潘柏如 張海軍 王楊 楊娟

(達(dá)州市中心醫(yī)院胸外科，四川 達(dá)州 635000)

細(xì)顆粒物指環(huán)境空氣中空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑小于等于 2.5 μm的顆粒物[1]，PM2.5能夠避開呼吸系統(tǒng)屏障進(jìn)入血液循環(huán)，擾亂先天免疫機(jī)制[2]。能較長(zhǎng)時(shí)間懸浮于空氣中，其在空氣中含量濃度越高，就代表空氣污染越嚴(yán)重[3]。2010年～2015年，全球總體PM2.5水平由每平方米39.7 mg增加至每平方米44.2 mg，同時(shí)期可歸因于PM2.5的死亡人數(shù)估計(jì)增加了約20%[4]。臨床和實(shí)驗(yàn)研究都已經(jīng)證實(shí)，PM2.5暴露與肺癌，特別是非小細(xì)胞肺癌(Non small cell lung cancer,NSCLC)之間存在因果關(guān)系[5]。一項(xiàng)針對(duì)1890萬人進(jìn)行的流行病學(xué)研究表明，接觸PM2.5后12個(gè)月和60個(gè)月，肺癌死亡風(fēng)險(xiǎn)分別增加1.13倍和1.33倍[6]。大鼠經(jīng)氣管內(nèi)注入PM2.5后，異常變化的miRNAs會(huì)通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞導(dǎo)致大鼠免疫功能失衡[7]。英國(guó)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)行走在污染街道上2 h的非吸煙人群的循環(huán)miRNA基因組進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，54種miRNA在血漿中有高表達(dá)，其中7種miRNA在肺中高表達(dá)[8]。本研究通過建立PM2.5暴露大鼠模型，檢測(cè)大鼠血清及肺組織中miRNA的表達(dá)，探討PM2.5對(duì)表觀遺傳學(xué)及肺組織損傷的影響，以期為PM2.5誘發(fā)肺癌的早期診斷提供更多策略，并對(duì)PM2.5誘發(fā)肺癌的可能機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞、試劑與儀器 蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，人支氣管上皮細(xì)胞16HBE購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司，CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上?？瓢┥锛夹g(shù)有限公司，CD34免疫熒光染色試劑盒購(gòu)自北京瑟斯騰環(huán)境科技有限公司，兔抗大鼠Notch1、兔抗大鼠HES1、兔抗大鼠Beclin1(1:800，美國(guó)Abcam)、兔抗大鼠Hes1、兔抗大鼠cleaved-Caspase3、兔抗大鼠GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自Sigma公司，RIPA 裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。凝膠成像掃描儀購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，微?？諝膺^濾器(Heap過濾器)購(gòu)于蘇州威洛斯特過濾設(shè)備有限公司，PM2.5特氟龍濾膜購(gòu)于美國(guó)TISCH公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只6周齡雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，購(gòu)于成都中醫(yī)藥大學(xué)[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2019-11]。所有大鼠均飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房中，室溫(22±1)℃，相對(duì)濕度40%～70%，晝夜循環(huán)12 h,大鼠可自由進(jìn)食、飲水。本研究符合動(dòng)物倫理要求,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 PM2.5采集與純化 利用Heap過濾器采集本市繁華路段空氣中顆粒物，采用濾膜進(jìn)行采樣。將載有PM2.5的特氟龍濾膜剪成3 cm×3 cm大小后放入錐形瓶，加入200 mL蒸餾水后超聲震蕩30 min，醫(yī)用紗布過濾5次，在4℃、12000 rpm條件下離心30 min，干燥處理得到的細(xì)顆粒物，-20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)實(shí)驗(yàn)要求，在實(shí)驗(yàn)開始前配置PM2.5溶液。

1.3.2 動(dòng)物分組及模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和PM2.5干預(yù)組：低劑量組(2.5 mg/kg)、中劑量組(10 mg/kg)、高劑量組(20 mg/kg)，每組10只。麻醉滿意后，PM2.5干預(yù)組大鼠分別經(jīng)氣管內(nèi)滴注PM2.5混懸液2.5、10、20 mg/kg，對(duì)照組注射50 μL生理鹽水，每3 d一次，連續(xù)70 d，模擬慢性PM2.5暴露。氣管內(nèi)滴注后第70天處死大鼠，取雙側(cè)肺作進(jìn)一步研究。之后，矢狀面切除左肺中間帶進(jìn)行病理檢查。右肺保存在液氮中，用于RNA和蛋白質(zhì)的提取和定量。

1.3.3 肺組織病理學(xué)檢查 取大鼠左肺門附近肺組織進(jìn)行病理檢查，光鏡觀察。光鏡下，將肺組織固定在4%多聚甲醛溶液中。石蠟包埋后，取4 μm切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察肺組織病理改變。

1.3.4 miRNA的RNA-seq高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析 采用TRLzol試劑(Invitrogen，USA)提肺大鼠臟組織中總RNA。對(duì)RNA的濃度和質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。利用瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定RNA完整性。應(yīng)用安捷倫微RNA芯片對(duì)肺臟中miRNA進(jìn)行分析。選擇不同的index標(biāo)簽建庫(kù)后。采用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS試劑在cBot上生成簇，而后利用測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行單端測(cè)序。

1.3.5 人支氣管上皮細(xì)胞16 HBE培養(yǎng)及CCK-8檢測(cè) 人支氣管上皮細(xì)胞16HBE在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的Dulbecco's改良Eagle's培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在含5% CO2的37℃孵育箱中培養(yǎng)。用100 μg/mL濃度的PM2.5處理16 HBE細(xì)胞24～48 h，連續(xù)5代，模擬慢性暴露。miR-296-5p inhibitor及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染16 HBE細(xì)胞12 h后，每代加PM2.5(100 μg/mL)，連續(xù)傳5代。細(xì)胞干預(yù)完畢后，加入含CCK-8的培養(yǎng)基，CCK-8溶液約占細(xì)胞培養(yǎng)基體積的1/10。放入孵箱培養(yǎng)40 min，觀察顏色變?yōu)槌壬_始檢測(cè)。將孔板取出，放入酶標(biāo)儀檢測(cè)，波長(zhǎng)設(shè)為450 nm。處理分析數(shù)據(jù)。

1.3.6 CD34免疫熒光染色 將制備好的大鼠肺臟切片放入濕盒中，濕盒底部加水，注意防止干片。 在玻片標(biāo)本中央滴加50 μL的CD34一抗，室溫孵育1 h，PBS洗三遍，每次5 min。小心吸去PBS，加入二抗，室溫孵育45 min，PBS洗四遍，每次5 min。小心吸去PBS，加入0.5 μg/mL DAPI染色10 min，用PBS洗三遍，去除多余的DAPI。加入20 μL封片劑封片。立即在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.7 Western blot檢測(cè) 用RIPA裂解緩沖液處理細(xì)胞后提取總蛋白，細(xì)胞裂解液在4℃、12000 rpm條件下離心15min，收集上清液。采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒，測(cè)定蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到NC膜上，用5%脫脂牛奶封閉。然后，用Notch1(1∶1000，美國(guó)Abcam)、HES1(1∶1000,美國(guó)Abcam)、Beclin1(1∶800，美國(guó)Abcam)、Hes1(1∶1000，美國(guó)Abcam)、cleaved-Caspase3(1∶1000，美國(guó)Abcam)、GAPDH抗體(1∶1000，美國(guó)Abcam)在4℃的搖床上孵育過夜，然后在室溫下與二抗孵育2 h，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行量化和可視化。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重及精神狀態(tài) 在實(shí)驗(yàn)期間的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組大鼠的體重始終較低，且PM2.5干預(yù)劑量越高，大鼠體重越低(P<0.05)。對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)活躍，二便正常，皮毛有光澤，反應(yīng)靈敏,活潑好動(dòng)。PM2.5干預(yù)組精神狀態(tài)差，活動(dòng)減少，毛色灰暗，對(duì)刺激的反應(yīng)性下降。見圖1。

圖1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間體重變化

2.2 大鼠肺臟大體觀及HE染色 對(duì)照組大鼠肺臟呈均勻粉紅色，質(zhì)地柔軟，表面無明顯異常；干預(yù)組大鼠肺臟顏色灰暗無光澤，可見多處白色隆起，質(zhì)地不均勻、不光滑。其中高劑量組大鼠肺切片HE染色可見大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)并有顆粒物沉積，細(xì)支氣管上皮不典型增生，部分腺體乳頭狀增生，部分管腔腺體擁擠、紊亂。見圖2。

圖2 各組大鼠肺臟大體觀及HE染色

2.3 免疫熒光染色檢測(cè) 與對(duì)照組相比，PM2.5干預(yù)組大鼠肺組織中CD34表達(dá)升高，干預(yù)濃度越高，CD34表達(dá)密度越高。表明PM2.5可誘導(dǎo)大鼠肺部血管增生活躍，微血管密度增加。見圖3。

圖3 大鼠肺組織CD34免疫熒光染色

2.4 各組大鼠肺組織差異性表達(dá)的miRNA miRNA的RNA-seq 高通量測(cè)序顯示，與對(duì)照組比較，PM2.5干預(yù)組大鼠肺組織差異表達(dá) miRNAs有67個(gè)，其中上調(diào)48個(gè),下調(diào)的19個(gè)，表達(dá)量差異倍數(shù)高于5倍的有4個(gè),即miR-296-5p、miR-27a、miR-182、miR-92a-1-p5。其中miR-296-5p上調(diào)了7.85倍，是表達(dá)差異最大的miRNA。見圖4。

圖4 四組大鼠肺組織差異性miRNA表達(dá)熱圖

2.5 CCK-8檢測(cè) 正常對(duì)照組、PM2.5干預(yù)組、miRNA陰性對(duì)照組、miR-296-5p inhibitor組的OD值分別為0.76±0.13、0.38±0.08、0.41±0.09、0.59±0.12。與正常對(duì)照組相比，PM2.5干預(yù)組的細(xì)胞活性顯著下降(P<0.05)，經(jīng)miR-296-5p inhibitor干預(yù)后，細(xì)胞活性明顯升高(P<0.05)。 見圖5。

圖5 各組細(xì)胞CCK-8活性檢測(cè)

2.6 Western blot檢測(cè) 與對(duì)照組比較，經(jīng)PM2.5干預(yù)后，細(xì)胞中的Notch1蛋白、HES1蛋白表達(dá)量降低，Beclin1蛋白、cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)；與miRNA陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染miR-296-5p inhibitor后，細(xì)胞中的Notch1蛋白，HES1蛋白、Beclin1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P<0.05)。表明在肺上皮細(xì)胞中，抑制miR-296-5p表達(dá)，可抑制Notch1信號(hào)通路激活。見圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)肺上皮細(xì)胞中Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

流行病學(xué)的證據(jù)表明，肺癌與PM2.5暴露之間存在正相關(guān)關(guān)系[9]。現(xiàn)已證實(shí)PM2.5致肺部癌變的機(jī)制與肺上皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、產(chǎn)生活性氧、DNA損傷[10]和細(xì)胞骨架重塑[11]有關(guān)。本研究中，大鼠在PM2.5暴露10W后，在肺組織中發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的病理改變，包括肺泡間隔增厚和肺組織細(xì)支氣管上皮增生。

PM2.5暴露影響血液、唾液、心臟和肺等不同組織/器官的miRNAs表達(dá)調(diào)控[12]。此外，血清miRNA可作為非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌和糖尿病早期檢測(cè)和診斷的生物標(biāo)志物[13]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)血清和肺中miRNAs表達(dá)異常，這些miRNAs與PM2.5暴露8周誘發(fā)的肺癌等肺部疾病有關(guān)。以往的研究表明[14]，PM2.5及其組分可以進(jìn)入血液循環(huán)，誘導(dǎo)表觀遺傳學(xué)改變，在不改變核苷酸序列的情況下影響基因表達(dá)。英國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)中僅僅吸入汽車尾氣2 h，志愿者細(xì)胞的基因組DNA上約有2800個(gè)位點(diǎn)的DNA甲基化過程發(fā)生了改變，影響了大約400個(gè)基因的表達(dá)，其中包含了與過敏性疾病、炎癥、氧化應(yīng)激有關(guān)的基因。同時(shí)，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)顯示，受試者在離開尾氣環(huán)境后，尾氣帶來的DNA甲基化改變至少持續(xù)30 h，這與其它研究的結(jié)果一致。PM2.5的組成和含量十分復(fù)雜，包括金屬、多環(huán)芳烴、多氯二苯并二惡二苯并呋喃和多氯聯(lián)苯等，這些都是造成基因組不穩(wěn)定的原因[15]。高水平的PM2.5結(jié)合的多環(huán)芳烴可能具有誘變和致癌的潛力[16]。接觸多環(huán)芳烴與DNA損傷增加、微核形成增加和異常細(xì)胞周期停滯有關(guān)[11]。在本研究中，PM2.5暴露后針對(duì)Bax和RASSF5基因的miR-296-5p和miR-27a表達(dá)增加，這可能與DNA修復(fù)和細(xì)胞增殖失控有關(guān)。以往的研究表明[17]，PM2.5的金屬含量和組成通過直接或間接誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生和增加氧化應(yīng)激來促進(jìn)DNA損傷[18]。PM2.5來源的多環(huán)芳烴引起的脂質(zhì)代謝反應(yīng)可能與大鼠或人的肺部病變有關(guān)[19]。同時(shí)，PM2.5對(duì)機(jī)體基因表達(dá)有顯著的調(diào)控作用[20]。有研究者收集PM2.5污染物后，讓小鼠暴露在這些PM2.5污染的空氣中，檢測(cè)對(duì)小鼠基因的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露并不改變基因的序列，即并不引起DNA突變，但是會(huì)影響DNA上化學(xué)修飾的變化，主要是DNA甲基化，進(jìn)而影響了基因的表達(dá)[21]。

在本研究中，miRNA 的RNA-seq 高通量測(cè)序顯示，干預(yù)組大鼠肺組織差異表達(dá) miRNAs有67個(gè)，其中上調(diào)48個(gè),下調(diào)的19個(gè)，表達(dá)量差異倍數(shù)高于5倍的有4個(gè),即miR-296-5p、miR-27a、miR-182、miR-92a-1-p5。在固體組織中高豐度的miRNAs通常也存在于血液中，但總是有顯著的變異[22]。全血中miRNAs的總體模式不僅由特定的實(shí)體器官?zèng)Q定，還受其他因素的影響。有必要考慮到血清和肺組織中miRNAs的豐度差異，靶器官中的miRNAs反映了特定組織的損傷[23]。肺組織中miRNAs的差異表達(dá)也可提示PM2.5暴露后肺外組織可能存在損傷[16]。

Notch基因編碼一類高度保守的細(xì)胞表面受體[24]，它們調(diào)節(jié)從海膽到人等多種生物細(xì)胞的發(fā)育[25]。Notch基因編碼一種膜蛋白受體，由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子(CSL-DNA結(jié)合蛋白)三部分組成[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，經(jīng)PM2.5干預(yù)后，細(xì)胞中的Notch1蛋白、HES1蛋白表達(dá)量降低，Beclin1蛋白、cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)量升高，表明PM2.5可顯著激活肺上皮細(xì)胞中Notch信號(hào)通路。不同于其他信號(hào)通路，Notch信號(hào)通路中Notch的受體和配體都是膜蛋白[27]，它介導(dǎo)的是兩個(gè)細(xì)胞相互靠近接觸之后的活化效應(yīng)，而不是由分泌型的蛋白作為配體[26]。有研究表明[28]，miRNA可通過抑制Notch信號(hào)中DII1受體表達(dá)而促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。同時(shí)在本研究中，經(jīng)miR-296-5p inhibitor干預(yù)后，細(xì)胞中的Notch1蛋白，HES1蛋白、Beclin1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高。表明在肺上皮細(xì)胞中，抑制miR-296-5p表達(dá)，可抑制Notch1信號(hào)通路激活。因此我們推測(cè)，miR-296-5p可能是通過與Notch受體結(jié)合后觸發(fā)Notch信號(hào)的活化，導(dǎo)致Notch受體發(fā)生蛋白水解，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮生物學(xué)功能。Notch信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)體正常發(fā)育的一些關(guān)鍵步驟，所以，該通路的某些分子發(fā)生突變，或者其下游事件發(fā)生改變，都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)功能的顯著變化，影響上皮細(xì)胞功能。

4 結(jié)論

暴露于PM2.5環(huán)境中，大鼠肺組織中miRNAs的表達(dá)譜發(fā)生了紊亂，以miR-296-5p的表達(dá)失衡最明顯，且miR-296-5p的表達(dá)失衡可通過Notch信號(hào)通路發(fā)揮效應(yīng)，影響上皮細(xì)胞功能。