魯任翔 王 喆 翟雨佳 金唯新 沈 斐 鄭傳林*

(1．中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，北京 100193；2.江蘇省無錫市惠山區(qū)陽山鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，江蘇 無錫 214156)

桃(

Prunus

persica

L.Batsch)是薔薇科(Rosaceae)李屬(

Prunus

L.)植物，原產(chǎn)于我國，迄今為止具有4 000多年的栽培歷史，是我國重要的果樹之一。我國歷史上有四大傳統(tǒng)名桃，分別是江蘇陽山水蜜桃、浙江奉化水蜜桃、河北深州水蜜桃和山東肥城佛桃，其中陽山水蜜桃因皮薄肉多、細(xì)膩多汁、香氣濃郁和營養(yǎng)豐富等特點而享譽全國。近年來，隨著種植面積增加、種植品種增多以及當(dāng)?shù)卣闹匾?，陽山水蜜桃產(chǎn)業(yè)得到了高速發(fā)展。以2018年為例，陽山水蜜桃的產(chǎn)量達2.12萬t，創(chuàng)造了近4億元的產(chǎn)值，給當(dāng)?shù)毓r(nóng)帶來了巨大的經(jīng)濟效益；同時，陽山水蜜桃的品牌效益也在各級力量的推動下逐漸發(fā)展，與10年前相比，陽山水蜜桃的單價幾乎翻倍。但是，陽山水蜜桃產(chǎn)業(yè)在快速發(fā)展的同時也存在著產(chǎn)業(yè)隱患，因為陽山鎮(zhèn)種植的主栽品種成熟期主要集中在6～8月，桃的成熟和采收階段與雨季重疊，成熟期的水蜜桃果實腐爛嚴(yán)重，影響了水蜜桃的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，關(guān)于無錫陽山地區(qū)桃果實腐爛病原菌分離鑒定的相關(guān)研究報道較少，且國內(nèi)外學(xué)者對引起桃果實腐爛的病原菌具有不同觀點。通常認(rèn)為桃果實在成熟和采后階段容易受到機械傷害，病原菌可通過傷口侵入果實引起青霉病、褐腐病、灰霉病和軟腐病等病害，導(dǎo)致果實腐爛。其中，青霉病的病原菌為擴展青霉(

Penicillium

expansum

)，受侵染的果實2～3 d即可發(fā)病，且在發(fā)病的果實部位可鑒定到1種神經(jīng)性毒素-展青霉毒素；桃褐腐病在桃果實的整個發(fā)育期均可發(fā)病，且在成熟前后發(fā)病加重，患病果實具有極高的腐爛率，我國的褐腐病主要由鏈核盤菌(

Monilinia

fructicola

)引起，同時也可由叢梗孢屬的2個種

Monilia

mumecola

和

Monilia

yunnanensis

引起；灰霉病的病原菌為灰葡萄孢菌(

Botrytis

cinerea

)，發(fā)病果實病斑會由褐色凹陷轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑箤痈采w全果，導(dǎo)致整個果實快速腐爛；軟腐病被認(rèn)為是由葡枝根霉(

Rhizopus

stolonife

)引起的，該病在0 ℃以下和39 ℃以上不易發(fā)病，常溫下則發(fā)病迅速，3～4 d即可導(dǎo)致果實腐爛。此外，Yaghmour等發(fā)現(xiàn)白地霉(

Geotrichum

candidum

，異名

Galactomyces

candidus

)可引起毛桃和油桃等核果類果實的酸腐病并導(dǎo)致果實腐爛，而Ginting等發(fā)現(xiàn)桃吉爾霉(

Gilbertella

persicaria

)也引起果實的腐爛。

為進一步明確引起陽山水蜜桃成熟期腐爛的病原菌并篩選針對性強的高效殺菌劑，本研究從江蘇省無錫市惠山區(qū)陽山鎮(zhèn)采集了當(dāng)?shù)刂髟云贩N‘晚湖景’水蜜桃有腐爛癥狀的病桃，對其病原菌進行了分離和形態(tài)學(xué)鑒定，并結(jié)合分子生物學(xué)方法和菌株回接試驗，明確了致病病原菌；利用當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)使用的殺菌劑農(nóng)藥，如代森錳鋅、喹啉銅、甲基硫菌靈和苯醚甲環(huán)唑等，通過抑菌實驗評估了這些殺菌劑對致病菌的抑制作用，以期為當(dāng)?shù)氐纳a(chǎn)實踐提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病樣與健康果實：于2020年8月初從無錫市陽山鎮(zhèn)采集受病菌侵染的‘晚湖景’水蜜桃，從京東商城購買無機械損傷且無病菌侵染的水蜜桃作為分離菌株的回接試驗材料。

試劑及儀器：試劑包括葡萄糖、瓊脂、次氯酸鈉和75%乙醇等，儀器設(shè)備包括：電子天平(PL602E，Mettler Toledo)、超凈工作臺(單人單面，昌平長城)、恒溫震蕩培養(yǎng)箱(HZC-280，蘇州培英)、超高速冷凍離心機(Centrifuge 5424 R，Eppendorf)、光學(xué)顯微鏡(BX53M，Olympus)、PCR儀(TGRADIENTY96，Biometra)、凝膠成像儀(AlphaImager HP，Alpha)和恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9012，上海一恒)等。

殺菌劑：代森錳鋅(Mancozeb)可濕性粉劑(有效成分80%，西安近代科技實業(yè)有限公司)、喹啉銅(Oxine-copper)懸浮劑(有效成分33.5%，山東貴合生物科技有限公司)、甲基硫菌靈(Thiophanate-Methyl)懸浮劑(有效成分50%，山西德威本草生物科技有限公司)和苯醚甲環(huán)唑(Difenoconazole)懸浮劑(有效成分30%，陜西先農(nóng)生物科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1

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2

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1

病原真菌的分離純化與形態(tài)觀察

PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)的配制：稱取200 g新鮮去皮馬鈴薯，于800 mL蒸餾水中煮20～30 min后經(jīng)2層紗布過濾；在濾液中加入20 g葡萄糖和15～20 g瓊脂，蒸餾水定容至1 L；121 ℃高壓滅菌20 min后倒入無菌培養(yǎng)皿中，凝固后備用。PDB培養(yǎng)液(Potato dextrose broth，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液)的制備：除不加瓊脂外，與PDA培養(yǎng)基的配方相同，配制后裝入50 mL錐形瓶中，封口滅菌備用。

在陽山鎮(zhèn)水蜜桃果園內(nèi)采集腐爛的病果，立即運回實驗室，在無菌的超凈工作臺內(nèi)打開。采用組織分離法從病桃上分離病原菌，在操作臺中用手術(shù)刀在桃的病健交界處切取0.5 cm×0.5 cm的組織塊，將切取的組織塊經(jīng)75%乙醇消毒30 s，無菌水漂洗3～4次后用5%的次氯酸鈉消毒1 min，無菌水漂洗3～4次。最終將表面消毒的桃組織塊在無菌濾紙上吸干水分后，置于PDA培養(yǎng)基平板上，將平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待桃組織周圍長出菌落后，用滅菌的槍頭在菌落邊緣挑取少量菌絲接種到新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，多次重復(fù)分離純化至單一菌落。挑取上述分離出的單一菌落菌絲，吸取少量蒸餾水制片，在顯微鏡下觀察其菌絲和孢子的形態(tài)。

1

.

2

.

2

病原菌致病性的測定

在分離純化出的單一菌落上切取菌塊到PDB培養(yǎng)液中，于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d制備孢子懸浮液。將制備好的真菌懸浮液作為接種體，選取大小均勻、成熟度一致、無機械損傷和無病害的水蜜桃果實進行致病性測定。先用75%乙醇清洗表面30～45 s進行表面消毒，再用無菌水沖洗3～4次，晾干表面水分。用滅菌的10 μL槍頭尖端在桃表面造成針孔狀傷口，并吸取10 μL懸浮液接種在傷口處，以無菌水作為對照。接種完成后放入培養(yǎng)箱，于室溫(25 ℃)、相對濕度約為85%的暗條件進行培養(yǎng)，每隔24 h觀察桃傷口的發(fā)病情況。從發(fā)病的病斑處再次分離純化病原物，檢測是否與接種菌株一致。

1

.

2

.

3

DNA提取和rDNA

-

ITS檢測采用改進的簡化CTAB法提取真菌DNA，DNA于-20 ℃冰箱中保存以備后續(xù)使用。利用真核生物特異性區(qū)段ITS(Internal transcribed spacer)設(shè)計引物進行特異性片段的擴增和測序，其中上游引物為ITS5: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，下游引物為ITS4: 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反應(yīng)體系為：總體積25 μL，包含模板DNA 0.5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，

Taq

PCR Mix 12.5 μL，ddHO 10 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，52 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸15 s，共35個循環(huán)，最終延伸7 min后結(jié)束擴增反應(yīng)。經(jīng)高保真酶擴增后的PCR產(chǎn)物連接到 pClone007 Blunt Vector(擎科，北京)，并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，搖菌、提取質(zhì)粒并送往生工生物工程(上海)有限公司完成測序。利用NCBI網(wǎng)站的BLAST(Basic local alignment search tool)工具對測序結(jié)果進行序列比對，在線搜索相似性較高的序列，使用MEGA X軟件以鄰接法對菌株ITS序列及比對獲得的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其親緣關(guān)系，根據(jù)相似性的高低，確定分離菌株所在的屬和對應(yīng)的種。

1

.

2

.

4

抑菌試驗

本試驗選取在陽山鎮(zhèn)水蜜桃種植基地常見的殺菌劑代森錳鋅、喹啉銅、甲基硫菌靈和苯醚甲環(huán)唑作為試驗農(nóng)藥。分別將相關(guān)劑量的殺菌劑加入到55 ℃ 未凝固的PDA培養(yǎng)基中，搖勻后倒平板，獲得不同濃度梯度殺菌劑的培養(yǎng)基(1 000、3 000和5 000倍稀釋)。用滅菌的槍頭圓端(直徑6.5 mm)在生長單一純化菌落的平板上打下菌落，并接種在含藥培養(yǎng)基的中央。接菌后放置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h用“十字交叉法”測量菌斑的直徑。利用以下公式計算殺菌劑對致病菌的生長抑制率：

生長抑制率

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019和SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著性檢驗使用LSD法，本試驗中的差異顯著性水平均為

P

<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原真菌的分離鑒定與形態(tài)學(xué)觀察

從40個‘晚湖景’水蜜桃病果上依據(jù)形態(tài)學(xué)特征共分離出51株真菌，依據(jù)形態(tài)特征分為2類，分別編號為J1和J2，其中J1分離出48株，J2分離出3株。在400倍光學(xué)顯微鏡對菌株的形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)進行觀察(圖1)。

(a)和(b)分別為J1的菌落形態(tài)和孢子形態(tài)，(c)和(d)分別為J2的菌落形態(tài)和孢子形態(tài)。(a) and (b): The morphology of J1 colony and spore, respectively; (c) and (d): The morphology of J2 colony and spore, respectively.圖1 病原菌的形態(tài)觀察與鏡檢結(jié)果Fig.1 Morphological observation and microscopic examination of pathogenic fungi

J1菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落呈圓形、扁平、乳白色酵母狀至白色霉菌狀；菌絲短絨狀或近于粉狀，呈放射型生長(圖1(a))。菌絲有橫隔、無色、具分枝，寬3.60～12.97 μm，平均寬6.62 μm。菌絲生長到一定階段后從橫隔膜處斷裂形成許多節(jié)孢子，孢子短而兩端平切，呈短柱狀、圓筒狀或兩端鈍圓；孢子大小為(3.39～9.27) μm×(2.05～7.71) μm，平均6.78 μm×4.83 μm(圖1(b))。根據(jù)形態(tài)特征初步鑒定為白地霉。

J2菌株初期菌落平鋪，絨毛狀，中部略隆起，初為乳白色，后漸變呈暗灰色(圖1(c))。孢囊梗直立或彎曲，無隔膜，孢囊梗寬10.37～29.18 μm，平均寬15.98 μm；梗端膨大成橢球形的孢子囊，孢子囊的大小為(63.05～100.18) μm×(44.52～84.66) μm，平均80.77 μm×61.51 μm。孢囊孢子近橢圓或圓形，多數(shù)呈粒狀，一端尖，一端鈍圓，大小為(4.81～8.79) μm×(2.57～5.93) μm，平均6.37 μm×4.21 μm(圖1(d))。根據(jù)形態(tài)特征初步鑒定為桃吉爾霉。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

以48個J1菌株和3個J2菌株基因組的DNA為模板，分別利用ITS引物ITS5/ITS4進行PCR擴增，2類真菌分別得到了大小一致的條帶，其中J1菌株約為400 bp，J2菌株約為700 bp。由于分離到的48個J1菌株和3個J2菌株在各自群體中的菌株形態(tài)學(xué)特征及培養(yǎng)性狀基本一致，因此分別隨機選擇3株J1菌株和J2菌株的PCR產(chǎn)物進行測序。將2種真菌的ITS產(chǎn)物測序序列分別在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，結(jié)果顯示J1菌株序列(登錄號MW493646)與NCBI上序列登錄號為GQ376093.1的白地霉序列一致性達100%，與登錄號為KM461121.1的白地霉序列一致性達99.49%(圖2(a))。J2菌株序列(登錄號MW493705)的比對結(jié)果顯示其與分離自草莓果實的桃吉爾霉序列(登錄號MK301176.1)一致性達100%，與登錄號為MH855278.1的桃吉爾霉序列一致性達99.69%(圖2(b))。分別取10個不同菌株序列與J1和J2 ITS序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示J1菌株為白地霉，J2為桃吉爾霉(圖2)。以上結(jié)果表明，2種真菌的ITS比對結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察鑒定的結(jié)果一致。

圖2 J1(a)和J2(b)菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of J1 (a) and J2 (b) strains with the sequence alignment results

2.3 致病性測定

按照1.2.2的方法進行病原菌致病性的檢測，分別回接J1和J2菌液至大小均勻、成熟度一致、無機械損傷且無病害的水蜜桃果實。結(jié)果顯示2種真菌對桃果實的侵染情況不一致：白地霉回接1 d后，接種部位出現(xiàn)小范圍凹陷褐化，2 d后開始生出乳白色、短絨狀且呈發(fā)射型生長的菌絲，3 d后，接種桃表面出現(xiàn)大面積凹陷、潰爛，患病處白色粉末狀菌絲致密；桃吉爾霉回接1 d后，接種部位小范圍凹陷褐化，2 d后，接種部位周圍出現(xiàn)大面積軟腐，有凸起的白色至灰色致密霉層伴隨少量黑褐色孢子囊，3 d后整個桃表面都被霉層覆蓋，表明桃吉爾霉在桃的采后階段具有很強的傳播能力；對照傷口處無發(fā)病現(xiàn)象(圖3)。以上癥狀與田間觀測到的成熟病果的發(fā)病癥狀一致。從果實接種后發(fā)病部位進行病菌的再分離純化，得到與接種菌株一致的病原菌，致病性測定符合柯赫氏法則。因此，可初步認(rèn)定，桃吉爾霉和白地霉是造成桃果實軟腐的致病菌，其中桃吉爾霉具有更強的致病力。

24、48和72 h表示接種時間。24, 48 and 72 indicates the inoculation time.圖3 白地霉和桃吉爾霉接種桃果實的發(fā)病情況Fig.3 Disease symptoms of peach re-inoculated with the isolated G. candidum and G. persicaria

2.4 殺菌劑對病原菌的抑菌效果

本試驗結(jié)合無錫陽山當(dāng)?shù)靥肄r(nóng)對病害的防治習(xí)慣，利用當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)使用的殺菌劑農(nóng)藥，測試了不同濃度梯度的殺菌劑對致病菌的抑制效果(圖4)。研究結(jié)果顯示，對于白地霉菌，含有效成分33.5%喹啉銅懸浮劑或80%代森錳鋅可濕性粉劑均對白地霉菌絲的生長具有良好的抑制效果且該效果隨著藥劑濃度的降低而減弱，其中，二者1 000倍液都完全抑制了白地霉菌絲的生長；而含有效成分50%甲基硫菌靈懸浮劑和30%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑對白地霉菌絲的生長抑制效果均低于65.0%，且不同藥劑濃度間的抑制效果差別不顯著。對于桃吉爾霉，33.5%喹啉銅懸浮劑1 000倍液對桃吉爾霉的抑制效果最好，藥劑抑制率可達86.4%；30%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑對桃吉爾霉的抑制效果低于65.0%，且不同濃度間的抑制效果差別不顯著；80%代森錳鋅可濕性粉劑和50%甲基硫菌靈懸浮劑的抑制效果極弱，相較于對照無顯著差異。綜合比較4種殺菌劑對這2種致病菌的抑制效果，含有效成分33.5%喹啉銅懸浮劑的抑制效果好，其1 000倍液對2種致病菌都有強力的抑制效果(圖5)。

1 000、3 000和5 000分別表示殺菌劑的相應(yīng)稀釋倍液。圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。1 000, 3 000 and 5 000 respectively represent the corresponding diluted solution of fungicides. Different letters indicate significant difference(P<0.05).圖4 4種殺菌劑對分離鑒定到的2種致病菌的抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of four fungicides on the two identified pathogenic fungi

圖5 喹啉銅1 000倍液對白地霉和桃吉爾霉的抑制效果Fig.5 The inhibitory effect of 1 000 dilutions of oxine-copper on G.candidum and G. persicaria

3 討論與結(jié)論

陽山鎮(zhèn)地處江蘇省無錫市，每年夏季都會面臨大規(guī)模的降雨，與陽山水蜜桃的成熟采收期重疊，高濕和雨水環(huán)境會導(dǎo)致病原菌大量滋生蔓延，嚴(yán)重影響了水蜜桃的產(chǎn)量和品質(zhì)。桃吉爾霉造成的果腐病往年在陽山鎮(zhèn)個別果園中也偶有發(fā)生，及時防治阻止進一步蔓延沒有造成大范圍危害。相較于往年，2019年夏季陽山地區(qū)降雨尤為頻繁，6—9月的降雨量達到了142.03 mm，其余各月的平均降水量僅有57.80 mm。有研究表明，桃吉爾霉在15～37 ℃范圍內(nèi)均能生長，最適溫度為32 ℃，最適宜pH為5.0～6.0。高溫高濕的桃園環(huán)境可能是導(dǎo)致桃吉爾霉大范圍暴發(fā)的直接原因。

本研究從陽山水蜜桃的病桃中分離鑒定出白地霉和桃吉爾霉，依據(jù)柯赫氏法則，分別接種分離的白地霉和桃吉爾霉于健康水蜜桃果實，對應(yīng)果實發(fā)病后又分別分離純化出相應(yīng)的病原菌，由此確定這2種病原菌是無錫陽山地區(qū)成熟水蜜桃果實腐爛的病原菌。此前，國際上已有相關(guān)報道，白地霉會導(dǎo)致草莓、枇杷、馬鈴薯和桃等果實發(fā)生酸腐病害，而桃吉爾霉會造成桃、茄子、草莓、木瓜和黑莓等果實的軟腐病害。在我國，也有相關(guān)報道顯示，白地霉可侵染桑葚果實和馬鈴薯等引起酸腐病害，降低了果實品質(zhì)，造成了巨大的經(jīng)濟損失；桃吉爾霉能夠引起火龍果的軟腐病害，在一些火龍果園造成了較大范圍的侵染。本研究首次從受病害侵染的‘晚湖景’水蜜桃中分離鑒定出白地霉和桃吉爾霉，為當(dāng)?shù)亟窈蟮奶夜麑嵳婢『Ψ揽靥峁┝酥匾睦碚撝巍?/p>

本研究通過選用當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)使用的4種殺菌劑并測試其抑菌效果后發(fā)現(xiàn)，喹啉銅作為一種喹啉類保護性廣譜、高效、低毒和低殘留的殺菌劑，其1 000倍稀釋液對白地霉和桃吉爾霉這2種致病菌都有較好的抑制效果，且該濃度在田間試驗效果評價中未見藥害發(fā)生。因而，喹啉銅可作為候選藥劑用于當(dāng)?shù)亟窈筇疑a(chǎn)中防控真菌病害引起的腐爛病害。但是相關(guān)研究結(jié)果顯示，喹啉銅的半衰期在蘋果中為4.4～7.4 d，在黃瓜中為2.6～4.1 d，在枇杷中為3.4～4.6 d，使用不當(dāng)可能會污染環(huán)境，甚至危害人類健康，因此應(yīng)在今后的生產(chǎn)中規(guī)范喹啉銅的使用。