沈 紅 ，華海蓉 ，高麗萍 ，何易曉 ，楊學(xué)智 ，曾祥菲 ，王 芳 ，宋精玲

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，云南 昆明 650500;2）昭通市第一人民醫(yī)院病理科，云南 昭通 657000;3）電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，綿陽市中心醫(yī)院病理科，四川 綿陽 621000;4）四川大學(xué)華西醫(yī)院臨床病理科，四川 成都 610000;5）昆明醫(yī)科大學(xué)電鏡室，云南 昆明 650500）

大腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是消化道最多見的惡性腫瘤之一[1]，近年來發(fā)病率呈總體上升態(tài)勢。由于大部分癌前病變發(fā)展為結(jié)直腸癌需要較長的時(shí)間（約10 a），早期癥狀又不明顯，故不易被發(fā)現(xiàn)，在明確診斷前大多數(shù)患者多被延誤3～6 個(gè)月或更長，甚至被誤診為慢性腸炎、肛瘺等疾病，從而喪失最好的治療時(shí)機(jī)。所以，大腸癌的預(yù)防、篩查、早期診斷及治療顯得非常重要。

結(jié)直腸癌是最合適選擇篩查和預(yù)防的腫瘤，有效的篩查可以提高癌癥的一級(jí)預(yù)防。已證實(shí)，大腸癌篩查能通過切除其癌前病變腺瘤性息肉來阻止疾病發(fā)生和發(fā)展，極大地降低患者的死亡率[2-3]。因此，找到一種對大腸癌靈敏度和特異度較高的分子生物學(xué)標(biāo)記物，獲得操作方便、成本低、效益好、臨床實(shí)操性強(qiáng)的篩查方法，用于大腸癌的早期臨床檢測和人群普查，使腺瘤等癌前病變和早期大腸癌得以發(fā)現(xiàn)，而不至于耽誤病情，降低大腸癌的發(fā)生率和患者死亡率就顯得尤為重要。

大分子外部抗原（large external antigen，LEA）是一種膜表面腫瘤相關(guān)抗原，分子量 ＞ 500 KD[4]，其抗原決定簇位于抗原的糖鏈部分上，成分為唾液酸[5-6]，由細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，并可排泌到細(xì)胞外，在大腸癌患者的血清和腹水中能夠被檢測到。分化抗原簇75（cluster of differentiation antigen 75，CDw75）是由β-半乳糖苷α-2，6 唾液酸轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的糖綴合物唾液酸化的產(chǎn)物，部分學(xué)者通過研究CDw75 與胃癌的關(guān)系得出：被唾液酸化的CDw75 與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)用免疫組化方法對人正常大腸黏膜、大腸腺瘤、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移大腸腺癌及淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移大腸腺癌組織進(jìn)行LEA 及CDw75 表達(dá)檢測，并分析LEA、CDw75 表達(dá)趨勢與大腸腺癌及其預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源樣本選自昆明醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室尸檢及昭通市第一人民醫(yī)院2008 年1 月～2012 年12 月期間進(jìn)行手術(shù)切除、臨床資料完整的存檔蠟塊，共126 例。其中，正常大腸黏膜11 例、大腸腺瘤43 例、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移大腸腺癌51 例、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移大腸腺癌21 例。所有標(biāo)本均由2 位病理學(xué)專家復(fù)閱，尸檢結(jié)腸黏膜組織來源者均無結(jié)直腸的病變，大腸腺癌標(biāo)本剔除了黏液腺癌和印戒細(xì)胞癌。腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)按2019 年消化系統(tǒng)腫瘤WHO 分類[7]進(jìn)行。所有大腸腺癌患者術(shù)前和術(shù)后均未進(jìn)行放療和化療。入圍大腸腺癌患者均以電話方式進(jìn)行隨訪，隨訪日期自病理報(bào)告確診日期算起，至2021 年12 月31 日，并嚴(yán)格記錄隨訪情況，72 例大腸腺癌患者隨訪到45 例，失訪27 例；隨訪結(jié)局定義為死亡。

1.1.2 主要試劑ND-1 抗體購自Abcam，LN-1抗體購自SANTA cruz biotechnology，UltraSensitiveTM即用型超敏試劑盒（兔）、UltraSensitiveTM即用型超敏試劑盒（鼠）、DAB 顯色加強(qiáng)型試劑盒、EDTA型抗原修復(fù)緩沖液等購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 方法

HE 及免疫組化：所有標(biāo)本均為10%福爾馬林固定、石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色和免疫組化染色，免疫組化染色方法按試劑盒說明進(jìn)行。ND-1 抗體（檢測LEA）和LN-1 抗體（檢測CDw75）的稀釋濃度均為1∶250。LEA、CDw75 的陽性表達(dá)物呈淡黃～棕黃色顆粒，主要位于細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)，散在或成團(tuán)分布。采用雙盲法觀察切片，以半定量積分法[8]判斷結(jié)果，評分由陽性細(xì)胞百分比及陽性強(qiáng)度綜合評判得出。（1）陽性細(xì)胞百分比：陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞ 75%為4 分；（2）陽性強(qiáng)度：無色為0 分，淡黃色為1 分，黃色為2 分，棕黃色為3 分。最終評分=陽性比率評分×陽性強(qiáng)度評分：0 分為陰性（-），1～4 分為弱陽性（+），5～8 分為陽性（++），9～12 分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件包，采用Nonparametric Tests 中的Independent Samples 過程用于半定量積分計(jì)數(shù)資料；采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)用于多樣本間總體比較；各組之間行Mann-Whitney 兩兩比較，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；生存分析使用Cox 回歸模型。

2 結(jié)果

2.1 病例資料

11 例正常大腸黏膜組織標(biāo)本（來源于尸檢材料），年齡23～75 歲，平均57 歲；43 例大腸腺瘤組織標(biāo)本，年齡27～75 歲，平均58 歲；51 例淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移大腸腺癌組織，年齡33～75 歲，平均55 歲；21 例淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移大腸腺癌組織，年齡23～75 歲，平均56 歲。高分化癌26 例，中分化癌28 例，低分化癌18 例。管狀腺瘤26 例，絨毛狀腺瘤17 例。

2.2 LEA 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺癌組織中的表達(dá)

LEA 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺癌組織中均有不同程度的陽性表達(dá)（圖1～圖4），且陽性表達(dá)有逐漸增強(qiáng)的態(tài)勢，正常大腸黏膜、大腸腺瘤與大腸腺癌（包括淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，P=0.006）；淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的大腸腺癌組織的陽性表達(dá)率雖略高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移的大腸腺癌組織，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）；LEA 在高分化大腸腺癌中的表達(dá)低于中、低分化大腸腺癌，且高分化與中、低分化大腸腺癌之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001 和P=0.000），LEA 在管狀腺瘤與絨毛狀腺瘤的表達(dá)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023），見圖5～圖7 及表1～表3。

表1 LEA 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺癌中的表達(dá)（n）Tab.1 The expression of LEA in normal colorectal mucosa，colorectal adenoma and colorectal carcinoma （n）

表2 LEA 在不同分化程度大腸腺癌中的表達(dá)（n）Tab.2 The expression of LEA in colorectal adenocarcinoma with different degrees of differentiation （n）

表3 LEA 在大腸腺瘤中的表達(dá)（n）Tab.3 The expression of LEA in colorectal adenoma （n）

圖1 正常大腸黏膜LEA 呈弱陽性表達(dá)（SP×200）Fig.1 The weakly positive expression of LEA in normal colorectal mucosa （SP×200）

圖2 大腸腺瘤LEA 呈陽性表達(dá)（SP×200）Fig.2 The positive expression of LEA in colorectal adenoma （SP×200）

圖3 淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移大腸腺癌LEA 呈強(qiáng)陽性表達(dá)（SP×200）Fig.3 The strong positive expression of LEA in colorectal adenocarcinoma without regional lymph node metastasis （SP×200）

圖4 淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移大腸腺癌LEA 呈強(qiáng)陽性表達(dá)（SP×200）Fig.4 The strong positive expression of LEA in colorectal adenocarcinoma with regional lymph node metastasis （SP×200）

圖5 LEA 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸腺癌組織中的表達(dá)分布Fig.5 Distribution of LEA expression in normal colorectal mucosa, colorectal adenoma and colorectal adenocarcinoma

圖6 LEA 在不同分化程度大腸腺癌中的表達(dá)分布Fig.6 Distribution of LEA expression in colorectal adenocarcinoma with different degrees of differentiation

圖7 LEA 在大腸腺瘤中的表達(dá)分布Fig.7 Distribution of LEA expression in colorectal adenoma

2.3 CDw75 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺癌組織中的表達(dá)

CDw75 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺癌組織中均有不同程度的陽性表達(dá)（圖8～圖11），且陽性表達(dá)有逐漸增強(qiáng)的態(tài)勢，正常大腸黏膜、大腸腺瘤與大腸腺癌（包括淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，P=0.007），淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的大腸腺癌組織的陽性表達(dá)率雖略高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移的大腸腺癌組織，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）；CDw75 在高分化大腸腺癌中的表達(dá)低于中、低分化大腸腺癌，且高分化與中、低分化大腸腺癌之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 和P=0.001），CDw75 在管狀腺瘤與絨毛狀腺瘤的表達(dá)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），見圖12～圖14 及表4～表6。

表4 CDw75 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺癌中的表達(dá)（n）Tab.4 The expression of CDw75 in normal colorectal mucosa，colorectal adenoma and colorectal carcinoma （n）

表5 CDw75 在不同分化程度大腸腺癌中的表達(dá)（n）Tab.5 The expression of CDw75 in colorectal adenocarcinoma with different degrees of differentiation （n）

表6 CDw75 在大腸腺瘤中的表達(dá)（n）Tab.6 The expression of CDw75 in colorectal adenoma （n）

圖8 正常大腸黏膜CDw75 呈弱陽性表達(dá)（SP×200）Fig.8 The weakly positive expression of CDw75 in normal colorectal mucosa （SP×200）

圖9 大腸腺瘤組織CDw75 呈陽性表達(dá)（SP×200）Fig.9 The positive expression of CDw75 in colorectal adenoma （SP×200）

圖10 淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移的大腸腺癌組織CDw75 呈強(qiáng)陽性表達(dá)（SP×200）Fig.10 The strong positive expression of CDw75 in colorectal adenocarcinoma without regional lymph node metastasis （SP×200）

圖11 淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的大腸腺癌組織CDw75 呈強(qiáng)陽性表達(dá)（SP×200）Fig.11 The strong positive expression of CDw75 in colorectal adenocarcinoma with regional lymph node metastasis （SP×200）

圖12 CDw75 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸腺癌組織中的表達(dá)分布Fig.12 Distribution of CDw75 expression in normal colorectal mucosa, colorectal adenoma and colorectal adenocarcinoma

圖13 CDw75 在不同分化程度的大腸腺癌中的表達(dá)分布Fig.13 Distribution of CDw75 expression in colorectal adenocarcinoma with different degrees of differentiation

圖14 CDw75 在大腸腺瘤中的表達(dá)分布Fig.14 Distribution of CDw75 expression in colorectal adenoma

2.4 生存分析

納入生存分析的病例數(shù)共45 例，生存27 例，死亡18 例。Cox 回歸分析中可用案例加權(quán)后為1 086（占比42.2%），刪失案例加權(quán)后為1 486（占比57.8%）；刪除案例中，帶有缺失值的案例、帶有負(fù)時(shí)間的案例、層中最早事件之前刪失的案例均為0。加權(quán)規(guī)則為年齡。

將患者生存時(shí)間的影響因素采用Cox 回歸分析，協(xié)變量為患者性別、年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、LEA 和CDw75 表達(dá)情況，采用向前法進(jìn)行變量篩選，結(jié)果顯示患者性別、年齡、臨床分期、LEA 和CDw75 表達(dá)是影響大腸腺癌患者預(yù)后的因素。年齡越大、臨床分期越高、LEA 和CDw75 表達(dá)越強(qiáng)，患者死亡風(fēng)險(xiǎn)越大；男性患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)大于女性患者，見表7 和圖15。

圖15 各協(xié)變量的均值水平的生存曲線Fig.15 Survival curves for the mean level of each covariate

表7 多因素 COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型Tab.7 Multivariate COX proportional hazards regression model

3 討論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類膳食結(jié)構(gòu)的改變，膳食纖維在人們?nèi)粘ｏ嬍持械谋壤遮厹p少，導(dǎo)致大腸腺癌發(fā)病率逐年上升。有數(shù)據(jù)顯示，世界上大腸腺癌正以2 %的平均速率呈連年上升趨勢[9]，而在中國，大腸腺癌的發(fā)病增長率是國際水平的2 倍有余[10]，因此，大腸腺癌已成為嚴(yán)重威脅國人健康的危險(xiǎn)因素之一。

從大腸腺瘤發(fā)展到大腸腺癌約7～l2 a[11]。要提高人類大腸腺癌的生存時(shí)限，唯有找到能及時(shí)發(fā)現(xiàn)、早期篩查大腸腺癌的診斷方法，或?qū)Υ竽c腺癌具有特異性的分子生物學(xué)指標(biāo)。

3.1 LEA 在臨床病理中的應(yīng)用

據(jù)近幾年的研究報(bào)道，LEA 是中、高分化大腸腺癌特異性較強(qiáng)的腫瘤相關(guān)抗原[5-6]。同時(shí)，眾多實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，LEA 也存在于絨毛狀腺瘤和重度異型腺瘤組織中，其含量與大腸絨毛狀腺瘤組織中絨毛的數(shù)量和腺瘤細(xì)胞分化程度有關(guān)，伴隨絨毛數(shù)量的增多、腺瘤細(xì)胞分化程度降低，LEA 含量逐漸增多，并與大腸腺癌中的含量逐漸接近，說明，在大腸腺瘤組織與大腸腺癌組織中含有共同的LEA 抗原[12]。筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示絨毛狀腺瘤中LEA 表達(dá)增多，因此，對大腸腺瘤組織進(jìn)行LEA 檢測，或有助于預(yù)測大腸腺瘤的惡變傾向，對早期發(fā)現(xiàn)大腸腺癌提供又一新的檢測指標(biāo)。

已報(bào)道可用于大腸腺癌診斷的血清腫瘤標(biāo)記物主要有CEA、CA19-9、CA50、CA242 等，這些腫瘤相關(guān)抗原的血清學(xué)檢查均已普遍地應(yīng)用于大腸腺癌的臨床診斷和普查。其中，CEA 的應(yīng)用最廣泛，但CEA 的特異性不強(qiáng)，在大腸腺癌及其他腫瘤患者的血清中均可升高[13-14]。對某些內(nèi)胚層來源的非大腸腺癌組織進(jìn)行單克隆抗體ND-1對LEA 的特異性識(shí)別實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LEA 在內(nèi)胚層來源的非大腸腺癌組織中的表達(dá)陽性率要明顯低于大腸腺癌組織[15]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LEA 在大腸腺癌發(fā)生發(fā)展過程中表達(dá)逐漸升高，且在不同分化程度大腸腺癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，筆者認(rèn)為LEA在大腸腺癌發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。

3.2 CDw75 在臨床病理中的應(yīng)用

CDw75 是一種人白細(xì)胞表面抗原，位于具有免疫球蛋白陽性表達(dá)的成熟B 淋巴細(xì)胞表面，是β-半乳糖苷α-2，6 唾液酸轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的糖綴合物唾液酸化產(chǎn)物[16-20]。大多數(shù)惡性腫瘤患者死亡的直接原因是腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[19]，而癌細(xì)胞之所以能發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，是由于細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂的組成及結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生變化[16-17]。有研究顯示，細(xì)胞表面的糖綴合物與細(xì)胞的增生、黏附、轉(zhuǎn)移能力和免疫原性有重要關(guān)系[16-18]。其機(jī)理[21-22]可能是唾液酸降低了腫瘤細(xì)胞與Ⅳ型膠原的黏附、封閉了抗原決定簇、阻礙自然殺傷細(xì)胞的活性，并通過延長血漿中糖綴合物的半衰期誘導(dǎo)免疫耐受。

在胃腸道腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，CDw75 在胃黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)是其惡性轉(zhuǎn)化和侵襲的標(biāo)志，也是一個(gè)獨(dú)立的胃癌預(yù)后因子[23]。有研究顯示，CDw75 并不是β-半乳糖苷α-2，6 唾液酸轉(zhuǎn)移酶本身，而是β-半乳糖苷α-2，6 唾液酸轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的糖綴合物唾液酸化產(chǎn)物。被唾液酸化的糖綴合物與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[18,24-25]。

在本研究中，CDw75 在11 例大腸黏膜組織中只有1 例（9.09%）為陽性表達(dá)，而在72 例大腸腺癌組織中有51 例（70.83%）呈陽性表達(dá)，但將51 例淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移大腸腺癌和21 例淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的大腸腺癌的CDw75 結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CDw75 與大腸腺癌是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本次研究認(rèn)為LEA、CDw75 在大腸腺癌發(fā)生發(fā)展過程中有一定作用；患者性別、年齡、臨床分期、LEA 和CDw75 表達(dá)是影響大腸腺癌患者預(yù)后的因素，年齡愈大、臨床分期愈高、LEA 和CDw75 表達(dá)越強(qiáng)，患者死亡風(fēng)險(xiǎn)愈大；女性患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)小于男性患者。在本次生存分析中顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者小，筆者考慮可能是因?yàn)殡S訪到的有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例數(shù)較少所致[因?yàn)閺乃劳雎实恼急葋碇v，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的死亡率（50%，5/10）高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的死亡率（37.14%，13/35）]。