韓慧琴，狄慧，荊燕燕，楊桂英，尹貽珍

（張家口市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 張家口 075000）

0 引言

木香(Aucklandiae Radix )來源于菊科植物木香的干燥根。木香可以行氣止痛、調(diào)中導(dǎo)滯，如果患者有脾胃氣滯，脘腹脹滿或者出現(xiàn)疼痛，并且伴有噯氣、惡心、嘔吐的患者，可以應(yīng)用木香進(jìn)行治療[1]。木香在臨床上是比較常用的一種中藥材，古代醫(yī)家將其列為上品[2]。其主要含有萜類，蒽醌類，生物堿類，黃酮類等。目前關(guān)于木香的研究多為含量測(cè)定[3]、藥理作用[4]和藥材的指紋圖譜[5]等方面。關(guān)于木香配方顆粒的報(bào)道較少。

中藥配方顆粒是通過現(xiàn)代化的制藥手段，以中藥飲片為初始原料，用水煎煮提取、放冷過濾、減壓干燥、制粒成形，其藥效物質(zhì)、性味歸經(jīng)、功能主治和傳統(tǒng)中藥湯劑一致，既能保證中醫(yī)辨證論治的特點(diǎn)、又可以靈活加減，方便患者服用，衛(wèi)生有效[6-8]。國家藥監(jiān)局發(fā)布2021年第22 號(hào)公告，結(jié)束中藥配方顆粒試點(diǎn)工作，說明配方顆粒具備很多優(yōu)點(diǎn)，并且已被接受，故國家鼓勵(lì)生產(chǎn)配方顆粒。但是從質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來看，目前檢驗(yàn)項(xiàng)目還不是很全面，特別是安全性有效性方面還有待提高。因此，課題組參考有關(guān)文獻(xiàn)[9,10]采用HPLC 法建立了指紋圖譜及含量測(cè)定方法，可為木香配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)，可為其真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別提供參考手段。

1 儀器與試藥

LC-30AT 型高效液相色譜測(cè)定儀（配備二極管陣列檢測(cè)器）（日本島津公司）； e2695-2998（配備二極管陣列檢測(cè)器）型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；國家藥典會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（版本號(hào)為2012.130723）”；統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS 19.0）；BT125D 型精密十萬分之一電子天平（德國sartorius，分度：0.01mg）；DTC-27 型靜音型超聲波清洗機(jī)（湖北鼎泰高科有限公司）；木香烴內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)111524-201911，99.9%）和去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)111525-201912，99.5%）均來源于中檢院；15 批飲片分別購自四川（5 批）、云南（5 批）、廣東（3 批）和廣西（2 批）5 個(gè)省區(qū)，自制標(biāo)準(zhǔn)湯劑，批號(hào)分別為TJ01-TJ15。10 批樣品由2 個(gè)生產(chǎn)廠家提供，批號(hào)見表3。

色譜純乙腈和色譜純磷酸；超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱信息：Scienhome YWG C18（ P/N:96182540）；Welch，XB-CN（Part Number：00205-31043）；InertSustain AQ-C18（P/N:5020-89731）；GL Sciences，Inertsil ODS-3（Cat.No.5020-01732）；Agilent EXTEND C18（P.N.5188-5292），5 個(gè)廠家的色譜柱均為粒徑5μm，長(zhǎng)250mm，內(nèi)徑4.6mm。流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～5min，32%～50%A；5～35min，50%～68%A；35～36min，68%～32%A，36～46min，32%A；在225nm 的波長(zhǎng)處檢測(cè)；30 ℃的柱溫；體積流量：1.0mL/min，進(jìn)樣體積10μL；儀器顯示的去氫木香內(nèi)酯的理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3000。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

取15 批次木香藥材各200g，加水2000mL 煎煮1 小時(shí)，過濾，取濾渣加水1400mL 煎煮1 小時(shí)，過濾，合并濾液，低溫蒸干，15 批次平均出膏86.3g，平均出膏率為43.2%。

2.3 對(duì)照品溶液

稱取去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇溶解稀釋成每1mL 含去氫木香內(nèi)酯194.4μg、木香烴內(nèi)酯213.5μg 的溶液，用孔徑為0.45μm 的nylon 過濾膜過濾即得。

2.4 供試品溶液

分別精密稱取木香對(duì)照藥材0.25g；標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒，研細(xì)（四號(hào)篩）約0.5g；置150mL 帶有瓶塞的錐形瓶中，用大肚吸管精密量取甲醇50mL，加入錐形瓶中，用電子天平稱定重量后，超聲波提取( 功率260 瓦，頻率5 萬赫茲)30min，放冷，用0.45μm 的nylon 過濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.5 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性

取“2.3～2.4”項(xiàng)下的溶液各10μL 注入液相色譜儀，結(jié)果去氫木香內(nèi)酯峰與其它峰的分離度均大于1.5，且峰型好，表明專屬性強(qiáng)，見圖1。

圖1 HPLC 色譜圖（A）去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品（B）木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯混合對(duì)照品（C）木香藥材（D）木香配方顆粒（E）標(biāo)準(zhǔn)湯劑

2.5.2 線性關(guān)系考察

精密量取“2.3”項(xiàng)下去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品溶液，用移液槍分別精密量取4、10、50、80、200、400μL 置1mL 的量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度，配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣10μL，以對(duì)照品的進(jìn)樣濃度（μg/mL）A 為橫坐標(biāo)，以去氫木香內(nèi)酯峰面積積分值B 為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，去氫木香內(nèi)酯的回歸方程為A=15450 B-1151.4 (相關(guān)系數(shù)為0.9998) ，線性范圍為0.656～65.6μg/mL。

2.5.3 精密度

取“2.4”項(xiàng)下的同一供試品溶液（批號(hào)：20090511），連續(xù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)行測(cè)定。去氫木香內(nèi)酯的RSD 為0.8%，小于2.0%，表明儀器的精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性

取同一批木香配方顆粒（批號(hào)：20090511），研細(xì)，照“2.4”項(xiàng)下的方法同時(shí)稱取6 份供試品，用同一方法配制成供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算去氫木香內(nèi)酯的含有量RSD 為1.2%，小于2.0%，結(jié)果顯示該提取方法和儀器方法的重復(fù)性良好。

2.5.5 準(zhǔn)確度

分別稱取已知含量的木香配方顆粒（批號(hào)：20090511）研細(xì)，混勻，取9 份，每份約0.25g，精密稱定，每三份為一組，分別按樣品中含量的50%，100%，150%的量加入去氫木香烴內(nèi)酯對(duì)照品，按“2.4”項(xiàng)下的方法進(jìn)行提取制備。按上述“2.1”項(xiàng)下描述的色譜條件測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果回收率 RSD 值為0.7%，小于3.0%，見表1。表明該提取方法可行。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.5.6 穩(wěn)定性

取同一批木香配方顆粒（批號(hào)：20090511）的供試品溶液，在室溫（26℃）下放置，分別于0、1、2、3、6、12、18、24、48h 按上述“2.1”項(xiàng)下描述的色譜條件進(jìn)樣9 次，結(jié)果去氫木香內(nèi)酯含量的RSD 為0.8%，低于3.0%，表明制備好的溶液在26℃下可以放置48h。

2.5.7 耐用性

分別采用島津LC-30AT 型和Waters e2695-2998 型高效液相色譜儀，采用Scienhome YWG、Welch XB-CN、InertSustain AQ-C18、GL Sciences和Agilent EXTEND 5 個(gè)廠家的色譜柱按擬定的方法測(cè)定，結(jié)果去氫木香內(nèi)酯含量的RSD 為1.8%，表明不同廠家的儀器和色譜柱檢測(cè)效果良好。

2.5.8 樣品的測(cè)定

取10 批木香配方顆粒，按前述“2.4”項(xiàng)下描述的方法制備供試品溶液，按前述“2.1”項(xiàng)下描述的色譜條件測(cè)定并計(jì)算樣品中去氫木香內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果（n=2）

2.6 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.6.1 精密度

取同一份批號(hào)為20090511 的木香配方顆粒供試品溶液，按前述“2.1”項(xiàng)下描述的色譜條件批處理進(jìn)樣6 次，進(jìn)行測(cè)定，以3 號(hào)色譜峰（去氫木香內(nèi)酯）為參照計(jì)算6 次色譜圖中每個(gè)共同出現(xiàn)的色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積值的RSD,結(jié)果分別為0.7%,1.1%。表明7 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 與相對(duì)峰面積RSD 均小于2.0%，說明精密度良好。見圖3。

2.6.2 重復(fù)性

取同一批木香配方顆粒（批號(hào)：20090511），混勻，0.5g 共6 份，精密稱定，照“2.4”項(xiàng)下的提取方法配制供試品溶液，按前述“2.1”項(xiàng)下描述的色譜條件批處理進(jìn)樣分析,計(jì)算相對(duì)峰面積值和相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值。結(jié)果7 個(gè)共有峰與參照峰的相對(duì)峰面積值和相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均低于2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性

取同一份木香配方顆粒供試品溶液（批號(hào)：20090511），在室溫（26℃）下放置，分別于0、1、2、3、6、12、18、24、48h 按上述“2.1”項(xiàng)下描述的色譜條件進(jìn)樣9 次，以去氫木香內(nèi)酯峰為參照峰，計(jì)算7 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果均小于2.0%，表明制備好的溶液在26℃下可以放置48h。

2.6.4 耐用性

分別采用LC-30AT 型和e2695-2998 型高效 液 相 色 譜 儀，采 用Scienhome YWG、Welch、InertSustain、GL Sciences、Agilent EXTEND 5 個(gè)牌子的色譜柱按擬定的方法測(cè)定，以去氫木香內(nèi)酯峰為參照峰，計(jì)算7 個(gè)共有色譜峰的相對(duì)峰面積值和相對(duì)保留時(shí)間的RSD，結(jié)果均低于2.0%，結(jié)果顯示方法的儀器及色譜柱耐用性良好。

2.7 指紋圖譜的建立

2.7.1 分別精密吸取不同批次（S1-S10）的木香配方顆粒供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、標(biāo)準(zhǔn)湯劑溶液和對(duì)照藥材溶液批處理進(jìn)樣10μL，按“2.1”的色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。將10 批樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012），采用中位數(shù)法對(duì)10 批樣品的指紋圖譜進(jìn)行峰點(diǎn)校正，數(shù)據(jù)匹配分析，生成共有模式圖及對(duì)照指紋圖譜，見圖2、3，確認(rèn)7 個(gè)共有峰為特征峰，并用對(duì)照品圖譜進(jìn)行定位，確定2 號(hào)峰為木香烴內(nèi)酯，3 號(hào)峰為去氫木香內(nèi)酯，見圖3。以3 號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表3、4。10 批木香配方顆粒與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.989，0.989,0.982,0.990，0.989，0.989,0.972,0.972，0.973,0.980 相似度評(píng)價(jià)表明，10 批供試品指紋圖譜和對(duì)照品指紋圖譜的相關(guān)性良好，且7 個(gè)共有峰與標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的峰都能一一對(duì)應(yīng)。對(duì)比相似度較小樣品與其他樣品的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)其共有峰相對(duì)保留時(shí)間比較一致，主要差異表現(xiàn)在色譜峰的面積上，即含量的差異，為不同廠家的樣品。表明廠家不同樣品的質(zhì)量存在一定的差異。

圖2 10 批樣品指紋疊加圖譜

圖3 對(duì)照指紋圖譜

表3 10 批木香配方顆粒共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表4 10 批木香配方顆粒共有峰的相對(duì)峰面積

2.8 化學(xué)模式識(shí)別

2.8.1 聚類分析

以指紋圖譜中標(biāo)定的7 個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為變量，采用SPSS 19.0 軟件中的平方Eudidean距離對(duì)10 批樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖4。根據(jù)聚類分析結(jié)果，以類間距為指標(biāo)，當(dāng)聚類標(biāo)定距離定為25 時(shí)，10 批樣品聚為一大類，當(dāng)聚類重新標(biāo)定距離為4 時(shí)，樣品S7、S8、S9 聚為第二小類，其余樣品聚為第三小類。該分析與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果一致。

2.8.2 主成分分析

對(duì)10 批樣品進(jìn)行主成分分析，以指紋圖譜中標(biāo)定的7 個(gè)共有峰峰面積為分析變量，將其導(dǎo)入SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析，得到主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率，見表5，圖5?？梢娗? 個(gè)主成分的特征值均大于1，累積貢獻(xiàn)率為98.453%，基本可以反映各主成分的全部信息。

表5 主成分特征值和貢獻(xiàn)率

2.8.3 綜合評(píng)價(jià)

以各主成分對(duì)應(yīng)貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)，計(jì)算10 批樣品的主成分得分和綜合得分，并進(jìn)行排序，結(jié)果見表6。綜合得分排名為S9>S5>S6>S4>S8>S7>S1>S2>S10>S3。其中生產(chǎn)日期較近的批次主成分得分較高，生產(chǎn)日期較遠(yuǎn)的批次相對(duì)較低，另外，不同樣品批號(hào)中的藥材產(chǎn)地不同也導(dǎo)致其質(zhì)量有所不同。

表6 10 批樣品的主成分得分、綜合得分和排名統(tǒng)計(jì)

3 討論

實(shí)驗(yàn)過程中比較了甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇作為提取溶劑，結(jié)果甲醇提取效率最好；考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸等流動(dòng)相體系，考察了高效液相色譜儀和超高效液相色譜儀的檢測(cè)效果，最終確定了文中的方法，該條件下色譜峰信息豐富，分離度好，穩(wěn)定性高，可以作為控制木香配方顆粒的方法。

本實(shí)驗(yàn)通過高效液相色譜法對(duì)比研究木香藥材，標(biāo)準(zhǔn)湯劑和市售配方顆粒，找到指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，并進(jìn)行指紋圖譜的研究及相似度評(píng)價(jià)，對(duì)木香配方顆粒進(jìn)行了定性、定量評(píng)價(jià)，相似度都大于0.97，表明其質(zhì)量比較一致，且與標(biāo)準(zhǔn)湯劑圖譜也一致，可見該方法更具可靠性。但是通過與藥材圖譜進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)制成配方顆粒后木香烴內(nèi)酯的含量下降較多，故沒有選取木香烴內(nèi)酯進(jìn)行含量測(cè)定。而且其他峰也有變化，表明藥材與配方顆粒在成分方面有一定的差異，還有待研究。

采用聚類分析將10 批樣品分為3 類，主成分分析采用降維模式，將反映HPLC 指紋圖譜的多維特征參數(shù)用2 個(gè)主成分表示，可為木香配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。