■陳 捷 王碭碭 武彥博 王燕南 陳 超 雷新建 李延華 姚軍虎*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西澳尼克奶山羊育種有限公司，陜西 富平 711700）

隨著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展，傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)手段已無(wú)法完全滿足高產(chǎn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需要，精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)為解決此瓶頸提供了新的方案。氨基酸在提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)力和飼料效率、維持機(jī)體健康等方面發(fā)揮重要作用[1]。氨基酸不僅是蛋白質(zhì)合成的前體物，還是體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)[2]。作為功能性氨基酸，亮氨酸除作為蛋白質(zhì)底物外，還可通過(guò)雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路調(diào)控動(dòng)物機(jī)體蛋白合成及分解代謝，如亮氨酸可促進(jìn)綿羊骨骼肌mTOR信號(hào)通路中4E-BP1和p70S6K的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌蛋白合成[3]；亮氨酸通過(guò)激活調(diào)控蛋白質(zhì)合成最主要的信號(hào)通路PI3K/Akt-mTOR軸，并抑制蛋白質(zhì)降解最主要的信號(hào)通路GCN2，提高奶牛胰腺腺泡細(xì)胞消化酶的合成，促進(jìn)小腸淀粉的消化利用，改善飼料報(bào)酬[4-5]。

氨基酸代謝包括合成和分解代謝，飼料消化吸收的氨基酸、機(jī)體組織蛋白質(zhì)動(dòng)員產(chǎn)生的氨基酸及體內(nèi)合成的非必需氨基酸均進(jìn)入血液，構(gòu)成機(jī)體氨基酸代謝庫(kù)，參與氨基酸的代謝。除作為信號(hào)分子調(diào)控機(jī)體蛋白質(zhì)合成代謝外，亮氨酸也參與動(dòng)物氨基酸代謝的調(diào)控[6-7]。乳蛋白的合成也需要氨基酸的參與[8]，然而，亮氨酸如何參與調(diào)控奶畜在泌乳期氨基酸代謝仍不清楚。一些研究也表明，支鏈氨基酸參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)[9]。因此，本研究在泌乳奶山羊飼糧中補(bǔ)充過(guò)瘤胃亮氨酸，并將賴氨酸（一般限制性氨基酸）作為對(duì)照，探究功能性氨基酸對(duì)泌乳奶山羊氨基酸代謝和免疫性能的影響，為功能性氨基酸在奶山羊生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

過(guò)瘤胃亮氨酸（rumen-protected leucine，RPLeu），初始含量70.7%，瘤胃液12 h 保留率85.4%，腸液12 h溶出度77.9%。過(guò)瘤胃賴氨酸（rumen-protected lysine，RP-Lys），初始含量60.9%，瘤胃液12 h保留率85.7%，腸液12 h 溶出度79.9%。產(chǎn)品購(gòu)自杭州康德權(quán)飼料有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

試驗(yàn)選用泌乳關(guān)中奶山羊，參照美國(guó)NRC（1985）奶山羊的營(yíng)養(yǎng)需要與試驗(yàn)場(chǎng)實(shí)際情況配制全混合日糧（total mixed ration，TMR），基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，基礎(chǔ)飼糧氨基酸水平見(jiàn)表2。

表2 基礎(chǔ)飼糧中主要氨基酸組成

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)在陜西澳尼克奶山羊育種有限公司進(jìn)行，試驗(yàn)流程及操作完全遵守西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)規(guī)章。本試驗(yàn)共選取45只初產(chǎn)關(guān)中泌乳奶山羊，泌乳期為（135±15）d，泌乳量為（2.06±0.45）kg/d，體重為（43.11±5.38）kg，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（CON 組，采食基礎(chǔ)飼糧）、過(guò)瘤胃亮氨酸添加組（LEU 組，基礎(chǔ)飼糧+10.6 g/d RP-Leu）及過(guò)瘤胃賴氨酸添加組（LYS 組，基礎(chǔ)飼糧+12.0 g/d RP-Lys），每組15 只。本試驗(yàn)氨基酸添加量參考Yu 等[10]研究成果（亮氨酸和賴氨酸小腸實(shí)際溶出量為5 g/d），根據(jù)產(chǎn)品氨基酸含量、過(guò)瘤胃率和小腸溶出率將過(guò)瘤胃亮氨酸和賴氨酸添加量定為10.6 g/d 和12.0 g/d。試驗(yàn)期為60 d，前15 d 為預(yù)試期，后45 d 為正試期。TMR 等量飼喂，日飼喂3次（06：30、13：00、19：30）。兩個(gè)處理組氨基酸均勻加入TMR中，日擠奶2次（04：30、16：30），全天自由飲水。

1.4 樣品收集

每個(gè)處理隨機(jī)抽取10只羊進(jìn)行樣品采集。于正試期第44天、第45天晨飼前1 h進(jìn)行頸靜脈分批次采血，采集后置于冰盒中迅速送回實(shí)驗(yàn)室，靜置30 min后3 500 r/min 離心15 min，取上清液分裝于2 mL 凍存管中，置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。于正試期第45天采集乳樣（每天擠奶2 次，按實(shí)際產(chǎn)奶量比例混合成全天樣）。乳樣品采集后置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.5 血清游離氨基酸測(cè)定

使用Exion LC AC 高效液相色譜儀（AB SCIEX）串聯(lián)QTRAP 5500 質(zhì)譜儀（AB SCIEX）分析測(cè)定血清游離氨基酸含量。采用4.6 mm×100 mm×2.7 μm InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色譜柱（Agilent）。質(zhì)譜儀裝配有電噴霧（electrospray ionization，ESI）作為離子源，為ESI+一種離子模式。主要參數(shù)為：氣簾氣：40 psi；碰撞氣壓力：Medium；離子噴霧電壓：5 500 V；溫度：650 ℃；離子源霧化氣1∶60 psi；離子源霧化氣2∶60 psi。

血清游離氨基酸前處理方法：取100 μL 血清樣品，加入300 μL 乙腈，渦旋15 s 后，13 000 r/min 離心5 min，取上清液通過(guò)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾后上機(jī)分析。

1.6 乳蛋白和乳水解氨基酸測(cè)定

乳蛋白使用Combi 500 乳成分分析儀（Bentley）測(cè)定。使用Agilent 1260高效液相色譜儀（Agilent）對(duì)乳水解氨基酸進(jìn)行分析，采用Eclipse AAA 4.6×150 mm 5-Micron色譜柱（Agilent），檢測(cè)器采用DAD二極管檢測(cè)器。水解氨基酸前處理采用酸水解法，具體操作步驟如下：

準(zhǔn)確稱取凍干乳樣50～200 mg，小心加入水解管中，注意盡量防止掛壁。小心加入1∶1的分析純鹽酸（約6 mol/L）10 mL。使用氮吹儀吹氮?dú)?5 min 后封管，置烘箱中于110 ℃水解22～24 h。水解后的樣品取出冷卻至室溫，開(kāi)管后用小漏斗和濾紙過(guò)濾到50 mL小容量瓶中，水解管用去離子水洗滌3 次，洗滌液過(guò)濾到容量瓶中，用去離子水洗滌濾紙，洗滌液也收集到小容量瓶中，定容至刻度線。吸取定容后的樣品1 mL，置RVC2-18 CDplus真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Christ）上脫酸。溫度60 ℃，脫至干燥，底部留有少許固體或痕漬為止。脫酸后的樣品，加入1 mL 樣品檸檬酸鈉緩沖液，置振蕩混合器上混合均勻，針管吸取少量，通過(guò)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾后上機(jī)分析。

1.7 血液免疫指標(biāo)測(cè)定

谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白和球蛋白采用Hitachi 7600 全自動(dòng)生化分析儀（Hitachi Group）檢測(cè)，血清免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA；Goat IgA ELISA Kit, F3869-A）使用上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒測(cè)定，血清白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6；Goat IL-6 ELISA Kit,JL22321）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β；Goat IL-1βELISA Kit, JL17446)、干擾素γ（interferonγ，IFN-γ；Goat IFN-γELISA Kit, JL13108）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α；Goat TNF-αELISA Kit, JL11962）使用上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒測(cè)定,主要涉及儀器是Synergy HT多功能酶標(biāo)儀（BioTek）。

1.8 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 23.0（SPSS, Inc., Chicago, IL,USA）單因素方差分析，組間采用LSD 法做多重比較。P＜0.05 代表差異顯著，0.05≤P＜0.10 代表存在顯著性趨勢(shì)，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧添加RP-Leu 和RP-Lys 對(duì)泌乳奶山羊靜脈血清游離氨基酸濃度的影響（見(jiàn)表3）

由表3 可知，Gln、Leu、Ile 和Ala 是奶山羊血清中含量較高的氨基酸。與CON組相比，LEU組顯著提高了血清中BCAA、Ile 和Thr 的濃度，降低了Pro 的濃度（P＜0.05），有提高Leu、Trp、TAA 和EAA 濃度的趨勢(shì)（0.05≤P＜0.10）。與LYS 組相比，LEU 組顯著提高了血清中BCAA、Ile 和Thr 的濃度，降低了Pro 的濃度（P＜0.05）。CON 組與LYS 組兩組間血清游離氨基酸含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 亮氨酸和賴氨酸對(duì)泌乳奶山羊血清游離氨基酸濃度的影響（μmol/L）

2.2 日糧添加RP-Leu 和RP-Lys 對(duì)泌乳奶山羊乳蛋白和氨基酸組成的影響（見(jiàn)圖1、表4）

由圖1 可知，日糧添加RP-Leu 和RP-Lys 對(duì)泌乳奶山羊產(chǎn)奶量以及乳蛋白合成量無(wú)影響（P＞0.05）。由表4可知，Pro、Glu、Leu和Asp是乳蛋白中含量較高的氨基酸，3組間氨基酸含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表4 亮氨酸和賴氨酸對(duì)泌乳奶山羊乳水解氨基酸濃度的影響（mmol/L）

圖1 亮氨酸和賴氨酸對(duì)泌乳奶山羊產(chǎn)奶量以及乳蛋白合成的影響

2.3 日糧添加RP-Leu 和RP-Lys 對(duì)泌乳奶山羊免疫性能的影響（見(jiàn)表5）

由表5可知，兩種氨基酸對(duì)泌乳奶山羊血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白、球蛋白、IgA、IL-6、IL-1β、IFN-γ和TNF-α無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。

表5 亮氨酸和賴氨酸對(duì)泌乳奶山羊免疫性能的影響

3 討論

動(dòng)物機(jī)體蛋白質(zhì)是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡體系，細(xì)胞不斷地將氨基酸合成蛋白質(zhì)，又將蛋白質(zhì)降解成氨基酸[11]。蛋白質(zhì)降解的氨基酸通過(guò)血液進(jìn)入氨基酸代謝庫(kù)，一部分又重新合成蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)組織蛋白質(zhì)的更新與演替[12]；另一部分氨基酸通過(guò)轉(zhuǎn)氨基、脫氨基或脫羧基反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成酮酸、氨、胺和非必需氨基酸等[13]。必需氨基酸只能通過(guò)食物供給，機(jī)體不能自身合成。蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的必需氨基酸被氧化分解將造成損失，影響機(jī)體蛋白質(zhì)的重新合成[14]。因此，降低必需氨基酸的氧化分解并充分利用必需氨基酸對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)合成具有重要作用。

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，除作為蛋白質(zhì)合成的底物外，一些氨基酸還以信號(hào)分子的形式參與機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的調(diào)控，如谷氨酰胺通過(guò)NF-κB和PI3K-Akt信號(hào)通路參與腸道健康的調(diào)控[15]，亮氨酸通過(guò)PI3K/Akt-mTOR 途徑參與蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)過(guò)程等[4]。在本研究中，選擇亮氨酸作為功能性氨基酸的代表，賴氨酸作為一般限制性氨基酸的代表，研究?jī)煞N氨基酸對(duì)奶山羊血清氨基酸代謝、乳蛋白和氨基酸組成的影響。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，日糧添加RP-Leu 提高了血清BCAA、Ile 和Thr 的濃度，有提高EAA、Leu、Trp 和TAA 濃度的趨勢(shì)。這與前人的研究結(jié)果相似，楊昕澗等[6]發(fā)現(xiàn)原奶中添加亮氨酸，可顯著提高犢牛血清His、Leu、Thr和EAA濃度，對(duì)TAA濃度也有提高的趨勢(shì)；Zheng 等[16]發(fā)現(xiàn)日糧添加亮氨酸增加荷斯坦?fàn)倥Ｑ逯蠱et、Thr、His 和EAA 的濃度。血液氨基酸含量由供給量和利用量決定。氨基酸與葡萄糖代謝密切相關(guān)，提高葡萄糖總供應(yīng)量，可節(jié)約體內(nèi)氨基酸被用于合成葡萄糖的數(shù)量，有助于提高氨基酸的利用率[17]。亮氨酸已被證明可通過(guò)刺激胰腺α淀粉酶的合成與分泌，提高淀粉在荷斯坦?fàn)倥Ｐ∧c的消化率，促進(jìn)碳水化合物的高效利用，提高血糖水平[5]。本研究發(fā)現(xiàn)日糧添加RP-Leu 可提高血清Ile、Thr 和BCAA 等生糖氨基酸含量，可能是由于在亮氨酸的作用下，這3種氨基酸更少地作為底物進(jìn)入三羧酸循環(huán)或參與糖異生過(guò)程產(chǎn)生葡萄糖[18]。而LEU組血清Pro含量降低可能是因?yàn)槠淝绑w物α-酮戊二酸更多地參與三羧酸循環(huán)，導(dǎo)致Pro合成減少[19]（見(jiàn)圖2）。亮氨酸影響氨基酸代謝的另一個(gè)可能原因是亮氨酸可抑制EAA的轉(zhuǎn)氨作用和氧化分解[20]。研究表明，亮氨酸可降低犢牛骨骼肌中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，抑制骨骼肌中EAA 的分解代謝，提高犢牛EAA 的利用效率[7]。

圖2 血清氨基酸可能參與糖代謝的代謝途徑

本研究結(jié)果顯示，日糧添加RP-Leu和RP-Lys對(duì)乳蛋白合成和氨基酸組成無(wú)影響。乳中水解氨基酸表示乳蛋白中氨基酸的組成，BCAA作為一種信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)牛乳腺的乳蛋白合成中起著重要作用[21-22]。本研究乳中氨基酸沒(méi)有受到亮氨酸的影響，可能是由于試驗(yàn)動(dòng)物處于泌乳中后期，此階段奶山羊所獲養(yǎng)分除滿足維持和產(chǎn)奶需要外，還用于恢復(fù)產(chǎn)后失去的體重[23]。乳中氨基酸構(gòu)成相對(duì)穩(wěn)定也是本試驗(yàn)乳蛋白氨基酸組成無(wú)顯著性差異的重要原因之一，研究發(fā)現(xiàn)盡管日糧瘤胃可降解淀粉水平影響乳腺對(duì)氨基酸的利用，但是并未改變?nèi)榈鞍字邪被岬臉?gòu)成和含量[24]。雖然有研究表明支鏈氨基酸參與機(jī)體免疫調(diào)控[9]，但本研究中Leu未影響泌乳奶山羊機(jī)體健康，可以理解為與圍產(chǎn)期奶畜由于能量負(fù)平衡而導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝疾病相比，泌乳中后期的奶畜身體狀況較為良好[25]。

4 結(jié)論

本研究表明亮氨酸可提高泌乳奶山羊血清必需氨基酸中生糖氨基酸的含量，但亮氨酸調(diào)控血液氨基酸代謝的機(jī)理仍不明確，后續(xù)應(yīng)考慮利用多組學(xué)技術(shù)解釋相關(guān)機(jī)理。