陳援援，符慧靖，羅巧枝，任小青，馬儷珍

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

風(fēng)干腸是我國著名的傳統(tǒng)肉制品，以其獨(dú)特的風(fēng)味深受消費(fèi)者喜愛[1]。然而，由于傳統(tǒng)風(fēng)干腸采用的是自然發(fā)酵，會(huì)使某些有害微生物不能得到很好的控制而影響產(chǎn)品的風(fēng)味、安全性和感官品質(zhì)[2]。在肉餡中定向接種發(fā)酵劑能夠在發(fā)酵的早期階段與肉餡中的土著微生物群發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，通過產(chǎn)酸和產(chǎn)細(xì)菌素來抑制有害微生物的生長繁殖，同時(shí)還可以降低發(fā)酵產(chǎn)品中的亞硝酸鹽殘留量和致癌物N-亞硝胺的形成量[3]，從而達(dá)到提高產(chǎn)品安全性的目的[4]。乳酸菌是大多數(shù)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的主要微生物菌群，它們?cè)诎l(fā)酵食品中起著至關(guān)重要的作用。

風(fēng)干腸的發(fā)酵和成熟是一個(gè)涉及細(xì)菌相互作用的復(fù)雜生化過程，發(fā)酵溫度可以通過加速乳酸桿菌的生長來促進(jìn)酸化，導(dǎo)致pH 值迅速下降，從而抑制假單胞菌和腸桿菌科菌的生長[5]。不同的發(fā)酵劑、外源添加物、工藝參數(shù)、氣候和地理因素等都可能會(huì)影響特定細(xì)菌群落的組成，最終對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)和安全性發(fā)揮重要作用[6,7]。因此，需要確定風(fēng)干腸中的細(xì)菌多樣性及其相關(guān)影響因素，高通量測(cè)序技術(shù)能夠更準(zhǔn)確地表征復(fù)雜環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)中的微生物多樣性，并能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生數(shù)千個(gè)序列，覆蓋復(fù)雜的微生物多樣性和低豐度微生物[8]。Van Reckem 等[9]采用高通量擴(kuò)增子測(cè)序以評(píng)估加工因素對(duì)肉品自發(fā)發(fā)酵期間微生物群落變化的影響。研究表明，發(fā)酵過程在23 ℃和30 ℃主要由乳酸桿菌和明串珠菌控制，其次是乳酸球菌。大量肉制品微生物多樣性測(cè)定結(jié)果表明，乳酸桿菌屬是肉類發(fā)酵過程中經(jīng)常遇到的最普遍的菌屬，因?yàn)樗芎芎玫剡m應(yīng)特定的肉類基質(zhì)[10]。

微生物亞硝化抑制劑（Microbial Nitrification Inhibitor，MNI）是發(fā)酵劑PRO-MIX5（木糖葡萄球菌+清酒乳桿菌+類植物乳桿菌）制備出的菌體碎片，MNI 能有效抑制紅腸中N-亞硝胺的生成，提高紅腸的安全性和感官品質(zhì)[11,12]。關(guān)于MNI 對(duì)風(fēng)干腸發(fā)酵成熟過程中微生物群落動(dòng)態(tài)變化的研究尚未見報(bào)道。前期的研究中，風(fēng)干腸是在25±2 ℃的溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行為期12 d的發(fā)酵風(fēng)干成熟過程，由于發(fā)酵溫度低，接種的微生物不能快速繁殖產(chǎn)酸，使pH 下降緩慢，這樣對(duì)腐敗微生物的抑制效果不佳。本次試驗(yàn)對(duì)前期風(fēng)干腸的工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，提高發(fā)酵溫度為30 ℃，降低風(fēng)干成熟過程的溫度（14～16 ℃）。本研究將前期優(yōu)選出的能提高風(fēng)干腸安全品質(zhì)的PRO-MIX發(fā)酵劑、發(fā)酵牛骨調(diào)味基料和復(fù)配抗氧化劑（fermented beef flavorings and compound antioxidant，F(xiàn)BFA）以及MNI應(yīng)用于風(fēng)干腸的加工中，探討幾種方式特別是MNI對(duì)風(fēng)干腸發(fā)酵成熟過程中微生物群落動(dòng)態(tài)變化，及對(duì)風(fēng)干腸成品感官屬性的影響，從而為MNI 在風(fēng)干腸中的開發(fā)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷卻排酸成熟24 h 的豬后腿肉、豬肥膘、牛骨肉末，天津二商迎賓肉類食品有限公司；食鹽、白沙糖、曲酒、味精、醬油、葡萄糖、木糖，天津市紅旗農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng)；茶多酚、迷迭香、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶，豫中生物科技有限公司；VE、異抗壞血酸鈉、VB1，蘇州佰億鑫生物科技有限公司；VHI-41（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌）、PRO-MIX5（木糖葡萄球菌、清酒乳桿菌、類植物乳桿菌），意大利薩科公司；人工膠原蛋白腸衣：牛二層皮提取、孔徑30 mm，神冠控股（集團(tuán)）有限公司。

9 種N-亞硝胺混標(biāo)（N-Nitrosamines，NAs）：N-二甲基亞硝胺（N-dimethylnitrosamines，NDMA）、N-二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-甲基乙基亞硝胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-二丙基亞硝胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-二丁基亞硝胺（N-nitrosodibutylamide，NDBA）、N-亞硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NDPheA），美國Supelco公司；NaCl（分析純），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS 培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBA）、假單胞菌CFC 選擇性培養(yǎng)基、MSA 培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-500 高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY 有限公司；CLIMACELL 恒溫恒濕箱、Friocell 22 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，艾力特國際貿(mào)易有限公司；BVBJ-30F 真空攪拌機(jī)，浙江嘉興艾博實(shí)業(yè)有限公司；XZ-5L 灌腸機(jī)，廣州旭眾食品機(jī)械有限公司；CLASSⅡ生物安全柜，天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；JZ-4 拍打式無菌均質(zhì)器，天津歆毅翎科技有限公司；JY69-IIN 超聲波細(xì)胞破碎儀，西瓦卡精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FBFA 的制備

FBFA 是由發(fā)酵牛骨調(diào)味基料（fermented beef flavorings，F(xiàn)BF）和復(fù)合抗氧化劑（compound antioxidants，CA）復(fù)配而成。FBF 的制備參照樊曉盼[13]的方法，牛骨肉末和水按1:4 的比例在0.1 MPa，121℃下高壓浸提4 h，將浸提液冷卻到室溫后，加入0.06%的風(fēng)味蛋白酶（酶活力3.6 萬U/g）和0.03%的復(fù)合蛋白酶（酶活力40 萬U/g），在50 ℃的搖床中酶解4.5 h，結(jié)束后沸水浴滅酶活20 min，等恢復(fù)室溫后接種入用滅菌乳提前活化2 h 的VHI-41（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌）添加量為0.02%，在30℃，130 r/min 條件下振搖發(fā)酵12 h，結(jié)束后沸水浴滅菌20 min。待冷卻至室溫后分別加入1.2%木糖、1.2%葡萄糖、0.9%半胱氨酸、0.45%甘氨酸、0.45%丙氨酸、1.8% VB1 攪拌均勻后在110 ℃進(jìn)行美拉德反應(yīng)1 h，冷卻后于4 ℃靜置12 h。最后用兩層紗布過濾即為成品FBF。FBF 添加量為肉重的2%，CA 的添加量按照熊鳳嬌[14]的方法，即茶多酚、迷迭香、VE 和抗壞血酸鈉添加量分別為60.14 mg/kg、60.11 mg/kg、60.00 mg/kg 和60.00 mg/kg，將FBF 和CA 以1:1 復(fù)配得FBFA。

1.3.2 MNI 的制備

參照李秀明等[12]的方法，將PRO-MIX5 發(fā)酵劑按0.02%的量接種入含有質(zhì)量濃度0.04 μg/mL 的9 種N-亞硝胺（誘導(dǎo)劑）的MRS 肉湯培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，使在600 nm 下的OD 值達(dá)到2.0～2.2，于5000 ×g、4 ℃下進(jìn)行離心15 min 獲得菌體沉淀后，用25 mmol/L，pH 為6 的磷酸鹽緩沖溶液沖洗菌體，5000 ×g、4 ℃下離心15 min，同樣步驟再進(jìn)行1 次，再用PBS 以1:4 的比例稀釋菌體，添加濃度為1 mg/mL 的溶菌酶，在30 ℃下作用2 h，再用功率為200 W 的超聲波破碎儀破碎菌體5 min，其中超聲2 s 停2 s，最后經(jīng)過10000×g、4 ℃，10 min 條件下離心后倒掉上清液，得到菌體碎片，即為MNI。

1.3.3 風(fēng)干腸的制作

（1）腌制：將豬后腿肉剔除筋膜、脂肪，切成8 cm×5 cm×3 cm 的方塊，用絞肉機(jī)攪碎（篩板孔徑8 mm），放入真空攪拌機(jī)中，加入占肉總質(zhì)量（風(fēng)干腸肥瘦比1:9）1.8%的食鹽、0.01%的亞硝酸鈉（事先用少量水溶解）和抗壞血酸鈉0.55 g/kg，真空攪拌5 min，取出后放入不銹鋼盆中，緊貼肉表面蓋一層保鮮膜，于4 ℃冷庫中腌制24 h。

（2）拌餡：將腌制好的肉倒入真空攪拌機(jī)中，依次加入4%白砂糖、1.5%曲酒、0.2%味精、0.3%生抽、10%水、真空攪拌8 min。

（3）灌腸：將制好的肉餡灌入膠原蛋白腸衣中，結(jié)扎（每節(jié)13～15 cm）、排氣。

（4）發(fā)酵：將罐制好的肉餡放入30 ℃，RH=90%，風(fēng)速100%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中盡行發(fā)酵，在發(fā)酵初期隔8 h 測(cè)定一次pH，快到發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)每隔1 h～0.5 h測(cè)定一次pH，pH 降到接近5.4 時(shí)，立刻終止發(fā)酵，CK 組、MNI 組、MNIP 組和FBFAP 分別在發(fā)酵的第22、12.5、15 和21 h 其pH 降到5.4～5.6。

（5）風(fēng)干成熟：調(diào)節(jié)發(fā)酵階段的溫度為14～16 ℃，期間調(diào)節(jié)恒溫恒濕培養(yǎng)箱的RH 和風(fēng)速，恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度、相對(duì)濕度參數(shù)調(diào)節(jié)參照李玉娥等[15]的方法，略有調(diào)整，通風(fēng)機(jī)比率呈梯度降低調(diào)節(jié)，以避免后期風(fēng)干腸體水分過度散失，使質(zhì)地變硬。具體參數(shù)設(shè)置如表1 所示，進(jìn)行為期20 d 的成熟過程。

表1 風(fēng)干腸工藝參數(shù)Table 1 Process parameters of air-dried sausage

1.3.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

（1）CK 組：按照1.3.3 風(fēng)干腸的基礎(chǔ)配方和工藝制作。

（2）MNI 組：按照1.3.3 風(fēng)干腸的基礎(chǔ)配方和工藝制作，加入肉重0.05%的由PRO-MIX5 制備的菌體碎片（微生物亞硝化抑制劑（microbial nitrosation inhibitor，MNI））。

（3）MNIP 組：按照1.3.3 風(fēng)干腸的基礎(chǔ)配方和工藝制作，加入肉重0.05%的MNI，并接入20 g/100 kg的PRO-MIX5 商業(yè)復(fù)合菌（木糖葡萄球菌、清酒乳桿菌、類植物乳桿菌）。

（4）FBFAP 組：按照1.3.3 風(fēng)干腸的基礎(chǔ)配方和工藝制作，加入FBFA，并接入20 g/100 kg 的PRO-MIX5 商業(yè)復(fù)合菌（木糖葡萄球菌、清酒乳桿菌、類植物乳桿菌）。

將灌裝好的4 組肉腸放在30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵，使4 組腸肉餡的pH 降到5.4 左右后，在14～16 ℃條件下進(jìn)行為期20 d 的風(fēng)干成熟過程，測(cè)定4 組風(fēng)干腸在發(fā)酵和成熟兩個(gè)階段乳酸菌、腸桿菌科、假單胞菌和葡萄球菌數(shù)的變化情況，及在成熟第1 d和第20 d 的微生物多樣性變化，最后對(duì)4 組風(fēng)干腸成品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定

1.3.5.1 乳酸菌數(shù)、腸桿菌科數(shù)、假單胞菌數(shù)、葡萄球菌數(shù)測(cè)定

在生物安全柜里無菌操作稱取10 g樣品放入無菌均質(zhì)袋中，倒入90 mL 的無菌生理鹽水，用無菌均質(zhì)器拍打2 min，制成10 g/100 mL 的樣品勻漿液，吸取1 mL 的樣品勻漿液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，吸取相應(yīng)稀釋梯度的1 mL 液體到無菌平皿中，每個(gè)稀釋度下做2個(gè)平行，分別倒入MRS 培養(yǎng)基、VRBA、假單胞菌CFC 選擇性培養(yǎng)基、MSA 培養(yǎng)基，在35 ℃培養(yǎng)箱中腸桿菌培養(yǎng)24 h，其余菌培養(yǎng)48 h，對(duì)乳酸菌、腸桿菌科、假單胞菌、葡萄球菌的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5.2 微生物多樣性分析

將4 組風(fēng)干腸成品送到北京奧維森基因科技有限公司，采用擴(kuò)增子測(cè)序16S rDNA 的V3-4 區(qū)段，分析樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)等，對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析[16]，擴(kuò)增區(qū)段引物序列為：ACTCCTACGGGAGGC AGCAG，GGACTACHVGGGTWTCTAAT。

1.3.5.3 感官評(píng)定

將風(fēng)干20 d 的4 組風(fēng)干腸樣品做好標(biāo)記放入沸水中煮制15 min，切成約3 mm 左右的薄片，隨機(jī)編號(hào)放入樣品盤中，由本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過感官培訓(xùn)的10 名人員組成感官評(píng)定小組。所有樣品分別用三位數(shù)字編碼，并隨機(jī)提供，以避免遺留效應(yīng)。在對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)試之前，還提供了冷水用于漱口。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2 所示。

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 組樣品在發(fā)酵和成熟過程中各種微生物數(shù)量的變化

在30 ℃發(fā)酵階段，MNIP 組、MNI 組和FBFAP組的初始乳酸菌數(shù)分別為7.32 lg cfu/g、7.54 lg cfu/g、6.39 lg cfu/g，比CK 組（5.54 lg cfu/g）高，如圖1a，可能與添加的發(fā)酵劑和MNI 有關(guān)，這一結(jié)果與其他研究報(bào)告一致[17,18]，使用選擇性發(fā)酵劑生產(chǎn)風(fēng)干腸會(huì)顯著影響乳酸菌的數(shù)量。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，4 組樣品中乳酸菌數(shù)逐漸增加，MNIP 組、MNI 組、FBFAP組和CK 組分別在發(fā)酵的第12.5 h、15 h、21 h 和22 h達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)（即肉餡pH 值降到5.4～5.6），乳酸菌數(shù)分別增加到8.91 lg cfu/g、8.99 lg cfu/g、8.85 lg cfu/g和8.88 lg cfu/g，成為4 組風(fēng)干腸的優(yōu)勢(shì)菌群，其中MNI 組和MNIP 組的乳酸菌數(shù)為組內(nèi)最高，分析其原因，可能是PRO-MIX5 菌體碎片（MNI）中存在群體感應(yīng)的信號(hào)因子，能夠促進(jìn)肉餡中土著乳酸菌快速生長繁殖，試驗(yàn)說明添加MNI 能達(dá)到接種活的乳酸菌發(fā)酵劑的效果。發(fā)酵完成后，調(diào)節(jié)恒溫恒濕培養(yǎng)箱溫度為14～16 ℃，讓4 組風(fēng)干腸一起進(jìn)入成熟階段。經(jīng)風(fēng)干1 d 后，CK 組、MNI 組、MNIP 組和FBFAP 組乳酸菌數(shù)分別為8.78 lg cfu/g、8.97 lg cfu/g、8.72 lg cfu/g和8.70 lg cfu/g，如圖1b 所示。隨著風(fēng)干成熟時(shí)間的延長，到成熟終點(diǎn)時(shí)CK 組、MNI 組、MNIP 組和FBFAP 組乳酸菌數(shù)分別降為8.43 lg cfu/g、8.47 lg cfu/g、8.14 lg cfu/g、8.30 lg cfu/g，在成熟過程中乳酸菌的輕微下降可能是由于可供微生物利用的碳水化合物逐漸被消耗[19]、aw 降低[20]，該結(jié)果與Lorenzo[2]的報(bào)道一致。在整個(gè)成熟階段，MNI 組的乳酸菌數(shù)明顯高于CK、MNIP 和FBFAP，說明MNI 組的優(yōu)勢(shì)菌群乳酸菌數(shù)量最多。到成熟的第20 d，MNIP 組的乳酸菌數(shù)降為組內(nèi)最低（8.14 lg cfu/g），MNI 組乳酸菌數(shù)仍為組內(nèi)最高（8.47 lg cfu/g），這可能是因?yàn)镸NIP組接種的清酒乳桿菌和類植物乳桿菌在MNI 的誘導(dǎo)下大量產(chǎn)酸，由于乳酸的積累，蛋白質(zhì)形成致密的凝膠結(jié)構(gòu)，使MNIP 組乳酸菌數(shù)顯著降低（p＜0.05）。

腸桿菌科和假單胞菌是發(fā)酵肉制品中常見的腐敗微生物。在發(fā)酵前（0 h），4 組樣品肉餡體系中初始腸桿菌科菌數(shù)基本保持在5.10～5.94 lg cfu/g 水平，如圖1c，這取決于原料的衛(wèi)生質(zhì)量和加工過程中的處理?xiàng)l件[21]；3 個(gè)處理組初始假單胞菌數(shù)為4.92～5.70 lgcfu/g顯著低于CK 組（6.62 lg cfu/g）（p＜0.05），如圖1e，說明加入的MNI、MNIP 和FBFAP 在拌餡和灌腸的過程中開始發(fā)揮抑菌作用。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，4 組樣品中腸桿菌科菌數(shù)、假單胞菌數(shù)呈先升高后緩慢降低趨勢(shì)，到各自發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)可以明顯看到MNI 組、MNIP組和FBFAP 組的腸桿菌科菌數(shù)和假單胞菌數(shù)顯著低于CK 組（p＜0.05），尤其是MNIP 和MNI 組，這歸因于3 個(gè)處理組在發(fā)酵階段乳酸菌成為酸化肉餡中的優(yōu)勢(shì)菌群，有助于防止腐敗微生物的生長[22]，另一方面乳酸菌也能夠釋放抗菌肽并抑制腐敗細(xì)菌生長繁殖[1]。相比之下，在成熟期間，4 組風(fēng)干腸中的腸桿菌科數(shù)和假單胞菌數(shù)持續(xù)下降，這主要是因?yàn)轶w系中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、氧氣濃度的降低以及代謝物和有機(jī)酸的積累等原因，細(xì)菌生長速度減慢并開始下降[23]，且在整個(gè)風(fēng)干成熟過程中MNIP組和MNI組的腸桿菌科數(shù)和假單胞菌數(shù)顯著低于CK 組（p＜0.05），如圖1d 和圖1f。到成熟終點(diǎn)時(shí)，4 組風(fēng)干腸中，腸桿菌科和假單胞菌數(shù)均降到了最低，其從小到大的關(guān)系為：MNIP＜MNI＜FBFAP ＜CK，這表明在風(fēng)干腸中加入MNI、MNIP、FBFAP 可以降低風(fēng)干腸成品的腸桿菌科菌數(shù)和假單胞菌數(shù)，提高了風(fēng)干腸的安全性。

MNIP 組和 FBFAP 組由于加入的發(fā)酵劑PRO-MIX5 中含有木糖葡萄球菌，所以其葡萄球菌數(shù)在發(fā)酵前顯著高于CK 組和MNI 組，如圖1g。到各自發(fā)酵終點(diǎn)，MNI 組（7.13 lg cfu/g）、MNIP 組（6.78 lg cfu/g）和FBFAP 組（8.42 lg cfu/g）葡萄球菌數(shù)顯著低于CK（8.70 lg cfu/g）組（p＜0.05），且在成熟階段也保持同樣的大小關(guān)系如圖1h，4 組風(fēng)干腸葡萄球菌數(shù)呈不同比例的降低趨勢(shì)。到成熟終點(diǎn)時(shí)，MNI 組（5.73 lg cfu/g）和MNIP 組（5.70 lg cfu/g）葡萄球菌數(shù)為組內(nèi)最低，F(xiàn)BFAP 組（8.00 lg cfu/g）次之，CK組（8.17 lg cfu/g）為組內(nèi)最高。這是由于MNI 和MNIP組乳酸菌群的酸化能力較強(qiáng)所致，該結(jié)果與許多報(bào)道一致，即在強(qiáng)烈酸化條件下會(huì)抑制對(duì)pH 敏感的葡萄球菌生長[24,25]。

2.2 4 組樣品在成熟第1 d 和20 d 的微生物多樣性指數(shù)動(dòng)態(tài)變化

Chao1 為菌種豐富度指數(shù)，用以估計(jì)群落中的OTU 數(shù)目，observed_species 表示隨測(cè)序深度的增加，實(shí)際觀測(cè)到OTU 的個(gè)數(shù)。一般情況下，如果序列之間的相似性高于97%（種水平）就可以把它定義為一個(gè)OTU，每個(gè)OTU 代表一個(gè)物種[26]。4 組樣品在成熟第1天和第20天的微生物多樣性指數(shù)動(dòng)態(tài)變化見表3 所示。由表3 可知，在風(fēng)干成熟的第1 d，CK（391.44、233.00）組和MNI（230.11、163.00）組的Chao1 指數(shù)和observed_species 指數(shù)遠(yuǎn)低于MNIP（819.51、743.00）組和FBFAP（855.27、630.00）組，其中MNI組的菌群豐富度最低，可能是CK 組和MNI 組沒有接種活菌，且加入的MNI 對(duì)肉餡中的腐敗菌具有抑制作用，所以經(jīng)過發(fā)酵后，在成熟初期，接種有PRO-MIX發(fā)酵劑的MNIP 組和FBFAP 組菌種豐度大幅度增加。到風(fēng)干成熟的第20 天時(shí)，MNI（779.36）和MNIP（731.77）組Chao1 指數(shù)高于CK（589.44）和FBFAP（415.14）組，這說明此階段MNI 組和MNIP 組風(fēng)干腸含有大量乳酸菌等優(yōu)勢(shì)菌群。據(jù)報(bào)道，乳酸菌可以抑制或殺死食品中的腐敗微生物和致病微生物[27]，提高發(fā)酵肉制品的安全性。Shannon 和Simpson 表征了群落物種分布的多樣性和均勻性，由表3 可以看出，在風(fēng)干的第1 天和第20 天，MNI 組和MNIP 組的Shannon、Simpson 指數(shù)均低于CK 組，主要是由于這兩組樣品肉餡體系中pH 較低，一些微生物菌群的生長受到抑制，進(jìn)而使微生物多樣性降低[28]，這一結(jié)果有利于提高風(fēng)干腸的安全性。8 個(gè)樣品的goods_coverage 均為100.00%，表明測(cè)序深度的結(jié)果可以很好地描述所有樣品中的微生物群落。

表3 4 組樣品在成熟第1 天和第20 天的微生物多樣性指數(shù)動(dòng)態(tài)變化Table 3 Dynamic changes of microbial diversity index of four groups of samples on the 1st and 20th days of maturity

2.3 4組樣品分別在成熟第1天和第20天中基于門水平微生物群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化分析

4 組樣品在成熟第1 天和第20 天中基于門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)豐度變化如圖2 所示，在8 個(gè)樣品中共鑒定出28 個(gè)門水平的微生物種群，其中相對(duì)豐度大于1%的有5 個(gè)，分別為Firmicutes（厚壁菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Bacteroidota（擬桿菌門）、Actinobacteriota（放線菌門）和Acidobacteriota（酸桿菌門）。8 個(gè)樣品中厚壁菌門和變形菌門最為豐富，占所有OTU 的93%以上，這與Zhang 等[29]測(cè)定結(jié)果相似，Deng 等[30]研究湖北恩施香腸發(fā)現(xiàn)，在門水平上鑒定出厚壁菌門（57.01%）、變形菌門（30.43%）、藍(lán)藻門（7.67%）、擬桿菌門（2.63%）和放線菌門（2.01%），其中厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)門。擬桿菌門（1.22%～3.56%）、放線菌門（0.17%～1.77%）和酸桿菌門（0.00～1.16%）在4 組樣品中占很少一部分。在風(fēng)干成熟的第1 天，MNI 組的厚壁菌門豐度占比最高為77.81%，變形菌門豐度占比為組內(nèi)最低19.73%，說明加入MNI 的風(fēng)干腸肉餡經(jīng)過發(fā)酵后，有利于降低微生物多樣性，提高風(fēng)干腸的安全品質(zhì)，CK 組、MNIP 組和FBFAP 組在厚壁菌門豐度上基本一致，分別為69.14%、67.07%和68.52%。隨著風(fēng)干時(shí)間的延長，到成熟終點(diǎn)20 d 時(shí)，MNI 組厚壁菌門相對(duì)豐度略有降低（74.41%），變形菌門有略微增加，但MNI 組的厚壁菌門OTU 仍為組內(nèi)最高，變形菌門OTU 為組內(nèi)最低，CK 組、MNIP組和FBFAP 組厚壁菌門有小幅度升高，變形菌門呈降低趨勢(shì)，變形菌門包括許多革蘭氏陰性腐敗菌，它們經(jīng)常作為風(fēng)干腸中的不良細(xì)菌參與其中[31]，試驗(yàn)說明風(fēng)干成熟過程能抑制風(fēng)干腸腐敗微生物的生長。

2.4 4 組樣品在成熟第1 d 和20 d 中基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化分析

4 組樣品在成熟第1 天和第20 天基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)豐度變化如圖3 所示。在屬水平上，根據(jù)OTU 分析，共鑒定出237 個(gè)屬，乳酸桿菌是MNI 組和MNIP 組風(fēng)干腸中最豐富的菌屬，其相對(duì)豐度占比在成熟第1 天分別為74.93%和53.72%，在種水平上鑒定出主要為植物乳桿菌（68.33%、50.20%）和少量的清酒乳桿菌（6.57%、3.46%）。到成熟第20 d，由于風(fēng)干過程中水分減少，肉餡體系溶氧量降低等環(huán)境條件變化，不利于微生物生長，MNI組和MNIP 組的乳桿菌屬分別降低為66.36%和46.87%。乳酸桿菌和鏈球菌是FBFAP 組風(fēng)干腸成品中屬水平的主要菌，分別占相對(duì)豐度的23.63%和24.46%，在種水平上鑒定為清酒乳桿菌（16.60%）、副乳房鏈球菌（24.42%）和少量的植物乳桿菌（6.99%），Wang 等[32]使用清酒乳桿菌亞種作為發(fā)酵劑接種到四川香腸中，結(jié)果表明，乳酸菌能迅速控制香腸發(fā)酵過程中菌落總數(shù)的生長，抑制大腸桿菌等食源性致病菌的生長。乳酸菌可以分解香腸中的碳水化合物，產(chǎn)生大量的乳酸和少量的醋酸以及丙酸、甲酸、3-甲基丁酸、丁酸等有機(jī)酸，從而延長香腸的保質(zhì)期[33]。與MNI 組、MNIP 組和FBFAP 組相比，CK 組在成熟過程中乳酸菌群更加多樣化，包括乳酸桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、漫游球菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬、肉桿菌屬和梭菌屬等。由此可以看出，單獨(dú)添加MNI 能促進(jìn)風(fēng)干腸中優(yōu)勢(shì)菌群乳桿菌屬的生長，在接種有PRO-MIX5 發(fā)酵劑的前提下，加入MNI 和FBFA 均會(huì)影響風(fēng)干腸肉餡中微生物多樣性。大量研究表明，乳酸桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、漫游球菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬和肉桿菌屬是風(fēng)干腸中的主要乳酸菌[34]，有學(xué)者報(bào)道稱由于乳酸桿菌和乳酸球菌能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分解為肽和氨基酸，因此它們被認(rèn)為是香腸中形成獨(dú)特酸味和豐富風(fēng)味的主要原因[35]。到成熟結(jié)束時(shí)，CK 組、MNI 組、MNIP 組和FBFAP組風(fēng)干腸成品中，不動(dòng)桿菌屬、弧菌屬、沙雷氏菌屬、發(fā)光細(xì)菌屬、香味菌屬、嗜冷桿菌屬、克雷伯菌屬和米勒氏菌等革蘭氏陰性腐敗菌相對(duì)豐度分別降為22.53%、19.35%、22.27%、26.11%。MNI 組中這些腐敗細(xì)菌的相對(duì)豐度低于其它3 組，分析其原因，可能是成熟過程大量乳桿菌（如植物乳桿菌）具有抑制其它腐敗微生物生長繁殖的作用。Wang 等[36]研究表明植物乳桿菌LPL-1 產(chǎn)生的一種新型IIa 類細(xì)菌素，對(duì)食源性細(xì)菌具有殺菌活性，Gao 等[37]研究表明，清酒乳桿菌能產(chǎn)生廣譜抗菌細(xì)菌素，抑制有害微生物的生長。葡萄球菌在MNIP 組風(fēng)干腸成品中相對(duì)豐度占比最高（2.75%），且在種水平上鑒定出以木糖葡萄球菌為主，其余3 組風(fēng)干腸成品中葡萄球菌相對(duì)豐度低于1%。葡萄球菌具有硝酸還原酶活性、過氧化氫酶活性等，可以提高產(chǎn)品的顏色穩(wěn)定性，減少酸敗的發(fā)生[38]。

2.5 4 組風(fēng)干腸感官評(píng)定結(jié)果

感官評(píng)價(jià)是預(yù)測(cè)氧化穩(wěn)定性、產(chǎn)品保質(zhì)期和消費(fèi)者可接受性的最重要方法[39]。經(jīng)過培訓(xùn)后的感官評(píng)定小組對(duì)4 組風(fēng)干腸成品的感官屬性（嫩度、顏色、咀嚼性、回味、酸味、酸敗味、風(fēng)味和整體可接受性）進(jìn)行評(píng)估，其結(jié)果如圖4 所示。CK 組、MNI 組、MNIP組、FBFAP 組風(fēng)干腸在酸敗味和酸味感官屬性方面表現(xiàn)出相似的分?jǐn)?shù)，小組成員對(duì)4 組樣品沒有發(fā)現(xiàn)明顯的酸敗味和酸味差異。與CK 組相比，3 個(gè)處理組具有較好的顏色、回味、嫩度、風(fēng)味和整體可接受性，MNI 組、MNIP 組和FBFAP 組在嫩度上的得分高于CK 組，可能是3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組中微生物能產(chǎn)生大量的膠原蛋白酶，提高了風(fēng)干腸的嫩度[40]，Sun 等[41]研究發(fā)現(xiàn)，從哈爾濱風(fēng)干腸中分離出的短乳桿菌產(chǎn)生的蛋白酶可與肌凝蛋白輕鏈、重鏈和肌鈣蛋白相互作用，可加速肉蛋白的降解，促進(jìn)肉質(zhì)嫩度，進(jìn)而改善哈爾濱干香腸的風(fēng)味和品質(zhì)。MNI 組和MNIP 組風(fēng)干腸在咀嚼性方面不及FBFAP 組和CK 組，可能是添加的MNI和MNIP 促進(jìn)肉餡中乳酸菌產(chǎn)生大量蛋白酶，使肌原纖維蛋白水解變性，形成致密的凝膠結(jié)構(gòu)，再經(jīng)過20 d 的風(fēng)干成熟過程，使水分散失，進(jìn)而增加了MNI 組和MNIP 組風(fēng)干腸的咀嚼，在許多研究中，咀嚼性受到蛋白質(zhì)水解的積極影響，而不受硬度的積極或消極變化的影響，研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的水解現(xiàn)象和水分結(jié)合能力影響香腸的咀嚼性，進(jìn)而影響風(fēng)味的釋放和感知[42]。后期可以考慮進(jìn)行微發(fā)酵或縮短成熟時(shí)間來改善MNI 組和MNIP 組風(fēng)干腸的咀嚼性能。整體而言MNIP 組風(fēng)干腸有較好風(fēng)味、回味、嫩度，且總體可接受性得分為組內(nèi)最高，說明添加MNIP 能提高風(fēng)干腸的感官屬性。研究表明微生物與風(fēng)干腸中獨(dú)特的風(fēng)味有著必然的聯(lián)系。Chen 等[43]發(fā)現(xiàn)，從酸肉中分離的木糖葡萄球菌SX16 和植物乳桿菌CMRC6 在體外具有優(yōu)異的蛋白水解活性，可改善香腸的感官特性。許多乳酸菌中被鑒定出脂肪酶、酯酶和磷脂酶，且大多數(shù)乳酸菌脂肪酶具有細(xì)胞外活性。脂肪酶能在發(fā)酵的肉制品中產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味，研究表明，植物乳桿菌，具有很強(qiáng)的脂解活性，有助于風(fēng)味和香氣的形成[44]。

3 結(jié)論

加入MNI、MNIP 和FBFAP 能促進(jìn)肉餡中乳酸菌在發(fā)酵過程中快速繁殖而成為優(yōu)勢(shì)菌群，抑制腐敗微生物如腸桿菌科、假單胞菌和酸敏感性葡萄球菌的生長。4 組風(fēng)干腸中乳酸菌、腸桿菌科、假單胞菌和葡萄球菌數(shù)在成熟過程中呈不同程度的減少。在整個(gè)成熟過程中，MNI 組和MNIP 組腸桿菌科、假單胞菌和葡萄球菌數(shù)顯著低于CK 組（p＜0.05），MNI 組乳酸菌在成熟的整個(gè)階段為組內(nèi)最高。加入FBFAP 能抑制風(fēng)干腸成品中的腸桿菌科數(shù)（5.54 lg cfu/g）和假單胞菌數(shù)（5.66 lg cfu/g），但其抑制效果不及MNI（4.23 lg cfu/g、4.76 lg cfu/g）和MNIP（3.93 lg cfu/g、4.33 lg cfu/g）組，說明在接種有發(fā)酵劑PRO-MIX5 的風(fēng)干腸中加入MNI 對(duì)腐敗微生物的抑制效果優(yōu)于FBFAP。微生物多樣性分析結(jié)果表明，4 組風(fēng)干腸在成熟第1 d和第20 d 的基于門水平的微生物群主要為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和酸桿菌門，其中厚壁菌門和變形菌門最豐富，占相對(duì)豐度的93%以上；在屬水平上的鑒定結(jié)果表明：乳酸桿菌是MNI、MNIP組的優(yōu)勢(shì)菌屬，在種水平上鑒定出主要為植物乳桿菌（68.33%、50.20%）和少量的清酒乳桿菌（6.57%、3.46%），其相對(duì)豐度隨著成熟時(shí)間的延長略有降低。乳酸桿菌和鏈球菌是FBFAP 組風(fēng)干腸成品的優(yōu)勢(shì)菌屬，在種水平上鑒定為清酒乳桿菌（16.60%）、副乳房鏈球菌（24.42%）和少量的植物乳桿菌（6.99%），CK 組在成熟過程中乳酸菌群更加多樣化。革蘭氏陰性腐敗微生物在4 組風(fēng)干腸中相對(duì)豐度隨成熟過程進(jìn)行呈降低趨勢(shì)，在MNI 組的相對(duì)豐度最低為19.35%。加入MNI、MNIP 能顯著提高風(fēng)干腸的安全性，MNIP能提高風(fēng)干腸的質(zhì)地、色澤、風(fēng)味等感官性能。