費(fèi)利華，覃 丹，唐 歡

[1． 福建省泉州海外交通史博物館，福建泉州 362000；2． 館藏文物有害生物控制研究國(guó)家文物局重點(diǎn)科研基地(重慶中國(guó)三峽博物館)，重慶 400015]

0 引 言

微生物是導(dǎo)致有機(jī)文物生物劣化的主要因素之一，同時(shí)也是文物保護(hù)領(lǐng)域長(zhǎng)久以來(lái)面臨的重大難題[1]。微生物種類(lèi)繁多，代謝活動(dòng)十分旺盛，代謝類(lèi)型也呈現(xiàn)多樣化，對(duì)木質(zhì)文物破壞極大。木質(zhì)文物的主要組成成分是碳、氫、氧和氮。構(gòu)成木材的主要物質(zhì)是纖維素和半纖維素(占70%)、木質(zhì)素(占25%)，其余5%為各種鹽類(lèi)、可溶性糖、酚和萜類(lèi)等[2-3]。通常木材由管胞細(xì)胞組成，該細(xì)胞的細(xì)胞壁由許多細(xì)小的纖維絲組成，而在外層的初生壁中微纖維絲無(wú)規(guī)則的排列著，內(nèi)層組成次生壁，因此纖維素是構(gòu)成木材細(xì)胞壁的框架，是影響木材強(qiáng)度的主要因素。木質(zhì)文物出土前多埋藏于土壤中或淹沒(méi)在水體中，而土壤和水體均是微生物良好的棲息場(chǎng)所，具有微生物繁殖生長(zhǎng)所需的各種因子(如pH、含水量、有機(jī)質(zhì)等)，為各類(lèi)微生物的生長(zhǎng)提供了有利條件[1，3-4]。由于水解作用，木材中的一些可溶性組分如單寧會(huì)溶解于水而流失，構(gòu)成木材基本的成分多糖鏈或多肽部分或全部斷裂，形成單鏈；由于微生物的作用，多糖鏈會(huì)被逐步分解成水和二氧化碳，并造成木質(zhì)文物的腐爛。木質(zhì)文物被腐蝕、降解后，化學(xué)成分與顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著性的變化，許多較細(xì)的纖維組織消失了，木質(zhì)的強(qiáng)度大大喪失[2-3，5]。微生物對(duì)木材的危害主要是木腐菌、著色菌和霉菌等真菌以及一些能夠分解纖維素的細(xì)菌引起的各種損害。其中以木腐菌的破壞性最為嚴(yán)重，木腐菌通常是指能夠侵蝕分解木材細(xì)胞壁而攝取其所需的養(yǎng)分致使木材腐朽的一類(lèi)微生物，包括細(xì)菌和真菌，但主要以真菌為主[6]。著色菌與霉菌主要攝取木材細(xì)胞腔中的物質(zhì)為養(yǎng)分，而對(duì)細(xì)胞壁物質(zhì)無(wú)多大影響。著色菌僅僅改變木質(zhì)的顏色，霉菌則主要引起文物生霉。生霉的主要影響是侵害木材、使木材局部酸性增加，滋生過(guò)程中留下各種色素污染木材等[6]。以微生物對(duì)木質(zhì)文物中纖維素的分解為例，細(xì)菌中的好氣性噬纖維菌(Sporocytophagasp．)、厭氣性的梭菌(Clostridiumsp．)、維單胞菌屬(Cellulomonassp．)、纖維弧菌屬(Cellvibriosp．)，真菌中的木霉屬(Trichodermasp．)、曲霉屬(Aspergillussp．)、青霉屬(Penicilliumsp．)、蠟傘屬(Hygrophorussp．)、奇果菌屬(Grifolasp．)，放線菌中的鏈霉菌等，均能分解纖維素，在纖維素酶的作用下，使木材中的全纖維素和木質(zhì)素遭受到破壞，從而導(dǎo)致木質(zhì)文物的損毀[7]。因此，木質(zhì)文物中微生物類(lèi)群的解析是眾多木質(zhì)文物預(yù)防性保護(hù)的重要前期基礎(chǔ)，也是微生物病害發(fā)生時(shí)針對(duì)性高效防護(hù)的重要保障。

泉州灣宋代海船于1974年發(fā)掘出土，是我國(guó)發(fā)掘的第一艘體量大，年代早的遠(yuǎn)洋貿(mào)易木帆船，也是研究我國(guó)古代海外交通史、對(duì)外貿(mào)易史、造船史等不可多得的實(shí)物資料，屬于國(guó)家珍貴一級(jí)文物，具有重要的保護(hù)價(jià)值[7-8]。泉州灣宋代海船的保護(hù)是國(guó)內(nèi)乃至亞洲大型海洋出水木質(zhì)文物保護(hù)的先例，出土后在當(dāng)時(shí)有限的條件下采取先安裝復(fù)原再緩慢自然陰干脫水的特有保護(hù)方式保存了船體，但未脫鹽、復(fù)原安裝時(shí)使用了大量的鐵釘且長(zhǎng)期處于一個(gè)相對(duì)開(kāi)放的環(huán)境中展示[8-11]。這是泉州宋船特殊的保存狀況。目前，船體結(jié)構(gòu)基本穩(wěn)定，但船體局部存在糟朽、表面降解等多種形式的病害。根據(jù)對(duì)泉州宋代海船保存現(xiàn)狀的調(diào)查研究，船木中含有的鹽分在開(kāi)放式保存環(huán)境中產(chǎn)生的物理、化學(xué)作用是船體木材劣化的主要因素，但是否同時(shí)存在微生物作用值得探究，因此，極有必要對(duì)船木中存在的微生物類(lèi)群開(kāi)展研究。全面了解古船微生態(tài)現(xiàn)狀，不僅有助于深入分析揭示船木劣化機(jī)理，同時(shí)有助于發(fā)現(xiàn)現(xiàn)存的微生物隱患問(wèn)題，為后續(xù)微生物的預(yù)防性保護(hù)工作打下基礎(chǔ)。因此，本研究通過(guò)對(duì)船體保存區(qū)域不同部位的木材進(jìn)行了采樣，采用高通量擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)分析研究不同木材類(lèi)型的組成的古船船體微生物的組成類(lèi)群及分布規(guī)律，解析船體中是否存在對(duì)其本身有害的致腐微生物類(lèi)群，為后續(xù)該船體的微生物病害防治工作提供重要的參考，也可以對(duì)泉州海外交通史博物館目前對(duì)宋船的開(kāi)放式展覽的微生物病害風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，并為后續(xù)開(kāi)展展覽環(huán)境的整體調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 古沉船樣品

本實(shí)驗(yàn)所用樣品采自福建省泉州市海外交通史博物館保藏的宋代古沉船船體糟朽的不同部位，具體采樣位置區(qū)分和木材材質(zhì)詳見(jiàn)表1。

表1 采集樣本編號(hào)及所在古沉船部位

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1古船樣本微生物的16SrRNA和ITS擴(kuò)增子測(cè)序 用Mo Bio強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒提取采集到的古船木材樣本總DNA。取5 μL樣本DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，使用無(wú)菌水稀釋樣本濃度至1 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。以稀釋后的基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)并使用引物S-D-Bact-0341-b-S-17(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和S-D-Bact-0785-a-A-21(5’-GACTACHVG GGTATCTAATCC-3’)擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA V3+V4高變區(qū)域[12]，使用引物ITS3_KYO2(5’-GATGAAGAACGYAGYRAA-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3’)引物擴(kuò)增真菌ITS2區(qū)域[13]。不同的樣品的反向引物加上不同的標(biāo)簽序列以便于區(qū)分混合在一起測(cè)序的樣品。所有的PCR反應(yīng)體系均為30 μL，每個(gè)樣本一式三份，PCR混合液包括：15 μL Phusion?高保真PCR Master Mix(New England Biolabs)；0.5單位AccuPrimerTM Taq DNA聚合酶(Life Technologies，USA)；0.2 μM正反向引物和10 ng模板DNA。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1min，98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將三次PCR產(chǎn)物混合，經(jīng)Gene JET凝膠提取試劑盒(Thermo Scientific)純化，高靈敏度DNA芯片的Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies，Germany)分析純化樣品的粒徑分布。再根據(jù)NEB Next?UltraTMDNA文庫(kù)制備試劑盒的說(shuō)明書(shū)制備文庫(kù)并索引標(biāo)記。Qubit@2.0 Fluorometer(Thermo Scientific，U．S．A)和Agilent Bioanalyzer 2100 system(Agilent Technologies，Germany)檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量，最后由Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)上機(jī)測(cè)序(北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司，中國(guó)北京)。

1．2．2數(shù)據(jù)拼接和預(yù)處理 根據(jù)overlapping雙末端序列FLASH軟件(V1．2．7，http：//ccb．jhu．edu/software/FLASH/)[3]合并正反引物序列，根據(jù)不同的標(biāo)簽序列將序列與其對(duì)應(yīng)樣品進(jìn)行歸類(lèi)，獲得raw tags。將raw tags經(jīng)QIIME(V1．7．0，http：//qiime．org/index．Html)軟件[14]過(guò)濾掉連續(xù)高質(zhì)量(≥Q20)堿基數(shù)小于總長(zhǎng)度75%的tags，最終得到clean tags[15]檢測(cè)獲得的clean tags的質(zhì)量。UCHIME算法(http：//www．drive5．com/usearch/manual/uchime_algo．html)[16-17]檢測(cè)并去除嵌合體，以便得到可用于下游分析用的有效tags。然后根據(jù)UPARSE軟件包(Uparse v7．0．1001)使用UPARSE-OTU和UPARSE-OUT ref算法將得出的有效序列按照97%序列相似性聚類(lèi)分成不同的可操作分類(lèi)單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)，同時(shí)剔除所有樣本范圍內(nèi)只出現(xiàn)一次的OTUs。最后用RDP classfier將每個(gè)OTU的代表序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)殚喸~典將英文物種名稱(chēng)翻譯成中文[18-19]。

1．3 統(tǒng)計(jì)分析

用QIIME軟件包通過(guò)主成分分析(PCA)將獲得的OTUs進(jìn)行聚類(lèi)分析。QIIME能夠進(jìn)行Weighted unifrac PCoA分析或者Unweighted unifrac PCoA分析，可以在OTU的水平上反映各樣品間或者不同組間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，即β多樣性[20]。微生物類(lèi)群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系用KRONA[21]進(jìn)一步列出。計(jì)算α多樣性指數(shù)Chao1，ACE，Shannon，Simpson和coverage，這些指數(shù)反映了不同樣品微生物類(lèi)群的多樣性和豐度[22]。

2 結(jié)果與討論

2．1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及有效性分析

不同部位的古沉船樣品的高通量擴(kuò)增子測(cè)序得到的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及質(zhì)控信息如圖1和圖2所示。細(xì)菌測(cè)定結(jié)果表明，25個(gè)測(cè)序樣本累計(jì)的原始序列經(jīng)拼接和嵌合體過(guò)濾后得到3 004 779條平均長(zhǎng)度為468 bp的細(xì)菌序列，在97%相似水平上將其歸類(lèi)得到2 500 948個(gè)OTUs(圖1)。其中B19樣品包含的細(xì)菌豐度最高，而B(niǎo)13樣本包含的細(xì)菌豐度最低，各樣品分布圖如圖1。真菌測(cè)定結(jié)果顯示，25個(gè)測(cè)序樣本累計(jì)的原始序列經(jīng)拼接和嵌合體過(guò)濾后得到3 979 377條平均長(zhǎng)度為303 bp的真菌序列，在97%相似水平上將其歸類(lèi)得到3 894 302個(gè)OTUs。其中B8樣品包含的真菌豐度最高，而B(niǎo)23樣本包含的真菌豐度最低，各樣品分布圖如圖2。以上分析結(jié)果表明，本次所有待測(cè)樣本中的細(xì)菌和真菌測(cè)序數(shù)據(jù)量及有效性均達(dá)到正常值，測(cè)序數(shù)據(jù)可以用于后續(xù)物種注釋及多樣性分析。

圖1 宋船船體樣品中細(xì)菌OTUs分布圖Fig.1 Distribution of bacterial OTUs in different samples of the Song Dynasty shipwreck

圖2 宋船船體樣品中真菌OTUs分布圖Fig.2 Distribution of fungal OTUs in different samples of the Song Dynasty shipwreck

2．2 細(xì)菌多樣性分析

為研究各樣本的物種組成，對(duì)所有測(cè)序樣本獲得的Effective Tags，以0.97的一致性(Identity)進(jìn)行OTUs聚類(lèi)，然后對(duì)OTUs的序列進(jìn)行物種注釋[20]。根據(jù)每個(gè)OTU的細(xì)菌序列生成不同的細(xì)菌類(lèi)群信息。分析結(jié)果表明，所有樣品所含主要細(xì)菌類(lèi)群在門(mén)分類(lèi)水平上，變形菌門(mén)(Proteobacteria)為主要優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)，占所有樣品門(mén)類(lèi)的78.08%，分布在所有樣品中，其在樣品B8(96.12%)中所占比例最高，樣品B4(93.99%)、B2(93.21%)次之，在樣品B21(4.00%)中所占比例最低；其次為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)(13.23%)，分布在所有樣品中，其在樣品B21(95.64%)中所占比例最高，樣品B5(36.39%)、B17(25.40%)次之，在樣品B8(0.42%)中所占比例最低；此外還有放線菌門(mén)(Actinobacteria)(5.72%)，分布在所有樣品中，其在樣品B17(27.17%)中所占比例最高，樣品B1(14.42%)、B10(10.74%)次之，在樣品B21(0.16%)中所占比例最低；擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)(1.06%)，分布在所有樣品中，其在樣品B22(36.70%)中所占比例最高，樣品B24(26.25%)、B23(18.47%)次之，在樣品B15(0.04%)中所占比例最低；此外還有一些豐度含量低于1%的細(xì)菌門(mén)類(lèi)，分別是藍(lán)藻菌門(mén)(Cyanobacteria)(0.20%)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)(0.07%)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)(0.07%)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)(0.05%)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)(0.02%)以及未分類(lèi)(Unclassfied)(0.23%)及其他門(mén)類(lèi)(圖3)。

在屬分類(lèi)水平上，所有樣品所含主要細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)，占所有樣品屬類(lèi)的13.65%，分布在所有樣品中，其在樣品B20(28.46%)中所占比例最高，樣品B24(28.34%)、B4(24.85%)次之，在樣品B21(1.10%)中所占比例最低；其次為芽孢桿菌屬(Bacillus)(6.88%)，分布在所有樣品中，其在樣品B21(69.06%)中所占比例最高，樣品B5(18.26%)、B17(11.67%)次之，在樣品B19(0.08%)中所占比例最低；假單胞菌屬(Pseudomonas)(3.95%)，分布在所有樣品中，其在樣品B3(14.73%)中所占比例最高，樣品B15(11.79%)、B4(11.11%)次之，在樣品B21(0.32%)中所占比例最低；馬賽菌屬(Massilia)(3.69%)，分布在除樣品B14以外的所有樣品中，其在樣品B23(13.23%)中所占比例最高，樣品B20(11.76%)、B22(9.73%)次之，在樣品B19(0.07%)中所占比例最低；短波單胞菌屬(Brevundimonas)(3.61%)，分布在所有樣品中，其在樣品B22(14.61%)中所占比例最高，樣品B24(7.26%)、B6(6.52%)次之，在樣品B13(0.18%)中所占比例最低；副球菌屬(Paracoccus)(2.50%)，分布在除樣品B14以外的所有樣品中，其在樣品B22(12.34%)中所占比例最高，樣品B6(5.58%)、B24(5.55%)次之，在樣品B15(0.09%)中所占比例最低；甲基營(yíng)養(yǎng)菌屬(Methyloversatilis)(2.40%)，分布在除樣品B21和B24以外的所有樣品中，其在樣品B8(8.04%)中所占比例最高，樣品B5(7.45%)、B23(6.33%)次之，在樣品B22(0.02%)中所占比例最低；鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(2.36%)，分布在除樣品B14以外的所有樣品中，其在樣品B22(6.38%)中所占比例最高，樣品B20(5.71%)、B24(5.30%)次之，在樣品B1(0.17%)所占比例最低；其他屬類(lèi)有志賀氏菌屬(Shigella)(1.92%)，分布在除樣品B19以外的所有樣品中；鏈霉菌屬(Streptomyces)(1.76%)，分布在除樣品B6、B8、B13和B15以外的所有樣品中；弧菌屬(Vbrio)(1.05%)，分布在除樣品B2、B19、B20和B24以外的所有樣品中；甲基桿菌屬(Methylobacterium)(1.07%)，分布在除樣品B15以外的所有樣品中；耶爾森式菌屬(Yersinia)(1.01%)，分布在除樣品B5、B13、B19和B24以外的所有樣品中。除此之外，在所有樣品中還存在許多未分類(lèi)的(Unclassfied)(43.35%)菌屬(圖4)，它們中的許多微生物只被鑒定到了門(mén)的分類(lèi)水平，而屬的分類(lèi)水平暫時(shí)還不能夠界定，由此說(shuō)明目前的高通量測(cè)序技術(shù)方法還有待進(jìn)一步改善和提升。以上分析結(jié)果表明，在門(mén)和屬的分類(lèi)水平上船體不同區(qū)域的真菌組成類(lèi)群的種類(lèi)高度相似，沒(méi)有顯著性差異，但不同樣品間相同微生物類(lèi)群的相對(duì)豐度含量存在一定的差異，且船體整體的真菌微生物類(lèi)群保持了較好的穩(wěn)定和多樣性。

圖3 宋船船體細(xì)菌在門(mén)類(lèi)水平上相對(duì)豐度柱形圖Fig.3 Column chart of relative abundance of bacteria in different samples at the phylum level

圖4 宋船船體細(xì)菌在屬的分類(lèi)水平相對(duì)豐度柱形圖Fig.4 Column chart of relative abundance of bacteria in different samples at the genus level

對(duì)所有樣品高通量測(cè)序OTUs根據(jù)非加權(quán)unifrac兩種距離對(duì)所有樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal Coordinates Analysis，PCoA)(圖5)，以考察各樣品物種的聚集情況。分析結(jié)果表明，樣品B21與其他樣品之間的矩陣距離整體相距均較遠(yuǎn)，表明樣品B21與其他樣品之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差別較大；對(duì)局部而言，樣品B1、B13、B14和B15之間矩陣距離較近，說(shuō)明這四個(gè)樣品之間的細(xì)菌群落組成較為相似；同樣地，樣品B20、B22和B24，樣品B18和B23，樣品B3和B4之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也較為接近。以上分析結(jié)果表明，對(duì)于船體不同部位的細(xì)菌群落組成具有一定的差異性，但這種差異性與船體的木材類(lèi)型和所處結(jié)構(gòu)位置的關(guān)聯(lián)性不明顯。

圖5 宋船船體不同樣品的細(xì)菌類(lèi)群PCoA分析Fig.5 PCoA analysis of bacterial groups in different samples of the Song Dynasty shipwreck

2．3 真菌多樣性分析

根據(jù)每個(gè)OTU的真菌序列生成不同的真菌類(lèi)群信息，所有樣品所含主要真菌類(lèi)群在門(mén)分類(lèi)水平上，子囊菌門(mén)(Ascomycota)為主要優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)，占所有樣品門(mén)類(lèi)的93.68%，分布于所有樣品中，其在樣品B23(99.86%)中所占比例最高，樣品B8(99.67%)、B2(98.04%)次之，在樣品B1(86.35%)中相對(duì)豐度含量最低；其次為擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)(4.19%)，分布在所有樣品中，其在樣品B12(13.12%)中相對(duì)豐度含量最高，樣品B4(9.07%)、B19(6.03%)次之，在樣品B23(<0.01%)中所占比例最低；還有球囊菌門(mén)(Glomeromycota)(<0.01%)僅在樣品B25中有極少量分布，以及一些未分類(lèi)(Unclassfied)(2.13%)門(mén)類(lèi)(圖6)。由此可見(jiàn)，在門(mén)的分類(lèi)水平上船體不同區(qū)域的真菌群落組成高度相似。

在屬分類(lèi)水平上，所有樣品所含主要真菌類(lèi)群中枝孢霉屬(Cladosporium)為主要優(yōu)勢(shì)屬類(lèi)，占所有樣品屬類(lèi)的12.26%，分布于所有樣品中，其中在樣品B17(36.02%)中所占比例最高，樣品B22(30.88%)次之，在樣品B6(1.07%)中所占比例最低；其次為假絲酵母菌屬(Candida)(5.93%)，分布于除樣品B14、B15、B20、B22和B24以外的所有樣品中，其在樣品B23(59.41%)中所占比例最高，樣品B3(23.19%)次之，在樣品B10(0.01%)中所占比例最低；扁孔腔菌屬(Lophiostoma)(5.66%)分布于除樣品B2、B3、B4、B8、B12、B21、B22和B23以外的所有樣品中，其在樣品B24(18.48%)中所占比例最高，樣品B14(18.11%)次之，在樣品B1(<0.01%)中分布極少；外瓶霉屬(Hortaea)(3.15%)分布于除樣品B12和B23以外的所有樣品中，其在樣品B24(9.16%)中所占比例最高，樣品B10(7.07%)次之，在樣品B4(<0.01%)中分布極少；其他還存在一些豐度相對(duì)較低的真菌類(lèi)群，包括毛殼屬(Chaetomium)(2.66%)、曲霉屬(Aspergillus)(1.64%)、枝氯霉屬(Ramichloridium)(1.41%)、假尾孢菌屬(Pseudocercospora)(1.05%)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)(0.68%)、小光殼屬(Leptosphaerulina)(0.61%)、帚霉屬(Scopulariopsis)(0.46%)、節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)(0.40%)、隔孢伏革菌屬(Peniophora)(0.30%)、原毛平革菌屬(Phanerochaete)(0.24%)、毛孢耳屬(Trichosporon)(0.19%)、尾孢菌屬(Cercospora)(0.16%)、孢子絲菌屬(Sporothrix)(0.13%)、偽暗球殼菌屬(Paraphaeosphaeria)(0.13%)和彎孢菌屬(Curvularia)(0.11%)等。遺憾的是，在本次微生物高通量測(cè)序中各個(gè)樣品中也還存在大量的未鑒定到屬的分類(lèi)水平和許多完全未被分類(lèi)水平鑒定(Unclassfied)(52.13%)的類(lèi)群(圖7)，造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于當(dāng)前真菌類(lèi)擴(kuò)增子測(cè)序和分子技術(shù)的限制，有待進(jìn)一步提升。以上分析結(jié)果表明，在門(mén)和屬的分類(lèi)水平上船體不同區(qū)域的真菌組成類(lèi)群的種類(lèi)高度相似，沒(méi)有顯著性差異，但不同樣品間相同微生物類(lèi)群的相對(duì)豐度含量存在一定的差異，且船體整體的真菌微生物類(lèi)群保持了較好的穩(wěn)定和多樣性。

圖6 宋船船體真菌在門(mén)類(lèi)水平上相對(duì)豐度柱形圖Fig.6 Column chart of relative abundance of fungi in different samples at the phylum level

圖7 宋船船體真菌在屬的分類(lèi)水平相對(duì)豐度柱形圖Fig.7 Column chart of relative abundance of fungi in different samples at the genus level

對(duì)所有樣品高通量測(cè)序OTUs根據(jù)非加權(quán)unifrac兩種距離對(duì)所有樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析(圖8)，以考察各樣品物種的聚集情況。結(jié)果顯示，樣品B4與其他樣品之間的微生物群落組成差別較大，樣品B8、B12和B22之間的微生物群落組成較為接近，樣品B2、B3和B23之間的微生物群落組成較為接近，樣品B1、B17和B21之間的微生物群落組成較為接近，其余樣品之間的微生物群落組成均在不同程度上接近。以上的這些分析結(jié)果與細(xì)菌群落的分布組成具有類(lèi)似的規(guī)律，即對(duì)于船體不同部位的真菌群落組成具有一定的差異性，但這種差異性與船體的木材類(lèi)型和所處結(jié)構(gòu)位置的關(guān)聯(lián)性不顯著。

圖8 宋船船體不同樣品的真菌類(lèi)群PCoA分析Fig.8 PCoA analysis of fungal groups in different samples of the Song Dynasty shipwreck

2.4 討論

1) 宋船船體微生物的來(lái)源。微生物種類(lèi)繁多，具有代謝能力強(qiáng)、代謝方式多樣、易變異且繁殖速度快等特點(diǎn)，能夠適應(yīng)各種各樣的生境，因此廣泛分布于各種環(huán)境中，形成了獨(dú)特的微生物生態(tài)系統(tǒng)。有研究表明，館藏有機(jī)文物的微生物來(lái)源途徑主要包括文物本體發(fā)掘前期自身所攜帶的內(nèi)生微生物、館藏環(huán)境所擴(kuò)散的微生物以及養(yǎng)護(hù)文博人員日常失誤接觸所帶來(lái)的微生物[1]。前期的研究中，本課題組采用經(jīng)典的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的研究方法對(duì)該船的展存環(huán)境微生物類(lèi)群進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬(Bacillus)和枝孢霉屬(Cladosporium)是環(huán)境中主要的優(yōu)勢(shì)微生物類(lèi)群[10]。本次高通量測(cè)序結(jié)果顯示在船體的各個(gè)部位發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的優(yōu)勢(shì)微生物類(lèi)群的存在，例如不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和枝孢霉屬(Cladosporium)等，表明這些類(lèi)群的微生物可能來(lái)源于船體展存的環(huán)境。同時(shí)，在本次研究中也發(fā)現(xiàn)了一些前期空氣環(huán)境中未發(fā)現(xiàn)的微生物類(lèi)群存在于船體中，包括細(xì)菌中的假單胞菌屬(Pseudomonas)、馬賽菌屬(Massilia)、波單胞菌屬(Brevundimonas)、副球菌屬(Paracoccus)，甲基營(yíng)養(yǎng)菌屬(Methyloversatilis)，以及真菌中的枝氯霉屬(Ramichloridium)、假尾孢菌屬(Pseudocercospora)、節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)和尾孢菌屬(Cercospora)等。相關(guān)文獻(xiàn)表明這些微生物類(lèi)群多次在水環(huán)境、土壤環(huán)境以及植物內(nèi)生組織中被發(fā)現(xiàn)[23-27]，但在常見(jiàn)的環(huán)境微生物的分析研究中卻未見(jiàn)報(bào)道[28-31]，因此推測(cè)這些微生物類(lèi)群可能源自于該船體發(fā)掘的水環(huán)境中，屬于文物館藏前本體所攜帶，但這一推測(cè)結(jié)果仍待進(jìn)一步研究證實(shí)。

2) 宋船船體微生物群落的特殊性。值得關(guān)注的是，本次在船體中發(fā)現(xiàn)的一些細(xì)菌和真菌具有能夠耐受高鹽環(huán)境的特性，例如細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌屬假單胞菌屬(Pseudomonas)[32]、芽孢桿菌屬(Yersinia)[33]，真菌中的枝孢霉屬(Cladosporium)[34]、曲霉屬(Aspergillus)[35]均可在高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)。曹宏明等在紅樹(shù)林根際土壤中分離獲得了5株假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)的細(xì)菌菌株，其均可耐受70 g/L的高鹽環(huán)境[32]。豐開(kāi)慶等從土壤中分離獲得一株芽孢桿菌屬的細(xì)菌菌株TYUT105，可耐受50 g/L的高鹽環(huán)境[33]。因此，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，可推測(cè)宋船船體中這些耐鹽的微生物類(lèi)群的存在可能與該條船體前期修復(fù)保護(hù)時(shí)未脫鹽處理有關(guān)，船體長(zhǎng)期處于一定鹽濃度狀態(tài)下進(jìn)而影響了其船體微生物類(lèi)群組成的特異性。

3) 宋船船體微生物的潛在危害。微生物是造成木材降解糟朽的重要生物因素之一[36]。細(xì)菌對(duì)木材的腐朽作用發(fā)生在幾乎缺氧的狀況下，比如長(zhǎng)期埋在土里、置于水中或長(zhǎng)期處于高濕狀態(tài)，而真菌對(duì)木材的破壞程度與速度又遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)菌，特別是木材腐朽真菌[37]。大多纖維素降解真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生菌絲，菌絲具有很強(qiáng)的穿透能力，能穿透植物角質(zhì)層的阻礙，緊緊依附和穿插在纖維物質(zhì)上，增大降解酶與纖維物質(zhì)的接觸面積，從而加快降解速率[38]。目前大量文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道可降解木質(zhì)纖維素的細(xì)菌、真菌和放線菌200余種[39]，其中最為突出的類(lèi)群是青霉菌(Penicillium)[40]、曲霉菌(Aspergillus)[41]、芽孢桿菌(Bacillus)[42]和鏈霉菌(Streptomyces)[43]。景如賢等[42]從常年落葉土壤中篩選到菌株芽孢桿菌屬(Bacillus)D2，該菌株以3%的接種比例、pH值為7.0、溫度37 ℃和轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)3 d后得到最高酶活，纖維素酶活為1.456 IU/mL。寧振興等[44]篩選到的塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)GYC501菌株，培養(yǎng)36 h后，纖維素酶活高達(dá)418.2 U/mL。李季蓉等發(fā)現(xiàn)在一定條件下枝孢霉屬枝孢霉屬的纖維素降解酶活力高達(dá)2.09 IU/mL[45]。陳岳等對(duì)“南海一號(hào)”船體發(fā)掘期間的微生物研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬是其主要的致病菌屬，該屬微生物類(lèi)群對(duì)木材中的纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)具有較大的破壞性[46]。宮秀杰等和李季蓉等關(guān)于微生物產(chǎn)生纖維素分解酶活力的研究表明芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢霉屬(Cladosporium)等菌株都是高產(chǎn)纖維素酶的菌株[46-49]。與這些已有的研究相比，在本研究中船體不同部位的優(yōu)勢(shì)微生物類(lèi)群中同樣發(fā)現(xiàn)了大量芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、曲霉屬和枝孢霉屬等類(lèi)群微生物的存在，由于已有的研究報(bào)道表明它們具有顯著的纖維素分解能力，在一定條件下可能會(huì)對(duì)船體木材造成一定的降解糟朽破壞，因此，在后續(xù)該船體的預(yù)防性保護(hù)中應(yīng)該定期對(duì)船體進(jìn)行一定的微生物防治維護(hù)，以益于船體的長(zhǎng)期保存。

4) 宋船船體微生物的整體防治策略。溫度和相對(duì)濕度是影響?zhàn)^藏文物保存的兩項(xiàng)重要環(huán)境因素，同時(shí)也是造成文物生物病害的2個(gè)主控環(huán)境因子。較高的溫濕度是微生物大量繁殖的有利條件，當(dāng)溫度超過(guò)25 ℃，相對(duì)濕度高于65%時(shí)，木質(zhì)文物就容易滋生微生物，造成霉菌大面積蔓延，致使文物表面和內(nèi)部的微生物群落失衡，進(jìn)而造成強(qiáng)烈的腐蝕和破壞[50-52]。因此，嚴(yán)格控制館藏文物的環(huán)境對(duì)預(yù)防和減緩文物微生物病害的發(fā)生與損傷具有重要意義。通常開(kāi)放式環(huán)境下不可控的相對(duì)濕度導(dǎo)致高濕氣候環(huán)境下木材含水率提高，進(jìn)而提升微生物對(duì)木材的降解能力。在本研究中發(fā)現(xiàn)，整個(gè)船體不同糟朽部位采集的相對(duì)豐度最高的真菌屬均為枝孢霉屬(Cladosporium)，研究發(fā)現(xiàn)枝孢菌在潮濕環(huán)境中易于生長(zhǎng)[10，53-55]，因此在船體的后期預(yù)防性保護(hù)中一定要考慮船體本身和環(huán)境溫濕度隱患，尤其在整個(gè)船體的展存環(huán)境中增大對(duì)濕度的調(diào)控，避免枝孢霉屬類(lèi)菌株的大量繁殖，從而保護(hù)船體免受微生物降解侵害。

3 結(jié) 論

本次對(duì)泉州宋船船體不同區(qū)域的微生物群落組成調(diào)查與分析結(jié)果表明，船體各個(gè)部位中存在穩(wěn)定且豐富的微生物類(lèi)群。盡管船體不同部位的細(xì)菌和真菌群落組成具有一定的差異性，但這種差異性與船體的木材類(lèi)型和所處結(jié)構(gòu)位置的關(guān)聯(lián)性不顯著。其中船體不同保存區(qū)域中存在的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種屬為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)，真菌以枝孢霉屬(Cladosporium)、假絲酵母菌屬(Candida)和扁孔腔菌屬(Lophiostoma)為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。此外本次檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、枝孢霉屬和曲霉屬均可降解木材纖維素，這些微生物在一定環(huán)境條件下生長(zhǎng)爆發(fā)則會(huì)威脅船體的保存，具有一定的潛在隱患。因此，在后續(xù)該船體的保護(hù)中應(yīng)該定期對(duì)船體進(jìn)行微生物病害防治處理，嚴(yán)格控制船體的展存環(huán)境溫濕度，以益于船體的長(zhǎng)期保存。