張壯，李瓊，黃麗萍，崔玉順，劉榮華，馮育林*，歐陽(yáng)輝*，朱衛(wèi)豐，楊世林

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西南昌 330006）

（2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌 330004）

（3.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330004）

葛根屬豆科，學(xué)名Pueraria lobata（Willd.）Ohwi，入藥常用其干燥根，有豐富的食用以及藥用價(jià)值，為我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用植物[1]。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有葛根品種多樣化，葛根的正品為1977～2000 版《中國(guó)藥典》記錄的Pueraria lobata（Willd.）Ohwi 和甘葛藤P.thomsonii Benth.的干燥塊根。隨著近年來(lái)藥理研究的不斷發(fā)展，粉葛被單獨(dú)列為一個(gè)品種，野葛為正品葛根。有研究表明，葛根具有抗糖尿病[2]、降血壓[3]、抗氧化[4]、抗骨質(zhì)疏松[5]和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用[6]。

對(duì)葛根生物活性的深入探索表明，葛根多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖的作用[7,8]。宋淑珍等[9]對(duì)不同純度葛根多糖進(jìn)行了生物活性比較，結(jié)果表明不同提取過(guò)程會(huì)影響葛根多糖的抗氧化能力及其生物活性。蔡春沉等[10]對(duì)葛根多糖對(duì)2 型糖尿病大鼠的治療作用及機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)葛根多糖可以有效改善2 型糖尿病大鼠的相關(guān)生化指標(biāo)，具有降血糖和降血脂作用，具有一定的抗氧化能力。楊長(zhǎng)友[11]采用平板打洞法研究了葛根多糖的抑菌活性，結(jié)果表明葛根多糖對(duì)供試菌種有明顯的抑制作用，其中對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用最強(qiáng)。崔恒祥等[12]使用陰離子交換和凝膠滲透色譜法從野葛根水提取物中分離出一種水溶性葡聚糖并分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)，證明該多糖能顯著抑制過(guò)氧化氫所致的PC12 細(xì)胞損傷。Kim 等[13]發(fā)現(xiàn)葛根多糖通過(guò)TLR4 膜受體傳導(dǎo)信號(hào)誘導(dǎo)小鼠脊髓中樹(shù)突細(xì)胞（DC 細(xì)胞）成熟。

巨噬細(xì)胞是參與炎癥反應(yīng)啟動(dòng)的重要炎癥細(xì)胞，通過(guò)分泌大量促炎介質(zhì)和促炎細(xì)胞因子，在眾多炎癥疾病的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體可以識(shí)別并與多糖結(jié)合，經(jīng)各種信號(hào)傳導(dǎo)通路將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一系列的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達(dá)。植物多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用主要通過(guò)改變其形態(tài)、吞噬活性、細(xì)胞因子表達(dá)量等來(lái)實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為，天然活性物質(zhì)具有代替抗生素來(lái)提高機(jī)體免疫應(yīng)答的潛能。脂多糖在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和導(dǎo)致各種炎癥疾病中發(fā)揮著重要作用，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的化合物[14]。本文從對(duì)粉葛、葛根粗多糖以及粉葛均一多糖研究較少的抗炎活性入手，以小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，以探究其抗炎活性的不同及其可能的機(jī)制。首先測(cè)定了三種不同多糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的毒性，后面通過(guò)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)炎癥，在三種不同多糖作用后檢測(cè)炎癥因子NO、IL-6 和TNF-α釋放的變化，根據(jù)其活性的不同最后對(duì)葛根粗多糖發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制進(jìn)行了探究，為葛根在藥用開(kāi)發(fā)領(lǐng)域奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 細(xì)胞、藥物與試劑

RAW264.7 細(xì)胞，ATCC 細(xì)胞庫(kù)；粉葛粗多糖（FGC）、葛根粗多糖（GGC）、粉葛均一多糖（FGJ），江西中醫(yī)藥大學(xué)課題組自制；胎牛血清，Gibco 公司；DMEM、PBS，北京索萊寶科技有限公司；脂多糖，美國(guó)Sigma 公司；BCA 蛋白定量試劑盒，上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；ELISA 試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司；iNOS、COX-2，Proteintech 公司、p-p65、p65、IκBα、p-IκBα、β-actin 抗體，美國(guó)CST公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Syber Green，翌圣生物科技股份有限公司；AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；JW-3401CO2 培養(yǎng)箱，江西省立康科技有限公司；TS2 顯微鏡，Nikon 公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；HC-3018R 低溫高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；TD5Z 離心機(jī)，北京市華瑞科學(xué)器材有限公司；HX-20G2 恒溫金屬浴，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；Bio-Rad 蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀、Bio-Rad 高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像儀，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；Prism 7500 熒光定量PCR 儀，美國(guó)ABI公司；NanoDrop 微量分光光度計(jì)，Thermo Fisher 科技公司；InfiniteM200PRO 酶標(biāo)儀，瑞士TECAN 公司；Gallios 流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗多糖的制備

稱(chēng)取30.0 g 粉葛（或葛根）于1000 mL 三頸瓶中，加入600 mL 純凈水，在恒溫電熱套中進(jìn)行回流提取，溫度升至100 ℃開(kāi)始計(jì)時(shí)，提取時(shí)間為120 min，120 min 后倒出提取液，加入600 mL 純凈水，進(jìn)行第二次的提取，將兩次提取液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加壓濃縮至掛壁，冷卻至室溫加入1:2 體積比的95%乙醇進(jìn)行醇沉，靜置過(guò)夜，過(guò)濾后將沉淀用純凈水復(fù)溶，離心后上清液進(jìn)行干燥，記錄粗多糖質(zhì)量，粉葛粗多糖含量經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定為76.35%，野葛粗多糖含量經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定為70.97%。

1.2.2 粉葛均一多糖的制備稱(chēng)取適量粉葛粗多糖用蒸餾水充分溶解后，用HP-20 大孔樹(shù)脂柱進(jìn)行脫色除蛋白，吸附12 h 后，用蒸餾水洗脫至多糖全部流出（苯酚-硫酸法監(jiān)測(cè)），冷凍干燥即得脫色和除蛋白后的粗多糖。稱(chēng)取純化后的粉葛粗多糖3 g，加適量蒸餾水使其充分溶解，離心取上清后上樣到葡聚糖凝膠G-200 中，用超純水洗脫至沒(méi)有顏色，取中間段進(jìn)行含量測(cè)定，得到含量為94.64%。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)RAW264.7 細(xì)胞。細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，傳代細(xì)胞。之后取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 FGC、GGC 以及FGJ 的細(xì)胞毒性檢測(cè)

收集細(xì)胞沉淀，稀釋細(xì)胞使密度為 1×105cells/mL，各取100 μL 細(xì)胞懸液加入96 孔板中過(guò)夜使其完全貼壁。分為對(duì)照組、加藥組。加藥組分別加入FGC、GGC 以及FGJ（10、20、40 μg/mL）預(yù)處理24 h，每組重復(fù)6 孔。棄上清，每孔加100 μL 10% CCK8，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)其OD 值。求得細(xì)胞存活率。

存活率/%=(OD給藥-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)

1.2.5 FGC、GGC 以及FGJ 對(duì)NO 釋放的影響

收集細(xì)胞沉淀，稀釋細(xì)胞使密度為 4.0×105cells/mL，各取500 μL 細(xì)胞懸液加入24 孔板中過(guò)夜使其完全貼壁。分為對(duì)照組、模型組、加藥組。加藥組分別加入FGC、GGC 以及FGJ（10、20、40 μg/mL）預(yù)給藥4 h，加入LPS（1 μg/mL）孵育24 h。最后，每組各吸取50 μL 上清轉(zhuǎn)移至96 孔板中，然后每孔加入50 μL 的Griess 試劑A 和B，酶標(biāo)儀于540 nm 處檢測(cè)其OD 值。

1.2.6 FGC、GGC 以及FGJ 對(duì)TNF-α、IL-6炎癥因子釋放的影響

將1.2.3 中各組細(xì)胞剩余上清液稀釋2 倍，通過(guò)ELISA 試劑盒檢測(cè)FGC、GGC 以及FGJ 對(duì)TNF-α、IL-6 產(chǎn)生量的影響。

1.2.7 GGC 對(duì)iNOS/COX-2 蛋白表達(dá)的影響

收集細(xì)胞沉淀，稀釋細(xì)胞使密度為 4.0×105cells/mL，各取2 mL 細(xì)胞懸液加入6 孔板中過(guò)夜使其完全貼壁。分為對(duì)照組、模型組、加藥組。加藥組加入GGC（10、20、40 μg/mL）預(yù)給藥4 h，然后加入LPS（1 μg/mL）孵育24 h，吸凈上清，裂解細(xì)胞后分離得到總蛋白，用BCA 試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蛋白上樣量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)Western blotting 法對(duì)iNOS、COX-2、β-actin 進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 GGC 對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）通路的影響

按1.2.5 方法接種細(xì)胞。加藥組加入GGC（10、20、40 μg/mL）預(yù)給藥4 h，然后加入LPS（1 μg/mL）孵育2 h，吸凈上清，裂解細(xì)胞后分離得到總蛋白，用BCA 試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蛋白上樣量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)Western blotting 法對(duì)p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、β-actin 進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.9 GGC 對(duì)IL-6、TNF-α的mRNA 表達(dá)的影響

按1.2.5 方法接種細(xì)胞。加藥組加入GGC（10、20、40 μg/mL）預(yù)給藥4 h，然后加入LPS（1 μg/mL）孵育24 h，吸凈上清，裂解細(xì)胞后用Trizol 提取得到RNA，紫外分光檢測(cè)RNA 濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明得到cDNA。最后擴(kuò)增cDNA。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列表Table 1 Sequences of primers

1.2.10 GGC 對(duì)ROS 產(chǎn)生的影響

收集細(xì)胞沉淀，稀釋細(xì)胞使密度為3×105cells/mL，各取2 mL 細(xì)胞懸液加入6 孔板中過(guò)夜使其完全貼壁。分為對(duì)照組、模型組、加藥組。加藥組加入GGC（10、20、400 μg/mL）預(yù)給藥4 h，加LPS（1 μg/mL）孵育24 h。24 h 后，用探針DCFH2-DA（1 μg/mL）孵育40 min。吸凈上清，各孔用冷的PBS 清洗2 遍，各孔加入100 μL胰蛋白酶消化2 min，之后用500 μL 完全培養(yǎng)基停止消化，收集細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS 含量。

1.2.11 GGC 對(duì)Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)的影響

按1.2.5 方法接種細(xì)胞。加藥組加入GGC（10、20、40 μg/mL）預(yù)處理4 h，然后加入LPS（1 μg/mL）孵育24 h，吸凈上清，裂解細(xì)胞后分離得到總蛋白，用BCA 試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蛋白上樣量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)Western blotting 法對(duì)Nrf2、HO-1 進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)通過(guò)GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較通過(guò)單因素方差分析的方法進(jìn)行，p＜0.05 認(rèn)為有顯著性差異，p＞0.05 則無(wú)顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 FGC、GGC 以及FGJ 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活性的影響

使用CCK8 試劑盒檢測(cè)FGC、GGC 以及FGJ 對(duì)細(xì)胞活力的作用效果，各組分別加入濃度為10、20、40 μg/mL 的FGC、GGC 以及FGJ 作用24 h（圖1），檢測(cè)該濃度范圍內(nèi)的細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示各組細(xì)胞的存活率均與對(duì)照組基本一致，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性作用，且表現(xiàn)出一定的促增殖作用。各組之間沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05）。說(shuō)明該濃度范圍內(nèi)不會(huì)大幅度改變細(xì)胞的增殖，也說(shuō)明后續(xù)實(shí)驗(yàn)不會(huì)因細(xì)胞增殖受到影響。

2.2 FGC、GGC 以及FGJ 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 釋放NO 的影響

NO 是多種生物功能的重要中介物[15]，在炎癥細(xì)胞模型中，可以通過(guò)NO 釋放量減少來(lái)判斷炎癥反應(yīng)是否得到改善[16]。由圖2 可知，模型組NO 產(chǎn)生量與對(duì)照組相比均有大幅的提升（p＜0.0001），已成功誘導(dǎo)炎癥模型；在FGC 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，在濃度為40 μg/mL 時(shí)與模型組相比出現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），其余兩組無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。在FGJ 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，隨著多糖含量的增加，各濃度下NO 的釋放量均顯著降低，但當(dāng)FGJ 濃度升高時(shí)，NO 的釋放量呈上升趨勢(shì)，無(wú)濃度依賴(lài)性。只有在GGC 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，隨著濃度的增加，各濃度下NO 的釋放量與模型組相比均顯著減少，抑制率分別為15.55%、26.45%、38.46%，說(shuō)明GGC 具有明顯的降低NO 分泌的作用。

2.3 FGC、GGC 以及FGJ 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞TNF-α、IL-6 炎癥因子釋放的影響

IL-6 作為一種重要的炎癥介質(zhì)，可以通過(guò)其促炎作用誘發(fā)各種炎癥反應(yīng)[17,18]。從圖3 中可知，模型組與對(duì)照組的 IL-6 產(chǎn)生量相比存在顯著性差異（p＜0.0001），已成功構(gòu)建炎癥模型；在FGC、FGJ實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，加藥組IL-6 的分泌量與模型組相比均無(wú)顯著性差異（p＞0.05），表明對(duì)IL-6 的分泌無(wú)抑制效果。而在GGC 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，隨著多糖濃度的增加，各濃度下IL-6 的釋放量均顯著減少，抑制率分別為23.78%、39.00%、55.87%，說(shuō)明GGC 具有明顯的降低IL-6 分泌的作用。

在與炎癥相關(guān)的多種疾病中，TNF-α水平過(guò)高能引發(fā)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、釋放多種炎癥因子、引起氧化應(yīng)激[19]。從圖4 中可以看出，各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分泌TNF-α的結(jié)果與誘導(dǎo)分泌IL-6 的結(jié)果一致，均只在GGC 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，隨著多糖濃度的增加，各濃度下NO 的釋放量與模型組相比均顯著減少，抑制率分別為28.44%、46.69%、52.90%，說(shuō)明GGC 具有明顯的降低TNF-α分泌的作用。

本文中所用粉葛與葛根粗多糖針對(duì)其特征本課題組已發(fā)表一項(xiàng)專(zhuān)利[20]，證明多糖的質(zhì)量百分含量在70%以上，小分子化合物的質(zhì)量百分含量為0.0005%～2.0%，剩余為淀粉、水分、灰分等物質(zhì)。且本研究已表明粉葛粗多糖無(wú)抗炎活性，因此認(rèn)為葛根粗多糖中作為主要成分的多糖在發(fā)揮抗炎作用，其發(fā)揮作用的機(jī)制將繼續(xù)深入研究。

2.4 GGC 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞iNOS、COX-2 蛋白表達(dá)的影響

iNOS 在受到炎癥刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的NO 與超氧陰離子，超氧陰離子與NO 反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生有害的氧化劑損傷機(jī)體，導(dǎo)致各種炎癥發(fā)生[21]。COX 有COX-1、COX-2、COX-3 共3 種，其中COX-2 為誘導(dǎo)酶，是可以催化炎癥介質(zhì)的關(guān)鍵酶[22]。從圖5 中可知，在LPS作用后，顯著提高了iNOS、COX-2 蛋白的表達(dá)量，已成功誘導(dǎo)炎癥模型。與模型組比較，不同濃度GGC抑制iNOS、COX-2 的表達(dá)，對(duì)COX-2 蛋白的抑制率分別為43.50%、77.46%、95.05%，對(duì)iNOS 蛋白的抑制率分別為44.37%、28.68%、29.28%，與2.2 的研究結(jié)果基本一致。說(shuō)明GGC 能夠降低iNOS、COX-2蛋白的表達(dá)。

2.5 GGC 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中NF-κB 信號(hào)通路的影響

轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 是調(diào)節(jié)參與不同炎癥反應(yīng)過(guò)程的多種基因的關(guān)鍵因子之一，它通過(guò)一系列炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的mRNA 表達(dá)控制最終免疫反應(yīng)[23]，從圖6 中知，LPS 作用后，顯著提高p-p65、p-IκBα蛋白的表達(dá)量，不同濃度的GGC 對(duì)p-p65 蛋白的抑制率分別為31.22%、62.67%、27.18%，對(duì)p-IκBα蛋白的抑制率分別為11.98%、16.37%、28.45%。說(shuō)明GGC能降低NF-κB 信號(hào)通路磷酸化蛋白的水平，而且能夠抑制IκBα的降解，證明GGC 是通過(guò)作用于NF-κB 信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗炎的作用。

2.6 GGC 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中IL-6、TNF-α的mRNA 表達(dá)的影響

如圖7 所示，與模型組相比，細(xì)胞中TNF-α、IL-6 mRNA 的表達(dá)呈降低趨勢(shì)（p＜0.01），各濃度下NO 的釋放量與模型組相比均顯著減少，IL-6 抑制率分別為39.37%、52.60%、57.70%，TNF-α抑制率分別為72.94%、73.65%、81.68%。與2.3 的研究結(jié)果一致，說(shuō)明GGC 具有明顯的降低IL-6、TNF-α的mRNA 表達(dá)的作用。

2.7 GGC 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)的影響

HO-1 是Nrf2 下游基因，氧化應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2 被激活進(jìn)入核后將啟動(dòng)HO-1 轉(zhuǎn)錄表達(dá)而催化降解血紅素、一氧化碳等，抑制氧化應(yīng)激損傷[24]。Keap1-Nrf2 -ARE可以分為兩部分，一部分在細(xì)胞質(zhì)，一部分在細(xì)胞核。通常情況下Keap1 與Nrf2 在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合，這時(shí)是處于未激活狀態(tài)，如果一直未激活，Nrf2 會(huì)被降解；如果受到某種刺激，Keap1-Nrf2 的結(jié)合就不穩(wěn)定，Nrf2 被釋放出來(lái)，被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與ARE 結(jié)合，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯出一系列相關(guān)蛋白，發(fā)揮生理功能。氧化應(yīng)激是炎癥反應(yīng)的一個(gè)組成部分，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物如白三烯(LT)、血栓素A2（TXA2）等都是促炎介質(zhì)。從圖8 中可知，1 μg/mL 的LPS 作用后，Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)量減少，已構(gòu)建炎癥模型。與模型組比較，GGC 促進(jìn)Nrf2、HO-1 蛋白的表達(dá)，說(shuō)明GGC 通過(guò)Nrf2/HO-1 通路發(fā)揮抗炎作用。

2.8 GGC 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞釋放ROS 的影響

Nrf2 是一種轉(zhuǎn)錄因子，能協(xié)調(diào)大量細(xì)胞保護(hù)基因的基礎(chǔ)和應(yīng)激誘導(dǎo)激活，它可以調(diào)節(jié)下游的抗氧化還原酶等蛋白的活性來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)ROS 的失衡，防止ROS 在機(jī)體內(nèi)累積，抑制機(jī)體氧化應(yīng)激[25]。從圖9 中可知，通過(guò)流式細(xì)胞分析，對(duì)照組ROS 的釋放量低，用1 μg/mL 的LPS 作用后，ROS 釋放量顯著提高，已構(gòu)建炎癥模型。GGC 均可抑制ROS 的增加，抑制率分別為37.29%、41.05%、54.09%，說(shuō)明GGC 能夠減少細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，與2.7 的研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明GGC 有明顯的抗炎作用。

多糖的抗炎作用作為其多種藥理活性之一，眾多學(xué)者已經(jīng)通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)多糖的抗炎效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。體外炎癥主要采用LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞建立模型，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大部分集中于潰瘍性結(jié)腸炎模型。研究表明，多糖可以從抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌、調(diào)控中性粒細(xì)胞、改善腸道菌群和腸黏膜屏障等方面發(fā)揮抗炎作用。

正北芪多糖[26]可顯著提高UC 小鼠結(jié)腸組織的抗氧化能力，升高模型小鼠體內(nèi)SOD 活力，降低NOS、MDA 和NO 水平，緩解UC 的炎癥；枸杞多糖[27]可顯著降低細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量；黃芪多糖[28]可通過(guò)改善巨噬細(xì)胞形態(tài)，恢復(fù)巨噬細(xì)胞增殖能力，從而改善腸黏膜的損傷及抑制腸道炎癥反應(yīng)；木棗多糖[29]通過(guò)增加小鼠糞便中SCFAs 的濃度以及雙歧桿菌、擬桿菌、乳酸桿菌等益生菌菌群的數(shù)量來(lái)發(fā)揮抗炎抑菌的作用。

本文通過(guò)研究葛根多糖下調(diào)NF-κB 中相關(guān)蛋白的磷酸化水平與上調(diào)Nrf2/HO-1 蛋白的表達(dá)量，調(diào)控炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄，降低促炎因子分泌以及降低蛋白iNOS 和COX-2 的表達(dá)量從而發(fā)揮治療炎癥的作用，與之前的研究結(jié)果相互印證。但是，多糖的抗炎機(jī)制往往是通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)等方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和腸道菌群方面密不可分。因此，進(jìn)一步研究揭示葛根多糖在治療潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸炎及調(diào)節(jié)腸道菌群方面的作用機(jī)制具有十分重要的意義。

3 結(jié)論

3.1 本研究以L(fǎng)PS所誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥細(xì)胞模型來(lái)研究粉葛粗多糖（FGC）、葛根粗多糖（GGC）以及粉葛均一多糖（FGJ）對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。由結(jié)果可知，F(xiàn)GC、FGJ不能抑制模型組中NO及TNF-α、IL-6 的產(chǎn)生，而GGC 具有與之相反的效果，在濃度為10～40 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，可以有效的抑制炎癥的發(fā)生。從作用機(jī)制來(lái)看，GGC 能夠有效的抑制iNOS和COX-2 的表達(dá)，且能降低NF-кB 磷酸化蛋白的表達(dá)水平，提高Nrf2、HO-1 蛋白的表達(dá)水平，降低ROS的產(chǎn)生，并對(duì)TNF-α、IL-6 的mRNA 表達(dá)有抑制作用。

3.2 本文在前期完成了對(duì)粉葛均一多糖與粉葛粗多糖的抗炎活性研究，發(fā)現(xiàn)純化后的多糖并未表現(xiàn)出更好的抗炎活性，因此首先對(duì)葛根粗多糖的活性進(jìn)行研究，證明其有抗炎活性后下一步將對(duì)其進(jìn)行純化并研究其活性及作用機(jī)制。