李真，姬生鑫，梁靜靜，索標，范會平，艾志錄*

（1.河南農業(yè)大學食品科學技術學院，河南鄭州 450002）

（2.農業(yè)農村部大宗糧食加工重點實驗室，河南鄭州 450002）

釀酒酵母是與人類關系最為密切一種酵母，釀酒酵母菌體中含有多種營養(yǎng)物質成分，是良好的膳食補充劑，這些營養(yǎng)成分經過不斷的研究開發(fā)可以應用于食品、醫(yī)藥、飼料、化妝品等領域[1]。但其在食品制造中最主要的應用還是發(fā)酵，如釀酒工業(yè)[2]、奶制品行業(yè)[3]、調味品[4]以及發(fā)酵面食加工領域[5]等。與濕酵母相比，活性干酵母具有含水量低、復水快、性能穩(wěn)定、易于運輸和使用方便等優(yōu)點。

目前，常用的酵母干燥保藏方法主要有：真空冷凍干燥、流化床干燥、噴霧干燥，相對于流化床干燥和噴霧干燥，真空冷凍干燥技術酵母的存活率較高，對于熱較為敏感的酵母菌有更大的優(yōu)勢，受到大家的青睞。但在實際干燥過程中依然會不可避免的出現(xiàn)細胞不可逆損傷，細胞死亡活力下降等問題。因此需要采取相應的保護措施，其中凍干保護劑是比較常用的提高菌劑凍干存活率和穩(wěn)定性的有效方法，目前常用的保護劑主要有脫脂奶粉、山梨醇、甘油[6]、海藻糖、谷氨酸鈉[7]、蔗糖、乳糖、抗壞血酸、菊粉、甘露醇[8]等。宋志遠[9]研究得出以脫脂乳粉5%、甘露醇4%、抗壞血酸3%比例作為果蔬生防酵母細胞的復合凍干保護劑，酵母細胞存活率可以達到83.64%。周秋陽等[10]研究發(fā)現(xiàn)以海藻糖12.45 g/100 mL、谷氨酸鈉13.56 g/100 mL、山梨醇5.43 g/100 mL 作為酵母復合凍干保護劑時，酵母細胞凍干存活率達84.21%。王華等[11]采用聚乙二醇1.10 g/100 mL、L-谷氨酸鈉7.07 g/100 mL、蔗糖14.15 g/100 mL 作為熱帶假絲酵母菌復合凍干保護劑時，凍干存活率為82.73%。Han[12]研究表明以脫脂奶粉1.5%、聚乙二醇0.1875%、海藻糖5.25%配比的復合低溫保護劑，凍干海洋酵母Sporidiobolus pararoseusZMY-1 的存活率為93.9%。Zhang[13]研究表明以海藻糖20%、谷氨酸鈉2%、5%聚乙烯吡咯烷酮和20%脫脂牛奶配比的復合低溫保護劑，凍干畢赤酵母的存活率為79.4%。蔡孟軒等[14]優(yōu)化了橄欖假絲酵母的保護劑配方，最終配方為海藻糖、脫脂乳粉、谷氨酸鈉按15%、10%、2%的比例混合，所得酵母存活率為69.7%。然而，迄今為止國內外將β-葡聚糖作為凍干保護劑的研究較少，以燕麥β-葡聚糖為主，與γ-聚谷氨酸和甘露醇復合作為酵母凍干保護劑的研究更是未見報道。燕麥β-葡聚糖和γ-聚谷氨酸為不能自由通過細胞膜的大分子非滲透型保護劑。

不同類型保護劑的作用機制差異較大，復配使用不同類型保護劑相互協(xié)調更能效減小微生物在冷凍過程中的死亡率。燕麥β-葡聚糖和γ-聚谷氨酸為不能自由通過細胞膜的大分子非滲透型保護劑；甘露醇是可以自由通過細胞膜的小分子滲透型保護劑，并且也可以在水中形成無定型結構來維持蛋白的穩(wěn)定性，阻止細胞膜蛋白的聚集，保護細胞膜骨架不受損害。因此，為進一步提高釀酒酵母在冷凍及干燥等各種不利環(huán)境下的存活率。本研究以燕麥β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇為凍干保護劑，并利用中心復合試驗設計（CCD）優(yōu)化得出酵母存活率最高時冷凍干燥保護劑最佳添加比，為后期釀酒酵母的應用奠定基礎，也為新型酵母凍干保護劑的開發(fā)與應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種及培養(yǎng)基

本試驗所使用的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）從安琪高活性酵母中分離得到；YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、胰蛋白胨2.0%、酵母浸粉1%，121℃滅菌20 min。

1.1.2 主要試劑

燕麥β-葡聚糖（純度80%）由張家口一康生物科技有限公司提供；胰蛋白胨、酵母浸粉購于賽默飛世爾科技有限公司；γ-聚谷氨酸購于西安四季生物科技有限公司；甘露醇購于浙江一諾生物科技有限公司。燕麥β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇為食品級，其他試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器與設備

5430R 型離心機，eppendorf 有限公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology；BPMJ-150F 型培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；BTP.8XL型冷凍干燥機，德祥科技有限公司；SZCL-4A型智能磁力加熱攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；TP614000A 型顯微鏡，杭州圖譜光電科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液的制備與冷凍干燥

參照邵明倩[15]酵母凍干粉制備方法略作修改，將酵母菌培養(yǎng)到穩(wěn)定期后，離心速度為6000 r/min，離心5 min，離心溫度為20 ℃，無菌水洗滌兩次。菌泥與保護劑質量比為1:2，30 ℃恒溫箱中平衡60 min，之后于-18 ℃冰箱中預凍8 h，預凍結束后迅速放入真空冷凍干燥機中。凍干工藝：冷阱溫度-75 ℃，真空度145～155 mT，凍干時間20 h。

1.2.2 凍干存活率的計算

酵母凍干粉用0.85%的無菌生理鹽水復水至凍干前體積，溶解之后放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化30 min，利用美蘭染色法測定酵母凍干存活率[16]，存活率計算見下式。

1.2.3 單因素輪換試驗

選取燕麥β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇作為凍干保護劑，首先固定γ-聚谷氨酸、甘露醇添加量為0.167%、1.33%，燕麥β-葡聚糖添加量依次為4%、5%、6%、7%、8%，可以得到最優(yōu)燕麥β-葡聚糖添加量。固定最優(yōu)燕麥β-葡聚糖添加量和甘露醇添加量1.33%，γ-聚谷氨酸的添加量依次為0.033%、0.1%、0.167%、0.233%、0.3%，得到最優(yōu)γ-聚谷氨酸添加量。最后固定最優(yōu)燕麥β-葡聚糖和γ-聚谷氨酸添加量，甘露醇的添加量依次為0.33%、0.67%、1%、1.33%、1.67%，得到最優(yōu)甘露醇添加量。上述保護劑的配置均用無菌水在恒溫75 ℃磁力攪拌器中溶解均勻，冷卻至室溫備用。

1.2.4 中心組合設計

根據單因素輪換試驗結果得到的燕麥β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇三個最優(yōu)的添加量，將這三個點作為中心組合設計的中心點進行試驗設計，以酵母凍干存活率為響應值，確定釀酒酵母冷凍干燥保護劑的最優(yōu)組合。試驗因素水平見表1。

表1 中心優(yōu)化組合試驗變量和水平Table 1 Test variables and levels of the centrally optimized combined design

1.2.5 掃描電鏡觀察

掃描電鏡樣品的處理參考張嗣萍等[17]的方法。

1.2.6 數據處理

每組試驗均重復3 次，結果用X±SD 表示。試驗數據全部采用SPSS 16.0 軟件進行顯著性檢驗和單因素方差分析，利用Design-Expert 8.06 軟件的Central Composite Design 進行響應面設計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素輪換試驗

2.1.1 燕麥β-葡聚糖對酵母凍干存活率的影響

在冷凍干燥過程中，以氫鍵形式與蛋白質極性基團連接的水分子逐漸被脫去，導致蛋白質結構破壞，功能失調；但是含有多羥基結構的保護劑能夠代替水分子的位置，并以“水化膜”的形式包裹蛋白表面，從而維持蛋白結構和功能[18]。由表1 可知，隨著燕麥β-葡聚糖添加量的增大，酵母細胞的凍干存活率呈現(xiàn)一個先上升后下降的趨勢。當燕麥β-葡聚糖添加量為6%時，酵母細胞存活率達到最大，為80.57%?？赡苁且驗檠帑湨?葡聚糖作為大分子化合物能夠以“包裹”的方式來保護細胞也可能是大分子化合物在保護細胞的同時還可以促進小分子化合物對細胞作用效果[19]。Crowe 等[20]研究發(fā)現(xiàn)糖能夠取代細胞膜表面的水分子，從而避免干燥引起的細胞膜的有害相變。Desmond等[21]發(fā)現(xiàn)凍干Lactobacillus paracaseiNFBC338 時，在脫脂乳保護劑基礎上，另外添加葡聚糖后菌體的貯藏穩(wěn)定性較單獨添加脫脂乳組顯著改善。試驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)濃度越高β-葡聚糖（≥7%），冷卻時越易形成凝膠，不利于后期操作和酵母的均勻分散，也可能是此原因致使β-葡聚糖濃度過高時酵母活菌數反而降低。

2.1.2γ-聚谷氨酸對酵母凍干存活率的影響

由圖2 可知，隨著γ-聚谷氨酸添加量的增大，酵母細胞的凍干存活率呈現(xiàn)一個先上升后下降的趨勢。當γ-聚谷氨酸添加量為0.13%時，酵母細胞存活率達到最大，為80.57%；之后隨著γ-聚谷氨酸的添加量的升高，酵母細胞凍干存活率呈現(xiàn)出一個先下降后趨于平緩的趨勢。Bhat[22]通過透射電鏡觀察得到γ-聚谷氨酸作為凍干保護劑時，可以將細胞包裹起來從而減少細胞受到冷凍干燥的損傷。

2.1.3 甘露醇對酵母凍干存活率的影響

甘露醇不僅可作為優(yōu)良的骨架劑使用，而且在一些保護劑配方中它能夠兼作蛋白質的凍干保護劑[23]。由圖3 可知，隨著甘露醇添加量的增大，酵母細胞的凍干存活率呈現(xiàn)先顯著上升，后顯著下降的趨勢。當甘露醇添加量為1%時，酵母凍干存活率達到最大，為87.18%，并且隨著甘露醇添加量的升高，酵母細胞存活率呈現(xiàn)一個顯著下降的趨勢?？赡苁且驗楦事洞紝Φ鞍踪|的保護作用與其濃度、形態(tài)結構有關，而濃度與結晶狀態(tài)有時又有一定的關聯(lián)性[24]。Izutsu[25]研究表明較低濃度（1%或更低）的甘露醇通過形成無定型結構來保護蛋白質免于聚集，但在更高濃度下，甘露醇通過形成晶體結構來增強蛋白質的聚集。無定型結構的甘露醇會促進蛋白質的穩(wěn)定，而高濃度的甘露醇形成的晶體結構對于蛋白質沒有保護作用，甚至還會促進水分子對細胞的破壞[26]。因此當甘露醇濃度高于1%時酵母細胞存活率呈現(xiàn)一個顯著下降的趨勢。

2.2 酵母冷凍干燥保護劑的中心響應面優(yōu)化

2.2.1 響應曲面試驗設計及結果

根據單因素試驗分析結果，以燕麥β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇添加量為因素，由Design-Expert 8.06軟件設計3 因素3 水平的20 組響應面優(yōu)化試驗方案，結果見表2。

2.2.2 響應曲面二次回歸模型的建立及顯著性檢驗

采用中心響應面法（CCD）研究了燕麥β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇水平對冷凍干燥后酵母細胞存活率的影響。這三個自變量的水平見表1。根據表2 可知，共進行了20 次不同組合試驗。對試驗數據進行多元回歸分析，用二次多項式方程表示凍干后酵母細胞的存活率：

表2 Central Composite Design 響應曲面試驗設計方案及結果Table 2 Central Composite Design response surface test design scheme and results

式中：

Y——凍干酵母細胞存活率，%；

A——燕麥β-葡聚糖；

B——γ-聚谷氨酸；

C——甘露醇。

為了評估擬合的二次多項式模型的顯著性和充分性，由表3 可知，Pmodel＞F 并小于0.0001，說明該模型非常顯著，表明建立的模型與試驗數據相符。失擬項可以反應所建模型與試驗的擬合程度，p=0.4584＞0.05，不顯著，說明試驗點均能用模型進行描述，且上述擬合的二次回歸方程能夠很好地預測酵母凍干后的存活率。多項式模型的擬合優(yōu)度可以通過決定系數R2和相關系數R 來檢驗。在這種情況下，得到的R2=0.9827 意味著只有1.73%的響應的可變性不能被模型解釋。相關系數R=0.9672，表明試驗結果與預測結果吻合較好，模型具有較高的意義。

表3 酵母存活率響應曲面二次回歸模型方差分析結果Table 3 Results of analysis of variance for yeast survival rate response surface quadratic regression model

2.3 響應面圖及等高線圖分析

響應面分析法不但能夠分析各反應因素對目標值的影響，還能對最佳反應條件進行預測優(yōu)化。由圖4、圖5、圖6 顯示了方程的三維響應面，證實了擬合面有真實的最大值。當其中一種物質的濃度一定時，酵母凍干存活率隨著其他兩種物質濃度的增加呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，說明響應曲面中存在極大值點，即存在保護劑最佳濃度。通過軟件計算得到方程的極值點，燕麥β-葡聚糖添加量為6.56%、γ-聚谷氨酸添加量為0.15%、甘露醇添加量為1.15%，此時通過響應面優(yōu)化模型預測得到平均存活率為89.86%，最大時可達90.69%。

2.4 燕麥β-葡聚糖復合保護劑對菌體形態(tài)的影響

利用掃描電鏡對冷凍干燥后酵母細胞形態(tài)進行研究，由圖7a 可知，未添加燕麥β-葡聚糖復合保護劑部分酵母細胞出現(xiàn)較多的褶皺、破裂現(xiàn)象，說明在冷凍和冷凍干燥過程中會損傷酵母細胞。由圖7b，在添加燕麥β-葡聚糖復合保護劑后，未發(fā)現(xiàn)酵母細胞出現(xiàn)褶皺、破裂的現(xiàn)象，說明燕麥β-葡聚糖復合保護劑的添加可以維持酵母細胞結構不被冷凍和冷凍干燥破壞，并且維持復水過程中酵母細胞結構的穩(wěn)定性。

3 結論

本研究通過中心優(yōu)化響應面法優(yōu)化了以燕麥β-葡聚糖為主的釀酒酵母細胞冷凍干燥保護劑配方，首先通過單因素試驗逼近最大響應區(qū)域，最后通過中心響應面優(yōu)化試驗擬合出一個三元二次多項式方程，得到最佳配方：燕麥β-葡聚糖6.56%、γ-聚谷氨酸0.15%、甘露醇1.15%，酵母凍干存活率達到最高，為90.69%，與理論預測值酵母存活率89.86%接近。通過對釀酒酵母的凍干保護劑配方的優(yōu)化，可以為釀酒酵母凍干保護研究提供理論參考，該配方酵母細胞存活率可達90.69%，具有較高的市場應用價值。