孫 楠 王宇欣* 王平智 張 明 林 聰

(1.中國農(nóng)業(yè)大學 水利與土木工程學院，北京 100193； 2. 平頂山市農(nóng)業(yè)科學院，河南 平頂山 467001)

韭菜(

Allium

tuberosum

Rottl. ex Spreng.)是1種多年生植物，含有鐵和鋅等微量元素，且鈣含量豐富，可有效預防缺鐵性貧血。韭菜葉中富含谷氨酸、脯氨酸和氨基酸丙酸，是優(yōu)質(zhì)氨基酸提供者。韭菜葉還含有較多的總膳食纖維和不溶性膳食纖維，可有效促進胃腸道的蠕動，降低結直腸癌的風險。

內(nèi)生菌是1種在健康植物的大部分生命周期中寄生且不會給宿主植物帶來任何負作用的微生物(主要是真菌、細菌和放線菌)。根際微生物(Rhizosphere)是土壤微生物的一個子集，其富集和定殖受土壤pH、土壤微團聚體、氧氣含量、抗菌物種濃度、宿主植物的群體感應(Quorum-sensing mimicry)以及宿主植物根系分泌物的影響。葉圍(Phyllosphere)是指從葉表面向外延伸到圍繞葉子的邊界層的外邊緣，再向內(nèi)延伸到葉組織的微環(huán)境，因為葉組織中存在氣孔和泌水孔(Hydathodes)，微生物在葉圍的外部和內(nèi)部區(qū)域之間可以移動，因此目前普遍認可的是葉圍微生物指在該區(qū)域內(nèi)的微生物總和。微生物群落分布在植物葉圍、葉內(nèi)、莖、根內(nèi)和根際的各個生態(tài)隔間(Ecological compartment)中，而這些微生物群落也在影響著植物生長的各個方面。內(nèi)生菌及附著于韭菜葉片和根際的微生物可促進寄主植物的生長，Jagannath等和Khan等從百合科球莖中分離的芽孢桿菌屬能合成大量的促進植物生長的激素，如吲哚乙酸等；郎宸用發(fā)現(xiàn)接種了特異內(nèi)生菌的玉米葉片內(nèi)葉綠素含量顯著增加，表明內(nèi)生細菌能參與并促進植物葉綠素的合成，從而促進光合作用和生長。內(nèi)生細菌、葉圍微生物和根際微生物也能提高寄主植物的對磷和氮的利用效率指數(shù)。葉圍微生物在寄主植物葉片上定殖以抑制病原菌對植物的感染和生長，Moin等發(fā)現(xiàn)內(nèi)生熒光假單胞菌通過產(chǎn)生揮發(fā)性抗真菌代謝物形成生態(tài)隔間競爭優(yōu)勢，顯著抑制病原菌。

前人研究表明，生態(tài)隔間對微生物組成和群落功能均存在影響，但目前對植物生態(tài)隔間的研究多存在于地下隔間之間，主要研究土壤微生物、根際微生物以及根內(nèi)微生物的組成差異和根的篩選機制。但對于植物自上而下各生態(tài)隔間的微生物群落組成及互作網(wǎng)絡的差異研究較少。與地下隔間微生物多樣性從根際到根內(nèi)圈遞減且微生物組成顯著性差異相似，不同的生態(tài)隔間對韭菜的細菌群落組成及互作網(wǎng)絡存在影響。不同品種因自身特性不同而存在內(nèi)生菌的分布差異，Su等的研究表明，宿主植物品種對細菌的分布和聚類情況存在顯著的影響。本研究擬選取抗性差異較大的韭菜品種‘久星16號’‘久星18號’‘久星23號’(‘久星16號’具有高抗灰霉病性，‘久星18號’具有抗寒性，而‘久星23號’耐寒性較低，冬季鱗莖存在休眠現(xiàn)象),利用Illumina MiSeq平臺對不同品種的韭菜內(nèi)生細菌、葉圍細菌和根際細菌的16S rRNA基因V5～V6區(qū)進行測序，研究韭菜各生態(tài)隔間細菌群落變化及地上、地下生態(tài)隔間和韭菜品種對細菌互作網(wǎng)絡的影響，為后續(xù)韭菜內(nèi)生菌、葉圍細菌和根際細菌的分離提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 取樣地及取樣方法

本試驗在河南省平頂山市農(nóng)業(yè)科學院李莊基地(33°66′ N，113°26′ E)進行。2019年12月12日選擇管理方式相似且長勢均勻的3個露天栽培的韭菜品種‘久星16號’‘久星18號’‘久星23號’采集樣本。每個品種采集3個完整韭菜植株(包含韭菜葉片、莖和根)和3個根際土樣本。在每個試驗點種植均勻的韭菜植株中，選擇株齡1年左右且長勢與周圍韭菜基本一致的健康韭菜，間距大于100 m；根據(jù)Courchesne等根際區(qū)土壤取樣方法，沿韭菜基部挖取健康根系，抖落根部附著的疏松土壤，留下與根系結合緊密的且大約附著根系1 mm左右的土壤，密封于無菌塑料袋，置車載冰箱保存，運至實驗室進行微生物樣本取樣。其中葉圍微生物利用無菌水浸濕的無菌棉簽從葉片取樣，最終在3個韭菜品種的5個生態(tài)隔間共得到45個樣本。

1.2 樣本處理

將相同品種的根際土混合均勻，去除土樣中可見的土壤動物及植物殘體后，使用0.2 mm無菌篩過篩。韭菜植株樣本先用自來水沖洗，然后用蒸餾水漂洗3次，目的是充分洗掉粘在韭菜葉片、鱗莖和根上的附著物；接著將清洗干凈的韭菜葉片、鱗莖和根放入裝有25 mL PBS緩沖液(PBS：130 mmol/L NaCl，7 mmol/L NaHPO，3 mmol/L NaHPO，pH 7.4)的50 mL Falcon離心管中，180 r/min搖晃清洗15 min，共清洗3次；然后用無菌濾紙吸干各樣本水分，同時用無菌的鑷子將樣本上的雜質(zhì)去除干凈。最后將韭菜葉片、鱗莖、根和相應的根際土放入-80 ℃中保存。提取用于高通量測序的植株各生態(tài)隔間和土壤微生物基因組的總DNA。

1.3 DNA提取

將各冷凍的樣本解凍后用MP Fastprep-245G生物樣本勻漿儀(MP Biomedicals,USA)在7 200 r/min下勻質(zhì)4次，每次持續(xù)30 s。使用Fast DNA SPIN試劑盒(MP biomedicals, USA)提取韭菜葉片、鱗莖、根和根際土的DNA。最后使用Nano Drop 2000紫外可見分光光度計(Thermo scientific, USA)確定DNA質(zhì)量和濃度，于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將高質(zhì)量的DNA模板統(tǒng)一稀釋到10 ng/μL用于后續(xù)的16S rRNA基因的PCR擴增。

1.4 PCR擴增

采用PCR(Nested PCR)對16S rRNA基因V5～V7區(qū)進行擴增，第1輪采用簡并PCR引物799F-1392R(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′和5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3′)，并在5′端為區(qū)分不同樣本而添加特定的Barcode序列。PCR擴增體系20 μL: 5×FastPfu buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正向引物(5 μmol/L)0.8 μL，反向引物(5 μmol/L)0.8 μL，F(xiàn)astPfu DNA Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，最后ddHO加到20 μL。PCR擴增程序：在PCR儀(ABIGeneAmp9700，USA)中進行，95 ℃預變性3 min；27次循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)；72 ℃延伸10 min。第2輪引物采用799F-1193R(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′和5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′)，在5′端為區(qū)分不同樣本而添加Barcode，對16S rRNA基因的可變區(qū)V5～V7進行擴增。PCR擴增體系20 μL，PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；13次循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)；72 ℃延伸10 min。10 ℃保存。

1.5 高通量測序

每個樣本重復3次PCR，混合3次PCR產(chǎn)物，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen Biosciences，USA)對目的長度片段(約400 bp)切膠回收，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測，然后使用QuantusFluorometer(Promega，USA)將PCR產(chǎn)物進行檢測定量。最后，以NEXTflexRapid DNA-SeqKit構建文庫，將純化的PCR產(chǎn)物在IlluminaMiSeq平臺(Illumina，SanDiego，USA)上配對測序(2×300 nt)。

1.6 測序數(shù)據(jù)處理

下機后的原始數(shù)據(jù)參照王亞男的方法，使用Fastp軟件和FLASH軟件(http:∥www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7)進行分析。處理過程如下：切除序列中的Barcode序列，對測序序列進行質(zhì)控和兩端拼接，根據(jù)切下的Barcode序列對樣本進行區(qū)分，隨后進行嵌合體的識別和去除，得到clean data。嵌合體識別參考SILVA數(shù)據(jù)庫，然后以此數(shù)據(jù)庫作為參考序列，對大于250 bp長度核苷酸序列，通過UPARSE軟件(http:∥drive5.com/uparse/version7.1)，以97%的相似度進行OTU (Operational taxonomic unit)的分類，并用于不同品種樣本中不同生態(tài)隔間細菌群落的多樣性分析。最后，利用Silva(Release138) 16 S rRNA基因數(shù)據(jù)庫進行序列比對，算法為Rdp Classifier (http:∥rdp.cme.msu.edu)，置信閾值設定為70%進行物種注釋。

1.7 統(tǒng)計分析

使用Kruskal-Wallis檢驗對組間進行差異性分析，對存在顯著性差異的

P

值使用Bonferroni進行校正，在origin進行箱型圖繪制；基于Bray-Curtis算法構建遺傳距離，繪制主坐標分析(PCoA)圖，利用ANOSIM進行組間差異分析；基于OTUs繪制Upsetplot，使用UpsetR包進行類群特異性細菌微生物區(qū)系的分析；使用Excel繪制柱形圖來顯示不同生態(tài)隔間和不同品種的門和屬的相對豐度，采用Kruskal-Wallis檢驗和Wilcoxon秩和檢驗(兩組);根據(jù)樣方群落豐度數(shù)據(jù)評價4個門的顯著性差異

P

值，使用錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)進行校正。每組的數(shù)據(jù)分別通過組內(nèi)樣本的平均值進行計算和分析，通過STAMP軟件進行可視化分析。不同生態(tài)隔間中的生物標注物分析是利用LEfSe方法在交互網(wǎng)頁(http:∥huttenhower.sphharvard du/galaxy/)中在線獲得(LDA>4.0)，生物標志物可以用來展示不同生態(tài)隔間中細菌群落的差異。使用Cytoscape軟件中CoNet(Co-occurrence network inference)插件計算相關性網(wǎng)絡來確定細菌群落的共生模式。所有網(wǎng)絡分析結果均使用Gephi軟件可視化。

2 結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)

對韭菜5個生態(tài)隔間中獲得的45個樣本中細菌群落進行高通量測序分析，共獲得2 069 698條reads，平均長度394.63 bp。其中，共得到有效序列1 495 017條(有效率72.23%)，對原始數(shù)據(jù)進行Barcode標簽序列過濾后去除Barcode和引物序列。當以生態(tài)隔間作為分組時，葉圍、葉內(nèi)、鱗莖、根和根際得到的總序列數(shù)及未抽平序列數(shù)如表1所示。

表1 韭菜不同生態(tài)隔間測序數(shù)及有效序列數(shù)
Table 1 Sequencing number and effective sequence number of different niches of Chinese chive

序列屬性Sequence attribute葉圍Phylloplane葉片Leaf endosphere鱗莖Stem endosphere根Root endosphere根際Rhizosphere總序列數(shù)/條aTotal sequence387 967405 132409 803452 148414 648有效序列數(shù)/條Effective sequence315 154297 493330 577314 034237 759有效率/%Effective rate81.2373.4380.6769.4557.34

注：a，總序列數(shù)為未抽平序列總數(shù)，抽平后，各生態(tài)隔間總序列數(shù)均為148 059條。
Note: a，The total number of sequences is the total number of unleveled sequences. After leveling, the total number of sequences in each ecological compartment is 148 059.

將所有樣本序列數(shù)抽平至16 451條，以97%的相似性聚為2 463個OTUs，覆蓋率指數(shù)Coverage均在98.8%以上。稀釋曲線圖顯示在15 000條序列時檢測到的物種數(shù)趨于飽和，表明測序結果中涵蓋了大多數(shù)微生物種群，可以真實反映植株和根際土壤微生物的群落結構組成。上述數(shù)據(jù)可以看出該方法適用于不同生態(tài)隔間和品種內(nèi)韭菜細菌種群組成及功能預測分析。

2.2 不同生態(tài)隔間和品種韭菜細菌菌群的多樣性變化

2

.

2

.

1

α多樣性變化對樣本進行豐富度和Shannon指數(shù)(圖1(a)和(b))分析發(fā)現(xiàn)生態(tài)隔間存在組間差異(

P

<0.05)，其中根際土壤內(nèi)細菌多樣性和豐富度均居于各生態(tài)隔間首位，鱗莖內(nèi)生菌和葉圍細菌的豐富度及多樣性指數(shù)較低。各品種間在豐富度和Shannon指數(shù)無顯著差異，但組間存在分布差異。

2

.

2

.

2

β多樣性變化利用PCoA對β多樣性進行分析，結果表明根內(nèi)類群和根際土壤類群呈分離聚類(Anosim試驗) (圖1(c))，生態(tài)隔間可解釋42.38%的差異，主要是地上生態(tài)隔間(葉圍、葉片和鱗莖)與地下隔間(根和根際)的差異。因此為了明確地上生態(tài)隔間和地下生態(tài)隔間組間β多樣性，對其進行了PCoA分析(圖1(d)和(e))，在14.06%的差異下，上部生態(tài)隔間可進行類群區(qū)分；下部各生態(tài)隔間也可在18.66%的差異下產(chǎn)生顯著分組(

P

=0.002)。與α多樣性相似，不同的品種間未產(chǎn)生明顯聚類(

R

=-0.009 7)，不同的品種間群落結構差異較小(

P

=0.534)。

(a)和(b)分別為不同分組OUT水平的細菌豐富度指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)，(c)～(e)分別為不同生態(tài)隔間、地上生態(tài)隔間和地下生態(tài)隔間的PCoA分析，(f)為OUT水平各生態(tài)隔間及品種的共享OUT數(shù)。不同字母表示組內(nèi)差異顯著(P<0.05，Kruskal-Wallis檢驗)，通過大小寫來區(qū)分不同分組。箱型圖中樣本數(shù):不同生態(tài)隔間中，n=9;不同品種中，n=15。(a) and (b) are the differences in bacterial richness and Shannon index among different groups; (c)-(e) are the PCoA analysis of different ecological compartments, aboveground ecological compartments and underground ecological compartments; (f) is the shared OUT number of ecological compartments and varieties. Different letters indicate differences between groups (P<0.05, Kruskal-Wallis test). Case is to distinguish different groups. The number of samples in the box diagram is as follows: in different ecological compartments, n=9; In different cultivars, n=15.圖1 不同生態(tài)隔間和品種韭菜細菌菌群的多樣性Fig.1 Diversity of bacterial flora in different ecological compartments and cultivars of Chinese chive

2.3 不同生態(tài)隔間和品種韭菜細菌菌群的組成

2

.

3

.

1

門水平下不同生態(tài)隔間和品種韭菜內(nèi)生細菌差異

為了研究生態(tài)隔間對細菌群落組成的影響，比較了門水平(圖2(a))和屬水平(圖3)下葉圍、葉、鱗莖、根和根際的細菌微生物組成。各平行試驗存在較好的均勻性，少部分根內(nèi)樣本間差距較大。與已有研究報道一致，變形菌門(Proteobacteria)是韭菜葉圍、葉片和鱗莖內(nèi)相對豐度最高的門，相對豐度分別為76.63%、64.46%和80.91%；變形菌門在韭菜根內(nèi)和根際土壤內(nèi)相對豐度僅次于放線菌門(Actinobacteria)位居第二，相對豐度分別為31.56% 和39.08%。放線菌門是土壤中常見的門，本試驗中，根內(nèi)放線菌門相對豐度(64.77%)高于根際土內(nèi)放線菌門(47.20%)。

(a)為門水平細菌菌群組成差異，(b)～(e)分別為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和厚壁菌門在不同的生態(tài)隔間下的組間差異?！?6-P”表示‘久星16號’的葉面樣品。P:葉面；LE:葉片；SE:鱗莖；RE:根內(nèi)；RS：根際土。*、**和***分別表示在0.05、0.01和0.001水平下差異顯著。圖3同。(a) is the difference in bacterial flora composition at the phylum level. (b)-(e) are the differences between groups under different ecological compartments of Proteobacteria, Actinomycetes, Bacteroidetes and Firmicutes. 16-P means leaf endosphere of ‘Juxing 16’. P, phylloplane; LE, leaf endosphere; SE, stem endosphere; RE, root endosphere; RS, rhizosphere. *, ** and *** indicate significant differences at 0.05, 0.01 and 0.001 levels, respectively. The same as Figure 3.圖2 門水平不同生態(tài)隔間和品種韭菜細菌群落差異Fig.2 The composition of bacterial flora in different ecological compartments and varieties of Chinese chive at phylum level

圖3 不同生態(tài)隔間和品種的韭菜屬水平相對豐度差異Fig.3 The bacterial composition at the genus levels in different ecological compartments and varieties.

對相對豐度前4的門進行了組間差異分析，在品種分組上，僅在葉圍上存在組間差異，‘久星23號’中變形菌門的相對豐度顯著低于‘久星16號’‘久星18號’(

P

<0.05)，而擬桿菌門(Bacteroidetes)極顯著高于其余兩組(

P

<0.01)，其余分組內(nèi)品種對細菌相對豐度無顯著性影響。在生態(tài)隔間分組上，變形菌門(圖2(b))、放線菌門(圖2(c))和擬桿菌門(圖2(d))的組間差異主要集中于上部隔間和下部隔間之間，上部生態(tài)隔間(葉圍、葉片和鱗莖)之間不存在顯著性差異；而厚壁菌門(Firmicutes)顯著的組間差異(圖2(e))存在于根際土與其他4個生態(tài)隔間之間，土壤內(nèi)厚壁菌門豐度極顯著高于其他隔間(

P

<0.001)。

2

.

3

.

2

屬水平下不同生態(tài)隔間和品種韭菜內(nèi)生細菌差異屬水平上，葉圍、葉片和鱗莖的細菌分布較地下隔間更均勻，僅有鱗莖內(nèi)存在單個含量不同其他平行樣本的細菌屬，根際細菌屬平行樣本間分布存在波動，根內(nèi)生菌分布均勻性較差，各平行樣本間相對豐度存在較大差異，取樣對根內(nèi)生菌的影響超過其他隔間(圖3)。其次，各生態(tài)隔間存在顯著的組間差異，主要表現(xiàn)在地上生態(tài)隔間(葉圍、葉片和磷莖)與地下隔間。上部生態(tài)隔間中，顯著高于下部生態(tài)隔間的屬包括甲基桿菌屬(

Methylobacterium

)、與解磷功能相關的鞘氨醇單胞菌屬(

Sphingomonas

)、與促進植物生長功能相關的短小桿菌屬(

Curtobacterium

)、金黃桿菌屬(

Chryseobacterium

)、黃桿菌屬(

Flavobacterium

)、泛菌屬(

Pantoea

)、短波單胞菌屬(

Brevundimonas

)和微桿菌屬(

Microbacterium

)等；下部生態(tài)隔間中，相對豐度顯著高于上部生態(tài)隔間的是擬無枝菌酸菌屬(

Amycolatopsis

)、部分根際促生菌(PGPR)芽孢桿菌屬(

Bacillus

)、鏈霉菌屬(

Streptomyces

)、伯克霍爾德氏菌屬(

Burkholderia

-

Caballeronia

-

Paraburkholderia

)、蒼白桿菌屬(

Ochrobactrum

)和節(jié)桿菌屬(

Arthrobacter

)。上部生態(tài)隔間內(nèi)主要細菌相對豐度差異較小，下部根和根際細菌存在部分差異。根內(nèi)的列契瓦尼而氏菌屬(

Lechevalieria

)、鏈霉菌屬(

Streptomyces

)和

Amycolatopsis

均高于根際內(nèi)。各生態(tài)隔間內(nèi)韭菜品種對各細菌屬存在顯著影響，‘久星23號’葉圍內(nèi)鞘氨醇單胞菌屬和葉片內(nèi)的假單胞菌屬(

Pseudomonas

)顯著低于其他2個品種(

P

<0.01)，同時‘久星23號’韭菜葉片中的大理石雕菌屬(

Marmoricola

)、游動放線菌屬(

Actinoplanes

)、鱗莖中的金色單胞菌(

Aureimonas

)、大理石雕菌屬(

Marmoricola

)、戈登氏菌屬(

Gordonia

)以及根際中甲基桿菌屬(

Methylobacterium

)相對豐度顯著高于其他品種(

P

<0.05)?！眯?6號’韭菜鱗莖中短小桿菌屬相對豐度顯著高于其他2個品種(

P

<0.05)，同時‘久星16號’韭菜根內(nèi)的金黃桿菌屬、紅球菌屬(

Rhodococcus

)、微桿菌屬、戈登氏菌屬(

Gordonia

)、

Humibacter

和根際的雙岐桿菌屬(

Bifidobacterium

)顯著低于其他2個品種(

P

<0.05)。而‘久星18號’對細菌屬的顯著影響主要存在于根際中，其中的鞘氨醇單胞菌屬和

Allorhizobium

_

Neorhizobium

_

Pararhizobium

_

Rhizobium

顯著高于其他品種(

P

<0.05)，而列契瓦尼而氏菌屬和雙岐桿菌屬的相對豐度則低于其他2組(

P

<0.05)(圖3)。

2

.

3

.

3

不同生態(tài)隔間內(nèi)核心物種分析本研究對不同生態(tài)隔間的細菌進行了LEfSe分析，得到了62個對生態(tài)隔間敏感的生物標志物(圖4)。其中，放線菌門在根內(nèi)大量富集，且根內(nèi)富集了假諾卡氏菌屬(

Pseudonocardiales

)、鏈霉菌目(Streptomycetales)、小單孢菌目(Micromono-sporales)、細鏈孢菌目(Catenulisporales)、假諾卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、密螺旋體科(Strep-tomycetaceae)、小單孢菌科(Micromonosporaceae)、弗蘭克氏菌科(Frankiaceae)、黃色桿菌科(Xantho-bacteraceae)和叢生放線菌科(Actinospicaceae)；根際內(nèi)厚壁菌門、綠彎菌門(Chloroflexi)、蓋勒氏菌目(Gaiellales)、弗蘭克氏菌目(Frankiales)、芽孢桿菌目(Bacillales)、丙酸桿菌目(Propionibacteriales)、纖線桿菌目(Ktedonobacterales)、類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)、土壤紅桿菌科(Solirubro-bacteraceae)、JG30-KF-AS9目、67-14目、紅色細菌目(Rhodanobacteraceae)和芽孢桿菌科(Bacillaceae)大量富集；地上隔間中富集的生物標注物少于地下隔間，其中葉圍中δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、柄桿菌目(Caulobacterales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、蛭弧菌目(Bdellovibrionales)、柄桿菌科(Caulobacteraceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)和蛭弧菌科(Bdellovibrionaceae)富集；葉片內(nèi)擬桿菌門(Bacteroidetes)、微球菌目(Micrococcales)、黃桿菌目(Flavobacteriales)、微桿菌科(Microbacteriaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)和黃單胞菌科(Xanthomona-daceae)富集；鱗莖中富集了變形菌門(Proteobacteria)、鞘氨醇單胞菌目(Sphingomonadales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、鞘氨醇單胞菌科(Sphin-gomonadaceae)、拜葉林克氏菌科(Beijerinckiaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和根瘤菌料(Rhizobiaceae)。

圖4 LEfSe多級物種差異判別分類等級樹Fig.4 Cladogram based on analyse results of LEfSe

2.4 不同生態(tài)隔間和品種韭菜細菌菌群的共現(xiàn)網(wǎng)絡

為了進一步分析生態(tài)隔間和品種對韭菜品種間關系的影響，本研究選擇了各樣本中個數(shù)在5以上的OUT在CoNet中進行了細菌群落共現(xiàn)網(wǎng)絡分析及拓撲特征指數(shù)計算，重點分析了地上隔間和地下隔間之間的細菌群落互作差異及韭菜品種間互作差異，因此將地上隔間的3個生態(tài)隔間(葉圍、葉片和鱗莖)以及地下的2個生態(tài)隔間(根內(nèi)和根)進行了合并分析。各分組的模塊化指數(shù)均高于0.850(表2)，說明在各分組內(nèi)微生物具有模塊化結構(Modularity index)。各品種間存在一定的差異，‘久星16號’的節(jié)點數(shù)高于其他2個品種但連接數(shù)更低，且擁有較低的平均度、網(wǎng)絡密度和平均聚類系數(shù)，說明在‘久星16號’韭菜中微生物聚集性和互作關系較低，各菌群間連通性差且相互合作性低(圖5(a)～(c)和表2)。地下隔間內(nèi)節(jié)點數(shù)及連接數(shù)遠高于地上隔間(圖5(e))，表明地下隔間的物種多樣性和互作方式更加顯著和活躍。平均聚類系數(shù)和網(wǎng)絡密度體現(xiàn)了共現(xiàn)網(wǎng)絡中節(jié)點的聚集程度和網(wǎng)絡結構的復雜程度。本研究中，地下隔間的平均聚類系數(shù)、平均度高且正向互作關系強但其網(wǎng)絡密度較低，這表明地下隔間的細菌菌群聚集性較差，且微生物之間正相關強，其他作用更復雜(圖5(d))，這與地下各隔間相較于地上各隔間具有更高的物種豐富度和群落多樣性的結論相互印證；地上隔間和地下隔間微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡的“中心節(jié)點”(節(jié)點連接度>8且接近中心性>0.2)數(shù)量存在差異，地下隔間顯著多于地上隔間，但各品種間“中心節(jié)點”數(shù)差距較小，‘久星23號’略少于其他2組(圖6(a)～(c))。

圖5 不同分組微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡圖Fig.5 Microbial co-occurrence network diagram of different groups

表2 韭菜生態(tài)隔間及品種微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡拓撲特性
Table 2 Co-occurrence network topological feature of microbe in different niches and varieties of Chinese chive

分組Group節(jié)點/個Node連接數(shù)/條Edge平均度Degree平均路徑長度Averagepathlength網(wǎng)絡直徑Networkdiameter網(wǎng)絡密度Networkdensity模塊化Modularity平均聚類系數(shù)Averageclusteringcoefficient地上隔間Aboveground compartment107 851.5891.680 40.0150.870.321地下隔間Underground compartment3122721.7443.558100.0060.8810.353久星16號Jiuxing 163152931.8606.249150.0060.8540.047久星18號Jiuxing 182363432.9075.868150.1200.8550.157久星23號Jiuxing 232473282.6565.326150.0110.8720.163

(a)為‘久星16號’分組；(b) 為‘久星18號’分組；(c)為‘久星23號’分組；(d)為地下生態(tài)隔間分組；(e)為地上生態(tài)隔間分組。(a) is the ‘Jiuxing 16’; (b) is the ‘Jiuxing 18’; (c)is the ‘Jiuxing 23’; (d) is underground ecological compartments; (e) is aboveground ecological compartments.圖6 不同互作網(wǎng)絡中關鍵節(jié)點分析圖Fig.6 Analysis diagram of key nodes in different interaction networks

不同生態(tài)隔間和不同品種的微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡物種聚集情況差異明顯，地下隔間主要是綠彎菌門(Chloroflexi)和變形菌門顯著聚類，而地上部分擁有更多的變形菌門類群(圖6(d))。值得注意的是，變形菌門的微生物類群是地上隔間和地下隔間主要的中心節(jié)點(圖6(e))。對于3個韭菜品種而言，在‘久星16號’的共現(xiàn)網(wǎng)絡中，主要是變形菌門、綠彎菌門、放線菌門和酸桿菌門(Acidobacteria)聚集，且類群間多為負作用；而‘久星18號’‘久星23號’則為變形菌門和放線菌門相關類群聚集，但‘久星18號’‘久星23號’微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡中變形菌門和放線菌門的節(jié)點數(shù)量低于‘久星16號’(圖6(b)和(c))。此外，本研究在‘久星23號’的微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡中發(fā)現(xiàn)了較于其他品種更高的模塊化程度及更短的平均路徑距離。

3 討論與結論

3.1 生態(tài)隔間對韭菜內(nèi)生菌、葉圍微生物和根際微生物群落結構存在影響

本研究通過16S rRNA對各樣本進行了微生物鑒定，分析了細菌在不同生態(tài)隔間和不同品種中的特異性變化，結果表明細菌在植物不同生態(tài)隔間的定殖存在顯著性差異，其共現(xiàn)網(wǎng)絡也存在顯著的組間差異。植物對根際微生物進入根內(nèi)存在富集和篩選機制，本研究同樣證實了這一觀點，與其他隔間的內(nèi)生菌相比，根內(nèi)生菌存在與根際土相似的微生物群落結構，且阿爾法多樣性顯著高于其他隔間。通過PCoA分析發(fā)現(xiàn)，在14.06%的解釋下可以有效區(qū)分各生態(tài)隔間，但各品種間微生物未產(chǎn)生明顯聚類(

P

=0.534)。植物在生長過程中常常將許多營養(yǎng)物質(zhì)分配至根部，并通過其根系向周圍環(huán)境釋放大量的單糖、多糖、有機酸、酚類化合物、氨基酸和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)和能源物質(zhì)，吸引大量微生物聚集。這種現(xiàn)象在宿主植物受到病原菌侵染時會更加顯著，造成了植物體內(nèi)外和不同生態(tài)隔間的內(nèi)環(huán)境改變，促進了特定內(nèi)生菌的定殖和生長。植物微生物α多樣性指數(shù)被認為與抑菌能力成正相關，本研究中韭菜根內(nèi)細菌的α多樣性較其他內(nèi)生隔間顯著升高，這可能與根富集生防微生物進而發(fā)揮抑菌作用有關，也可能存在(微量)營養(yǎng)素的競爭、抗生素化合物或分解酶的生產(chǎn)或病原體刺激化合物的消耗等途徑。

3.2 韭菜根據(jù)自身特性招募特異微生物

‘久星23號’鱗莖內(nèi)金色單胞菌屬和大理石雕菌屬含量更高且根內(nèi)和根際中具有促生功能的固氮菌

Burkholderia

-

Caballeronia

-

Paraburkholderia

的豐度顯著高于其他品種，這可能與‘久星23號’作為休眠品種可以調(diào)節(jié)自身微生物含量有關。本研究采樣時間處于休眠韭菜進入休眠期之初，植物體內(nèi)SOD酶含量上升，HO含量上升，蔗糖磷酸合成酶活性降低，因此導致‘久星23號’葉片和鱗莖內(nèi)各微生物的含量與其他隔間存在差異?！眯?6號’作為3個品種中抗灰霉病最佳的品種，葉圍微生物和根際微生物中各細菌的相對豐度與其他2個品種存在較大差異，葉片內(nèi)假單胞菌屬豐度顯著增高，這可能與植物通過葉圍分泌激素招募有益微生物來進行病原菌防御有關。

3.3 生態(tài)隔間影響了生物標志物的富集

在葉片、葉圍和鱗莖中，變形菌門占絕對優(yōu)勢地位，而其中相對豐度最高是的假單胞菌屬，這與Zhuang等在蔥屬植物根際得到的結果一致。假單胞菌屬在蔥屬生長后期和良好生長條件的根際細菌共現(xiàn)網(wǎng)絡中起到了更重要的作用，因為假單胞菌屬在蔥屬植物內(nèi)及根際中大量存在，目前可通過培養(yǎng)組學對其進行分離純化。其中

P.

aeruginosa

、

P.

chlororaphis

、

P.

fluorescens

和

P.

extremorientalis

已經(jīng)成功被分離純化且對灰葡萄孢菌有超過85%的抑制效果，這為后期進行分離提供了理論基礎。對門和屬水平細菌相對豐度分析的結果表明，根中微生物群落對生長環(huán)境波動的響應比根際或土壤中的微生物群落更穩(wěn)定。可能是因為在進化過程中，韭菜獲得了吸收某些對它們生長有益的微生物的能力。

各個生態(tài)隔間中鞘氨醇單胞菌屬具有顯著性差異，在植物內(nèi)部呈現(xiàn)由上至下逐漸遞減的趨勢，這與前人對韭菜內(nèi)生菌分布研究得到的結果相似。葉圍是鞘氨醇單胞菌屬相對豐度最高的生態(tài)隔間，而與葉圍緊密相連的葉內(nèi)和鱗莖中鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度稍低，根中鞘氨醇單胞菌屬的豐度相對于上部生態(tài)隔間顯著降低。本研究認為，韭菜內(nèi)部鞘氨醇單胞菌屬主要是通過葉片進入，這與前人研究中鞘氨醇單胞菌屬的定殖規(guī)律相似。環(huán)境中的鞘氨醇單胞菌屬附生在宿主植物葉圍，其進入宿主植物葉片內(nèi)部的方式目前認為是主要通過植物自然開孔，如氣孔和滲水孔等外部損失及葉片脫落形成的葉圍傷口進入。因此根據(jù)韭菜各生態(tài)隔間鞘氨醇單胞菌屬的分布特點，在分離鞘氨醇單胞菌屬時可以從葉片進行分離，提高分離效率。多級生物標志物分析也顯示了在不同生態(tài)隔間對不同的細菌門、目和科均存在富集作用。芽孢桿菌屬作為常見的生防菌，具有較強的纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶等多種活性，可抑制或破壞周圍其它菌群的生長。本研究發(fā)現(xiàn)，在不同的生態(tài)隔間內(nèi)，根和根際內(nèi)各類生防菌定殖率升高，例如芽孢桿菌屬在根際內(nèi)顯著富集,這可能與植物招募根際微生物來協(xié)助抑制病原菌有關。

3.4 韭菜特異微生物群落提高地下隔間穩(wěn)定性

在各生態(tài)隔間中，微生物間存在直接或間接的互作方式，無論是促進作用還是抑制作用都會對該隔間的微生物群落產(chǎn)生影響，甚至會超過環(huán)境因子對群落的影響程度。本研究通過相似性矩陣，構建的地上隔間、地下隔間以及各韭菜品種的微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡，具有無尺度(Scale-free)和小世界性(Small-world)，這與Hu等構建的細菌共現(xiàn)網(wǎng)絡的類型相同。表明在韭菜生態(tài)隔間的微生物群落中，少數(shù)的節(jié)點擁有大量的連接，而大部分節(jié)點具有少量甚至沒有連接，這使得部分中心節(jié)點的變動會引起絕大部分微生物的變化。本研究地上隔間和地下隔間中節(jié)點之間的連接即相互作用，大多數(shù)為正相關或互利的，但在‘久星18號’內(nèi)，中心節(jié)點的連接多為負相關，可能存在競爭或捕食關系等。同時5個微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡的中心節(jié)點與上文中各生態(tài)隔間和品種的微生物群落結構及豐度一致，且微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡的節(jié)點連接數(shù)量變化趨勢與阿爾法多樣性的變化趨勢相似，地下隔間的微生物多樣性、節(jié)點數(shù)和連接數(shù)遠高于地上隔間，品種間變化區(qū)別較小。

節(jié)點間聯(lián)系越緊密在微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡中其平均路徑長度會越短，對應節(jié)點的微生物群落響應環(huán)境變化會越迅速。在3個韭菜品種中，‘久星23號’的平均路徑長度最低，較于其他2個品種節(jié)點間連接更緊密，響應環(huán)境變化的速度更快。同時‘久星23號’具有更大的模塊化和平均聚類系數(shù)，表明該品種較其他2個品種有更多連接的節(jié)點，節(jié)點組成相應的模塊共同在網(wǎng)絡中維護群落結構的穩(wěn)定性，主要是以放線菌門為中心節(jié)點的積極作用模塊和以變形菌門為中心節(jié)點的負作用模塊，兩大模塊間通過數(shù)量較少且比例相當?shù)恼饔煤拓撟饔孟噙B接?！眯?3號’因其具有冬季休眠期，不耐低溫，采樣時可能具有低溫脅迫，因此中心節(jié)點的連接中正相互作用高于其他品種，以增加應對溫度變化的抵抗能力。與‘久星23號’相比，‘久星16號’和‘久星18號’的中心節(jié)點擁有更多負作用連接，主要是在變形菌門、酸桿菌門與綠彎菌門之間存在負相互作用。這可能跟低溫度下，隸屬于富營養(yǎng)菌的變形菌門與寡營養(yǎng)菌的酸桿菌門和綠彎菌門進行底物利用有關。

地下隔間的微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡擁有遠高于地上隔間的網(wǎng)絡直徑、節(jié)點數(shù)和連接數(shù)，擁有更大的共現(xiàn)網(wǎng)絡規(guī)模和更復雜穩(wěn)定的網(wǎng)絡結構，同時地上隔間的節(jié)點物種種類遠低于地下隔間，說明微生物從根際進入植物體內(nèi)存在篩選機制，這與各生態(tài)隔間的物種相對豐度結果一致。這部分微生物更能利用地上隔間內(nèi)部的正向作用，同時經(jīng)過植物的篩選具有更加緊密的相互作用，且隨著生態(tài)隔間的上移，放線菌門在微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡中的節(jié)點樞紐作用下降，變形菌門的樞紐作用增強。

綜上，本研究通過對3個韭菜品種內(nèi)生菌、葉圍微生物和根際微生物的分析得出，生態(tài)隔間對微生物的豐富度、多樣性、物種差異及微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡均存在顯著影響，不同韭菜品種會根據(jù)自身特性招募特異微生物，這些結果填補了韭菜內(nèi)生菌研究的空白，尤其是通過微生物互作網(wǎng)絡可以發(fā)現(xiàn)，韭菜品種對細菌的互作存在較為顯著的影響。