閆元春，馮云霞，馬丹

(鄭州原理生物科技有限公司，鄭州 450000)

氯乙酰氯是一種重要的化學(xué)合成中間體，可以合成一系列醫(yī)藥化工產(chǎn)品[1-4]。氯乙酰氯及其同系物具有基因毒性[5-9]。筆者以氯乙酰氯合成鹽酸利多卡因過(guò)程作為研究對(duì)象，跟蹤檢測(cè)氯乙酰氯中相關(guān)雜質(zhì)的傳遞情況。氯乙酰氯中可能存在的雜質(zhì)主要有氯乙酸、二氯乙酰氯、三氯乙酰氯等，多批樣品分析結(jié)果表明，二氯乙酰氯是其中的主要雜質(zhì)成分，乙酰氯和三氯乙酰氯的含量極低，同時(shí)跟蹤檢測(cè)氯乙酰氯與2，6-二甲基苯胺反應(yīng)產(chǎn)物中的雜質(zhì)情況及后續(xù)反應(yīng)產(chǎn)物中的雜質(zhì)情況，發(fā)現(xiàn)只需檢測(cè)并控制氯乙酰氯中二氯乙酰氯的含量不超標(biāo)，即可以確保其它微量雜質(zhì)的含量符合要求，因此測(cè)定氯乙酰氯中二氯乙酰氯的含量具有重要意義。

文獻(xiàn)[9-14]報(bào)道的檢測(cè)方法主要集中在氯乙酰氯的檢測(cè)，僅有文獻(xiàn)[14]報(bào)道了氯乙酰氯中二氯乙酰氯的測(cè)定，但該方法存在出峰時(shí)間長(zhǎng)，單個(gè)樣品需耗時(shí)120 min；產(chǎn)生大量的廢液；衍生樣品直接進(jìn)樣，對(duì)色譜柱存在較大的損傷；采用末端吸收210 nm 進(jìn)行檢測(cè)，色譜峰干擾大等缺點(diǎn)，因此尋找一種能準(zhǔn)確定量、檢測(cè)時(shí)間短、色譜峰干擾小且對(duì)色譜柱損傷小的檢測(cè)方法十分必要。

根據(jù)氯乙酰氯生產(chǎn)工藝及跟蹤檢測(cè)多批次二氯乙酰氯的衍生雜質(zhì)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)氯乙酰氯中二氯乙酰氯的含量低于0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，可保證終產(chǎn)品鹽酸利多卡因原料藥中二氯乙酰氯的衍生基因毒性雜質(zhì)2，2-二氯-N-(2，6-二甲基苯基)乙酰胺的含量低于0.024%。筆者根據(jù)氯乙酰氯易成酯的特性，先采用正丁醇對(duì)氯乙酰氯及其中的雜質(zhì)二氯乙酰氯進(jìn)行衍生，生成氯乙酸正丁酯和二氯乙酸正丁酯，然后對(duì)對(duì)衍生化反應(yīng)后的溶液用氫氧化鈉溶液進(jìn)行滴定中和，并對(duì)衍生時(shí)間、衍生溫度、取樣體積和衍生后的樣品溶液放置時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了柱前衍生氣相色譜法測(cè)定氯乙酰氯中二氯乙酰氯的方法。該方法提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)能耗，可對(duì)氯乙酰氯中二氯乙酰氯的含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：Agilent 7890B 型，配有氫火焰離子化(FID)檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

電子天平：MS 105 型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司。

恒溫水浴鍋：HH-ZK4 型，河南佰澤儀器有限公司。

正丁醇：分析純，天津化學(xué)試劑一廠。

氫氧化鈉：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。

百里香酚酞：指示劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

無(wú)水乙醇：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。

二氯乙酸正丁酯對(duì)照品：純度為99%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，批號(hào)為20200803B1-1，鄭州原理生物科技有限公司。

氯乙酸正丁酯對(duì)照品：分析純，純度為97%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，批號(hào)為P1034352，上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司[15]。

氯乙酰氯樣品：批號(hào)為20191204，寧夏榮泰生物科技有限公司。

高純氮?dú)猓杭兌葹?9.999%(體積分?jǐn)?shù))，河南科益氣體股份有限公司。

1.2 溶液的配制

空白溶液：取50 mL 錐形瓶，加入5.0 mL 正丁醇，在60 ℃水浴中加熱30 min，冷卻后加入百里香酚酞指示劑2 滴，用1 mol/L 氫氧化鈉溶液滴定至溶液呈藍(lán)色，靜置分層，取上層溶液，作為空白溶液。

樣品溶液：取50 mL 錐形瓶，加入4.2 mL 正丁醇，然后加入氯乙酰氯樣品0.8 mL(約1.0 g)，在60℃水浴中加熱30 min，冷卻后加入百里香酚酞指示劑2 滴，用1 mol/L 氫氧化鈉溶液滴定至溶液呈藍(lán)色，靜置分層，取上層溶液，作為樣品溶液。

二氯乙酰氯對(duì)照品溶液：40 mg/mL，取二氯乙酸正丁酯(二氯乙酰氯衍生物)對(duì)照品約1 000 mg，精密稱(chēng)定，置于25 mL 容量瓶中，用正丁醇稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻。

二氯乙酰氯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：移取二氯乙酰氯對(duì)照品溶液2、3、4、5、6 mL，分別置于5 只100 mL 容量瓶中，用正丁醇稀釋并定容至標(biāo)線，配制成質(zhì)量濃度分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

氯乙酰氯對(duì)照品溶液：40 mg/mL，取氯乙酸正丁酯(氯乙酰氯衍生物)對(duì)照品1 000 mg，精密稱(chēng)定，置于25 mL 容量瓶中，用正丁醇稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻。

二氯乙酰氯、氯乙酰氯混合對(duì)照品溶液：質(zhì)量濃度均為1.6 mg/mL，分別精密量取上述二氯乙酰氯對(duì)照品溶液、氯乙酰氯對(duì)照品溶液各1 mL，置于同一只25 mL 容量瓶中，用正丁醇稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻。

1.3 色譜條件

色譜柱：SE-30 型毛細(xì)管柱(30 m×0.53 mm，7.0 μm，蘭州中科安泰分析科技有限公司)；載氣：高純氮?dú)?；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比為40∶1；柱箱升溫程序：初始溫度為170 ℃，保持5 min，以20 ℃/min 速率升溫至200 ℃，保持10 min；檢測(cè)器溫度：250 ℃；進(jìn)樣體積：0.2 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化反應(yīng)條件選擇

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間和溫度

設(shè)定反應(yīng)溫度分別為55、60、65 ℃，反應(yīng)時(shí)間分別為10、20、30、40 min，按1.2 方法配制樣品溶液并進(jìn)行衍生化處理，測(cè)定不同樣品中二氯乙酸正丁酯的含量。以最終確定方法測(cè)定的樣品中二氯乙酸正丁酯的色譜峰面積值為參照，將各條件下測(cè)定的二氯乙酸正丁酯的色譜峰面積與參照色譜峰面積進(jìn)行比較，得到不同條件下二氯乙酰氯的回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，衍生化溫度對(duì)二氯乙酰氯的回收率無(wú)顯著影響，反應(yīng)時(shí)間對(duì)二氯乙酰氯的回收率影響較大。在反應(yīng)時(shí)間達(dá)到30 min 后，二氯乙酰氯的回收率均大于98.0%，故選擇在60 ℃下衍生30 min 作為衍生條件。

表1 不同反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度時(shí)的回收率

2.1.2 取樣體積和樣品溶液放置時(shí)間

分別取0.4、0.6、0.8、1.0 mL 樣品，加入適量正丁醇，使總體積為5 mL，置于60 ℃水浴中，按1.2方法，每種濃度水平平行配制3 份樣品溶液并進(jìn)行衍生化處理，在1.3 色譜條件下測(cè)定，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，當(dāng)取樣體積為0.4、0.6 mL 時(shí)，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均大于10%；當(dāng)取樣體積為0.8、1.0 mL 時(shí)，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。綜合考慮測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性和色譜柱的耐受性，最終選擇取樣體積為0.8 mL(約1.0 g)。

按照1.2 方法配制樣品溶液，分別于配制完成后第0、5、10、15、30 min 測(cè)定溶液的色譜峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，隨著樣品溶液放置時(shí)間的延長(zhǎng)，色譜峰面積逐漸減小，因此應(yīng)盡量縮短樣品放置時(shí)間。因滴定完成后樣品略顯渾濁，需靜置分層，綜合考慮，樣品溶液配制完成后應(yīng)在5 min 內(nèi)取樣測(cè)定，即樣品溶液放置時(shí)間為5 min。

表2 樣品溶液不同放置時(shí)間的色譜峰面積

2.2 色譜條件選擇

分別選擇常用的氣相色譜柱SE-30 柱(30 m×0.53 mm，7.0 μm，蘭州中科安泰分析科技有限公司)、DB-WAX 柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm，安捷倫科技有限公司)、DB-624柱(30 m×0.32 mm，1.8 μm，安捷倫科技有限公司)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，采用SE-30 柱時(shí)，色譜峰的理論塔板數(shù)大于20 000，各峰的拖尾因子均約為1.0，氯乙酰氯和二氯乙酰氯的分離度大于2.0，各峰的響應(yīng)值較好，滿(mǎn)足檢測(cè)需要，因此選擇SE-30 柱(30 m×0.53 mm，7.0 μm)。

依據(jù)氯乙酰氯的沸點(diǎn)和出峰時(shí)間，保證在分離度和響應(yīng)值符合檢測(cè)要求的情況下，以樣品于20 min 內(nèi)出峰作為篩選目標(biāo)，對(duì)初始柱溫和升溫程序進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)1.3。

2.3 色譜圖

分別移取空白溶液、加標(biāo)樣品溶液和二氯乙酰氯、氯乙酰氯混合對(duì)照品溶液，按1.3 色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖如圖1 所示。由圖1 可以看出，空白溶液在二氯乙酰氯衍生物保留時(shí)間附近無(wú)色譜峰，說(shuō)明樣品基質(zhì)不干擾二氯乙酰氯的檢測(cè)；加標(biāo)樣品溶液和混合對(duì)照品溶液中氯乙酸正丁酯和二氯乙酸正丁酯色譜保留時(shí)間分別為11.637、13.723 min，二者的分離度為10.3，表明分離效果良好。

圖1 空白溶液、樣品溶液、混合對(duì)照品溶液色譜圖

2.4 線性關(guān)系

按照1.3 色譜條件，分別對(duì)二氯乙酰氯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣測(cè)定，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)、對(duì)應(yīng)的二氯乙酰氯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，二氯乙酰氯的質(zhì)量濃度在0.8～2.4 mg/mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.039 7x-2.318 1，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。

2.5 檢出限與定量限

取質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL 的二氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用正丁醇逐級(jí)稀釋?zhuān)?.3 色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)二氯乙酸正丁酯色譜峰的信噪比為10時(shí)，對(duì)應(yīng)的二氯乙酸正丁酯質(zhì)量濃度即為二氯乙酰氯的定量限，定量限為29.77 μg/mL；取二氯乙酰氯的定量限溶液，用正丁醇稀釋并測(cè)定，當(dāng)色譜峰信噪比為3 時(shí)，對(duì)應(yīng)的二氯乙酸正丁酯的質(zhì)量濃度即為二氯乙酰氯的檢出限，檢出限為8.93 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

平行取6 份樣品，按1.2 方法制備樣品溶液，在1.3 色譜條件下測(cè)定二氯乙酰氯的質(zhì)量濃度。根據(jù)取樣量和定容體積，換算成樣品中的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，6 份樣品溶液中二氯乙酰氯的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.42%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%，表明該方法精密度良好。

表3 精密度試驗(yàn)二氯乙酰氯質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果 %

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取50 mL 錐形瓶，分別加入3.6、3.4、3.2 mL 正丁醇，再各加入0.8 mL(約1.0 g)氯乙酰氯樣品，然后分別加入0.6、0.8、1.0 mL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL的二氯乙酰氯對(duì)照品溶液，按1.2 方法制備加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為1.2、1.6、2.0 mg/mL 的樣品溶液，每種加標(biāo)質(zhì)量濃度水平的樣品平行制備3 份，在1.3 色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算二氯乙酰氯的回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4 可知，二氯乙酰氯的回收率為103.29%～111.99%，表明該方法準(zhǔn)確度較好。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

氯乙酰氯化學(xué)性質(zhì)活潑，采用氣相色譜法直接進(jìn)樣測(cè)定，會(huì)損壞色譜柱的固定相，根據(jù)氯乙酰氯的化學(xué)性質(zhì)，其可以與醇類(lèi)化合物反應(yīng)生成對(duì)應(yīng)的酯，且該反應(yīng)為定量反應(yīng)，回收率高，故可采用柱前衍生化氣相色譜法間接地對(duì)氯乙酰氯中的特定雜質(zhì)二氯乙酰氯進(jìn)行定量檢測(cè)，該方法簡(jiǎn)單，易操作，檢測(cè)效率高，檢測(cè)能耗低。