馬燕凌，晏 菲，魏武杰，鄧 潔，李 黎，劉 莉，孫建海

（江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430000）

膀胱癌（BC）是泌尿生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，超70%的膀胱癌為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（NMIBC）［1］。臨床治療NMIBC 常先行經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)，然后以多柔比星行膀胱內(nèi)化學(xué)藥物治療（簡(jiǎn)稱化療）。然而，隨著NMIBC 分期和分級(jí)的增長(zhǎng)，復(fù)發(fā)率超過50%［2］。膀胱內(nèi)化療與靜脈內(nèi)輸注化療藥物一樣，不能完全消除癌細(xì)胞，同時(shí)，由于其靶向性差、副作用多等缺點(diǎn)，限制了多柔比星的療效［3］。近年來(lái)，細(xì)胞外囊泡（EVs）在腫瘤進(jìn)展和治療中的作用引起了廣泛關(guān)注［4］。細(xì)胞能釋放不同大小的微囊泡，在受到刺激后，細(xì)胞改變其骨架，導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)容物被包裹在細(xì)胞膜中，形成囊泡，隨后被釋放到細(xì)胞外空間，通過在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移生物活性和功能活性蛋白及RNA 來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞間通信［5］。載藥囊泡是腫瘤細(xì)胞來(lái)源的EVs經(jīng)過特殊處理，與常規(guī)化療藥物有機(jī)結(jié)合，形成以囊泡為載體的載藥微顆粒，具有靶向性和特異性高及副作用小等特點(diǎn)［6］。同時(shí)，β ?連環(huán)蛋白（β ?catenin）/ Notch1 通路與膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，對(duì)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡有顯著影響［7］。因此，本研究中探討了EVs 裝載多柔比星對(duì)人膀胱癌BIU ?87 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，及β ?catenin/Notch1 通路在其中的作用，為膀胱癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：240i型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Revco公司）；Z36HK 型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hermle 公司）；TE2000 ?U + DXM1200 型倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；BS ?1096B 型酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Real ?time PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI 公司）；BD FACSCanto 型流式細(xì)胞儀和BD 垂直電泳儀（美國(guó)BD 公司）；Tanon 1600型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

試藥：多柔比星（齊魯制藥有限公司，批號(hào)為2020064）；RPMI ?1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司）；PKH67試劑盒（美國(guó)Sigma公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國(guó)Amresco 公司）；膜聯(lián)蛋白（Annexin）V/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD 公司）；Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT ?PCR）試劑盒（瑞士Roche 公司）；RIPA 裂解液和Western blot 相關(guān)試劑（北京索萊寶生物技術(shù)公司）；糖原合成酶激酶?3β（GSK ?3β）、β ?catenin、Notch1、β ?actin抗體和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

細(xì)胞：人膀胱癌BIU ?87 細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和EVs 提取

在37 ℃、5% CO2條件下用含10% FBS 的RPMI ?1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)BIU ?87 細(xì)胞，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。將60 mL 含2% FBS 的培養(yǎng)基離心（30 900 r/min）過夜，去除血清中的EVs，用此培養(yǎng)基培養(yǎng)BIU ?87細(xì)胞（約5×107個(gè)），48 h內(nèi)收集上清，1 200 r/ min 離心10 min，經(jīng)0.45 μm 過濾器過濾；4 000 r / min 離心30 min，經(jīng)0.22 μm 過濾器過濾；30 900 r/ min 離心70 min，將沉淀溶于磷酸鹽緩沖液（PBS），即得EVs混懸液。

1.2.2 載藥囊泡制備

取多柔比星30 μg，溶于1 mL EVs 混懸液中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，9 168 r/ min 離心10 min，經(jīng)0.22 μm 過濾器過濾；30 900 r/ min 離心70 min，將沉淀溶于PBS，即得載藥囊泡混懸液。

1.2.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè)

細(xì)胞攝取EVs情況：向EVs混懸液和載藥囊泡混懸液中分別加入4 μL PKH67稀釋液，混勻，靜置3 min，用PBS終止染色，經(jīng)0.22 μm過濾器過濾；30 900 r/min離心70 min，將沉淀溶于PBS，即得PKH67 標(biāo)記的EVs 和PKH67 標(biāo)記的載藥囊泡。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BIU ?87 細(xì)胞，以5 × 103個(gè)/ 孔接種于96 孔板中（每孔200 μL），待細(xì)胞融合后分別加入PKH67標(biāo)記的EVs和PKH67標(biāo)記的載藥囊泡，靜置24 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取情況。

細(xì)胞增殖率：采用MTT 法。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（不進(jìn)行處理）、EVs 組（EVs 混懸液，100 個(gè)/ 細(xì)胞）、多柔比星組（0.3 μg 多柔比星）、載藥囊泡組（載藥囊泡混懸液，100個(gè)/細(xì)胞），以相應(yīng)方法處理細(xì)胞，44 h后加入MTT（每孔50 μL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜（每孔200 μL），緩慢振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白對(duì)照組。

細(xì)胞凋亡率：采用流式細(xì)胞法。按“細(xì)胞增殖率”項(xiàng)下分組及處理細(xì)胞，48 h后收獲細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌，1 000 r/min離心10 min，棄上清，分別加入5 μL Annexin V ?FITC 與PI，充分混勻后室溫避光孵育20 min，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

細(xì)胞中GSK ?3β，β ?catenin 和Notch1 mRNA 表達(dá)：采用RT ?PCR法。按“細(xì)胞增殖率”項(xiàng)下分組及處理細(xì)胞，48 h 后收獲細(xì)胞，加入Trizol 提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。反應(yīng)條件為，95 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。讀取循環(huán)閾值（Ct值），以2-ΔΔCt表示GSK ?3β，β ?catenin 和Notch1 mRNA 的表達(dá)量（以β ?actin 為內(nèi)參）。

細(xì)胞中GSK ?3β，β ?catenin 和Notch1 蛋白表達(dá)：采用Western blot 法。按“細(xì)胞增殖率”項(xiàng)下分組及處理細(xì)胞，48 h 后收獲細(xì)胞，各組分別加入100 μL RIPA 裂解液，進(jìn)行電泳（每孔20 μg），轉(zhuǎn)膜，加入GSK ?3β（1∶200）、β ?catenin（1∶400）和Notch1（1∶400）抗體孵育（4 ℃過夜）；用HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG 二抗（1∶5 000）在室溫下孵育30 min，顯色、采集圖像并分析（以β ?actin 為內(nèi)參）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，行單因素方差分析，多重比較采用SNK ?q檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A.空白對(duì)照組 B.EVs組 C.多柔比星組 D.載藥囊泡組圖2 載藥囊泡對(duì)BIU-87細(xì)胞增殖的影響A.Blank control group B.EVs group C.Doxorubicin group D.Drug ?loaded vesicle groupFig.2 Effect of drug-loaded vesicles on the proliferation of BIU-87 cells

2 結(jié)果

2.1 BIU-87 細(xì)胞攝取EVs 情況

EVs 組和載藥囊泡組BIU ?87 細(xì)胞內(nèi)PKH67 標(biāo)記的團(tuán)塊狀綠色熒光均勻，提示BIU ?87細(xì)胞可攝取EVs和載藥囊泡。詳見圖1。

圖1 BIU-87細(xì)胞攝取EVs和載藥囊泡情況Fig.1 The uptake of EVs and drug - loaded vesicles by BIU-87 cells

2.2 細(xì)胞增殖率及凋亡率

與空白對(duì)照組比較，EVs組細(xì)胞增殖率及細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與空白對(duì)照組及EVs 組比較，多柔比星組和載藥囊泡組細(xì)胞增殖率顯著降低、細(xì)胞凋亡率顯著升高，且載藥囊泡組更優(yōu)（P＜0.05）。詳見圖2和表1。

表1 各組細(xì)胞增殖率和凋亡率比較（±s，%，n=3）Tab.1 Comparison of proliferation rate and apoptosis rate of BIU-87 cells in each group（±s，%，n=3）

表1 各組細(xì)胞增殖率和凋亡率比較（±s，%，n=3）Tab.1 Comparison of proliferation rate and apoptosis rate of BIU-87 cells in each group（±s，%，n=3）

注：與空白對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與EVs組比較，bP ＜0.05；與多柔比星組比較，cP ＜0.05。表2及表3同。Note：Compared with those in the blank control group，aP ＜0.05；Compared with those in the EVs group，bP ＜ 0.05；Compared with those in the doxorubicin group，cP ＜0.05（for Tab.1 ?3）.

組別空白對(duì)照組EVs組多柔比星組載藥囊泡組細(xì)胞增殖率100.00±9.42 97.58±14.36 76.10±6.82ab 57.42±7.69abc細(xì)胞凋亡率1.84±0.27 2.29±0.49 5.78±0.82ab 9.30±0.75abc

2.3 GSK-3β，β-catenin 和Notch1 mRNA 表達(dá)水平

與空白對(duì)照組比較，EVs 組細(xì)胞中GSK ?3β、β ?catenin和Notch1 mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與空白對(duì)照組及EVs組比較，多柔比星組和載藥囊泡組細(xì)胞中GSK ?3β mRNA 表達(dá)水平顯著升高、β ?catenin和Notch1 mRNA 表達(dá)水平顯著降低，且載藥囊泡組更優(yōu)（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組細(xì)胞中GSK-3β、β-catenin和Notch1 mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of GSK-3β，β-catenin and Notch1 mRNA expression levels in cells in each group（±s，n=3）

表2 各組細(xì)胞中GSK-3β、β-catenin和Notch1 mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of GSK-3β，β-catenin and Notch1 mRNA expression levels in cells in each group（±s，n=3）

組別空白對(duì)照組EVs組多柔比星組載藥囊泡組GSK ?3β 1.00±0.15 0.96±0.11 1.32±0.08ab 1.56±0.13abc β ?catenin 1.00±0.07 1.04±0.13 0.87±0.09ab 0.72±0.10abc Notch1 1.00±0.14 0.98±0.07 0.85±0.11ab 0.70±0.10abc

2.4 GSK-3β，β-catenin 和Notch1 蛋白表達(dá)水平

與空白對(duì)照組比較，EVs 組細(xì)胞中GSK ?3β、β ?catenin和Notch1 蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與空白對(duì)照組及EVs組比較，多柔比星組和載藥囊泡組細(xì)胞中GSK ?3β 蛋白表達(dá)水平顯著升高、β ?catenin和Notch1 蛋白表達(dá)水平顯著降低，且載藥囊泡組更優(yōu)（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組細(xì)胞中GSK-3β，β-catenin和Notch1蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.3 Comparison of GSK-3β，β-catenin and Notch1 protein expression levels in cells in each group（±s，n=3）

表3 各組細(xì)胞中GSK-3β，β-catenin和Notch1蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.3 Comparison of GSK-3β，β-catenin and Notch1 protein expression levels in cells in each group（±s，n=3）

組別空白對(duì)照組EVs組多柔比星組載藥囊泡組GSK ?3β 0.42±0.09 0.45±0.13 0.73±0.06ab 0.89±0.10abc β ?catenin 0.38±0.05 0.38±0.06 0.25±0.04ab 0.13±0.03abc Notch1 0.49±0.06 0.46±0.07 0.30±0.05ab 0.08±0.03abc

3 討論

NMIBC 具有易侵犯、易轉(zhuǎn)移、易耐藥和復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，故急需新療法來(lái)增強(qiáng)NMIBC 對(duì)膀胱內(nèi)化療的敏感性。EVs 是細(xì)胞釋放的囊泡狀結(jié)構(gòu)，可被癌細(xì)胞有效吸收，使EVs 裝載化療藥物作用于癌細(xì)胞成為可能［8］。研究表明，載藥囊泡是以癌細(xì)胞來(lái)源的EVs作為化療藥物載體，攜帶化療藥物，可將藥物輸入癌細(xì)胞內(nèi)，具有極強(qiáng)的癌細(xì)胞親和力及較好的靶向性［9］。多柔比星是NMIBC 術(shù)后膀胱內(nèi)化療的首選藥物，通過抑制DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，但其在體內(nèi)缺乏特異性且清除過快，降低了化療有效性［10］。本研究中通過EVs 裝載多柔比星給藥，升高了BIU ?87 細(xì)胞凋亡率，降低了其增殖率，提示載藥囊泡可作為理想的敏化劑，增強(qiáng)化療藥物對(duì)膀胱癌細(xì)胞的殺傷力。同時(shí)，膀胱上皮屬移行上皮，其結(jié)構(gòu)中有一層圓頂狀細(xì)胞的淺層，這一結(jié)構(gòu)細(xì)胞排列在管腔表面，作為管腔和血流間不可穿透的屏障，可抑制載藥囊泡進(jìn)入更深的細(xì)胞層。然而，這種物理屏障可能由于其不規(guī)則的組織結(jié)構(gòu)而在膀胱癌組織中被破壞，使載藥囊泡進(jìn)入膀胱癌細(xì)胞［11］。本研究中主要關(guān)注了載藥囊泡對(duì)BIU ?87細(xì)胞的作用，其對(duì)正常膀胱細(xì)胞的作用將在后續(xù)的研究中完善。

β ?catenin/ Notch1 通路參與哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育、器官發(fā)生、細(xì)胞凋亡及各種癌細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)［12］。與β ?catenin/Notch1 通路中的正向調(diào)節(jié)因子β ?catenin不同，GSK ?3β 屬負(fù)調(diào)控因子，GSK ?3β 磷酸化β ?catenin 的氨基端絲氨酸/蘇氨酸，從而下調(diào)β ?catenin在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)，阻斷β ?catenin/Notch1 通路的激活，減弱β ?catenin/Notch1通路對(duì)凋亡的抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。作為β ?catenin/Notch1 通路的下游信號(hào)因子，Notch1已被證明是BC的腫瘤促進(jìn)因子，Notch1過表達(dá)促進(jìn)了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)程［14］。在鼻咽癌中，抑制Notch ?1 可增加Kruppel 樣因子4（KLF4）的表達(dá)，從而減少鼻咽癌細(xì)胞增殖和抑制腫瘤形成［15］。同時(shí)，轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA 的細(xì)胞增殖率明顯低于轉(zhuǎn)染Notch1 的細(xì)胞［16］。由于增殖與化療抗性有關(guān)，開發(fā)針對(duì)抗增殖的調(diào)節(jié)劑，可獲得新的化療增敏劑［17?18］。本研究結(jié)果顯示，載藥囊泡抑制β ?catenin/Notch1通路的作用明顯強(qiáng)于單用多柔比星。因此，β ?catenin/Notch1通路下調(diào)可能為抑制BC 細(xì)胞增殖提供了一個(gè)靶點(diǎn)，具有潛在的臨床意義。

綜上所述，EVs 裝載多柔比星抑制BIU ?87 細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用較單用多柔比星強(qiáng)，其機(jī)制可能與抑制β ?catenin/Notch1信號(hào)通路有關(guān)。