于Sham 組（P＜ 0.05），I/R+anta-miR-208a 組血清中的CK-MB、cTnI 以及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 均 低于I/R+anta-miR-NC 組和I/R 組（P＜ 0.05），而I/R+anta-miR-NC 組與I/R 組血清中的心肌標志物CK-MB、cTnI 以及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 miR-208a 對I/R 大鼠心肌損傷標注物和炎性因子的影響Fig.3 Effects of miR-208a expression on myocardial injury makers and inflammatory factors in I/R rats（±s，n=8）

2.4 miR-208a 對I/R 大鼠心肌組織細胞凋亡的影響

采用TUNEL 染色發(fā)現(xiàn)I/R 組大鼠心肌組織細胞的凋亡率高于Sham 組（P＜ 0.05），I/R+antamiR-208a 組大鼠心肌組織細胞的凋亡率低于I/R+anta-miR-NC 組 和 I/R 組（P＜ 0.05），而I/R+anta-miR-NC 組與I/R 組心肌組織細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），見圖4。

圖4 各組心肌組織細胞凋亡情況（TUNEL×200）Fig.4 Apoptosis of myocardial tissue cells in each group （TUNEL×200）（±s，n=8）

2.5 各組心肌組織miR-208a 及QKI5 mRNA 表達水平

利用RT-PCR 檢測各組心肌組織中miR-208a 和QKI5 mRNA 的表達后發(fā)現(xiàn)，與Sham 組相比，I/R 組中miR-208a 的表達水平升高，而QKI5 mRNA 的表達降低（P＜ 0.05）；與I/R+antamiR-NC 組 和I/R 組相比，I/R+anta-miR-208a 組中miR-208a 表達水平下降，QKI5 mRNA 表達水平升高（P＜ 0.05），I/R+anta-miR-NC 組和I/R 組miR-208a 和QKI5 mRNA 的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織miR-208a 和QKI5 mRNA 相對表達水平Fig.5 Relative expression levels of miR-208a and QKI5 mRNAin myocardial tissue of rats in each group（±s，n=8）

2.6 miR-208a 對大鼠心肌組織中QKI5 和凋亡蛋白表達的影響

利用 Western blot 檢測4 組大鼠心肌組織中QKI5 蛋白和凋亡信號通路蛋白Caspase3 的表達水平。與Sham 組相比，I/R 組QKI5 蛋白的表達水平降低，而Caspase3 蛋白的表達明顯升高（P＜0.05），與I/R+anta-miR-NC 組和I/R 組相比，I/R+anta-miR-208a 組中QKI5 的蛋白表達增加，而Caspase3 蛋白的表達降低（P＜ 0.05），I/R+anta-miRNC 組和I/R 組蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 各組大鼠心肌組織中蛋白的相對表達Fig.6 Relative expression levels of protein in myocardial tissue of rats in each group（±s，n=8）

2.7 miR-208a 與QKI5 的相關性分析

使用DIANA 數(shù)據(jù)庫預測了QKI5 可能是miR-208a 的靶基因（圖7A），通過對兩者的表達相關性分析發(fā)現(xiàn)，miR-208a 與QKI5 蛋白表達呈負相關，miR-208a 表達越高，QKI5 表達越低（P＜0.05），說明miR-208a 可以調(diào)控QKI5 在心肌I/R中發(fā)揮作用（圖7B）。

圖7 miR-208a 和QKI5 的相關性Fig.7 Correlation between miR-208a and QKI5

3 討論

MIRI 是心血管疾病中常見的臨床病理現(xiàn)象，多發(fā)生于經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術（PCI）、冠脈搭橋術、體外循環(huán)下的心臟直視手術等冠脈血流恢復過程中。MIRI 涉及鈣超載、炎癥反應、氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、線粒體功能障礙和蛋白酶激活等[6]。目前臨床上還沒有預防和治療心肌缺血再灌注損傷的特效藥物和方法。miR-208a 屬于MyomiRs 家族，具有心臟特異性，幾乎只在心臟表達[4]。在體內(nèi)外實驗以及臨床研究中均發(fā)現(xiàn)在心肌缺血再灌注損傷時組織或血清中miR-208a有著明顯的升高，其升高的水平與心肌損傷的程度相關[7-9]。本研究中也探討了miR-208a 在I/R大鼠心肌中的表達變化，結果顯示在I/R 大鼠心肌組織中miR-208a 表達較Sham 組明顯增加，而給予miR-208a antagomir 后可以降低I/R 大鼠心肌組織中miR-208a 的表達，且miR-208a 在心肌組織中的表達變化和心肌損傷標志物CK-MB、cTnI 的水平基本一致。CK-MB、cTnI 是臨床判斷心肌損傷常用的指標，廣泛存在于心肌細胞中，可以反應心肌細胞損傷的程度。本研究結果表明，抑制miR-208a 表達時可以降低血清中CK-MB、cTnI 水平，改善缺血再灌注損傷大鼠的心臟功能，同時可以減輕I/R 損傷大鼠心肌組織病理變化，降低心肌細胞的凋亡。

由于miR-208a 在MIRI 過程中對心肌細胞凋亡起著重要作用，筆者進一步研究了它的下游通路，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)QKI5 可能是miR-208a 的靶基因。有研究[10-11]發(fā)現(xiàn)QKI5 是主要的心臟內(nèi)源性保護蛋白，可以抑制FOXO1 的表達，這是一種重要的轉錄因子，可以調(diào)節(jié)心肌細胞的代謝、增殖、氧化應激、免疫功能和細胞死亡。在增加QKI5 表達時，可以降低心肌組織中導致細胞凋亡的因子Bax、Cas-3 以及FOXO1 的表達，從而可以減輕心肌細胞的損傷。在本究中同樣發(fā)現(xiàn)抑制miR-208a 可以增加心肌組織中QKI5 的表達，減輕大鼠MIRI。在心肌缺血時可激活炎癥反應系統(tǒng)，急性炎癥反應又引起繼發(fā)性心肌損傷，而再灌注又加重心肌急性炎癥反應的程度，心肌缺血再灌注引起機體炎癥反應激活炎癥細胞釋放IL-1β、IL-6 和TNF-α 等大量炎性因子，而這三種因子是機體嚴重炎癥反應的關鍵因子，可以加重心肌功能紊亂、組織纖維化和心肌細胞的壞死[12]。過度炎癥刺激導致心肌細胞凋亡級聯(lián)途徑激活，促進凋亡蛋白Cas-3 的表達和激活。Cas-3 可以水解各種細胞內(nèi)蛋白質(zhì)并引起細胞凋亡。此外，心肌細胞中Bax 和Bcl2 表達水平的比值也隨著炎癥水平的增加而增加，從而促進心肌細胞的凋亡[13]。本研究結果顯示I/R 大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平高于Sham 組，表明心肌缺血再灌注大鼠體內(nèi)存在持續(xù)性炎癥反應，與相關文獻報道[14]一致，而抑制miR-208a 表達可以有效降低炎性因子水平及心肌組織中凋亡蛋白Cas-3 的表達，減輕心肌組織缺血區(qū)域細胞的壞死和炎性細胞的浸潤，增加心肌組織中QKI5 蛋白的表達，從而達到保護I/R 大鼠心肌細胞的作用。

在大鼠MIRI 模型中QKI5 的表達水平顯著降低，而給與miR-208a 抑制劑后QKI5 出現(xiàn)明顯升高，這說明兩者之前存在調(diào)控關系，QKI5 可能是miR-208a 在MIRI 過程中的靶基因。筆者利用Western blot 檢測了QKI5 的蛋白表達水平，與mRNA 表達相似，QKI5 蛋白在MIRI 中表達下降。通過分析miR-208a 和QKI5 蛋白表達的相關性分析發(fā)現(xiàn)miR-208a 與QKI5 表達呈負相關，miR-208a 表達越低，QKI5 表達越高，說明miR-208a很可能是通過QKI5 在MIRI 中發(fā)揮作用的。

本研究初步探索了miR-208a 在大鼠MIRI 中的作用及機制，提示其可能是通過調(diào)控QKI5 蛋白的表達在心肌缺血再灌注中發(fā)揮作用的，這可能成為心肌缺血再灌注損傷一種新的有前途的治療靶點。但是本研究仍存在一點局限性，目前只是在動物模型中發(fā)現(xiàn)兩者相關，未進行雙熒光素酶實驗進行驗證，在后續(xù)的研究中筆者將進一步深入研究。