朱麗云，鐘 鈺，柳小莉，鄭 琴*，李文靜，任桂林，肖 帥

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

失眠，又稱為“不寐癥”，是指患者對(duì)睡眠時(shí)間和(或)質(zhì)量不滿足并影響其日間社會(huì)功能的一種主觀體驗(yàn)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)目前有3億的失眠患者，這個(gè)數(shù)字正逐年增加并趨于年輕化。長(zhǎng)期的慢性失眠會(huì)導(dǎo)致肥胖[2]、糖尿病、高血壓[3-4]、心腦血管[5]等疾病，還會(huì)導(dǎo)致焦慮癥、抑郁癥等精神疾病[6]。目前臨床治療失眠常見(jiàn)的藥物有苯二氮卓類和非苯二氮卓類受體激動(dòng)劑、褪黑素受體激動(dòng)劑、食欲素受體拮抗劑、抗組胺受體藥以及鎮(zhèn)靜類抗抑郁藥[7-8]，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生依賴性、宿醉、嗜睡、體質(zhì)量增加以及第2天眩暈等副作用[9]。盡管失眠現(xiàn)象普遍存在，但發(fā)病機(jī)制仍未有清晰的定義，因此，尋找新療法、新方法仍是當(dāng)下研究的主要方向。

當(dāng)歸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又名云歸、西歸、秦歸，為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，性溫、辛、甘，入肝、心、脾經(jīng)，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便的功能[10]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸揮發(fā)油中的藁本內(nèi)酯通過(guò)緩解氯胺酮興奮中樞的作用，緩解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的躁動(dòng)不安，具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)靜作用[11]。通過(guò)腹腔注射藁本內(nèi)酯，可顯著降低戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠潛伏期，延長(zhǎng)睡眠持續(xù)時(shí)間[12]。然而當(dāng)歸揮發(fā)油治療失眠的機(jī)制尚未明確，本研究主要是通過(guò)GC-MS分析當(dāng)歸揮發(fā)油的主要化學(xué)成分，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)當(dāng)歸揮發(fā)油治療失眠的作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)，為當(dāng)歸揮發(fā)油防治失眠的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 當(dāng)歸(產(chǎn)地甘肅岷縣，批號(hào)20201210)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉榮華教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，質(zhì)量符合2020年版《中國(guó)藥典》第一部的要求。

1.2 試劑與儀器 無(wú)水乙醇(批號(hào)2011039)、無(wú)水硫酸鈉(批號(hào)2009032)購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司，均為分析純。DZTW控溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；HLD-30002型電子天平(杭州友恒稱重設(shè)備有限公司)；Agilent 7 890 A/5975C型GC-MS儀器(美國(guó)安捷倫公司)。

2 方法

2.1 當(dāng)歸揮發(fā)油提取 參考文獻(xiàn)[13]方法，精密稱取當(dāng)歸中藥材粗粉100.00 g，裝入2 L圓底燒瓶中，加入1 000 mL水，浸泡2 h，提取8 h，收集提取器中的當(dāng)歸揮發(fā)油，加入適量的無(wú)水硫酸鈉，靜置、脫水，即得當(dāng)歸揮發(fā)油。

2.2 當(dāng)歸揮發(fā)油GC-MS分析 氣相色譜條件[14]，HP-5MS毛細(xì)管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度230 ℃采用程序升溫(80 ℃以3 ℃/min升溫至167 ℃，保持2.5 min；以2 ℃/min升至202 ℃；以4 ℃/min升至280 ℃，保持15 min)；載氣為高純氦氣；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜條件，離子源溫度230 ℃；電子轟擊電離源，電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；掃描范圍35～550m/z。

2.3 當(dāng)歸揮發(fā)油化學(xué)成分鑒定 數(shù)據(jù)處理采用Data Analysis軟件完成。將其閾值調(diào)整為16，對(duì)當(dāng)歸揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行篩選。所分辨的質(zhì)譜在NIST 17.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中檢索，根據(jù)匹配度、保留指數(shù)和文獻(xiàn)已報(bào)道物質(zhì)進(jìn)行核對(duì)，確定當(dāng)歸揮發(fā)油主要活性成分。

2.4 當(dāng)歸揮發(fā)油主要活性成分靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)以及SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選當(dāng)歸揮發(fā)油主要活性成分作用靶點(diǎn)。所獲得的靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)中，靶點(diǎn)名稱限定物種為人，規(guī)范靶點(diǎn)名稱，獲得UniProt號(hào)。

2.5 失眠潛在作用靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)Therapeutic Target Datebase數(shù)據(jù)庫(kù)(TTD，https://db.idrblab.org/ttd/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/)以及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)以“insomnia”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索失眠相關(guān)靶點(diǎn)。刪除重復(fù)靶點(diǎn)，通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)校正為官方名稱。

2.6 當(dāng)歸揮發(fā)油成分-失眠靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線數(shù)據(jù)庫(kù)將獲得的當(dāng)歸揮發(fā)油成分靶點(diǎn)與失眠疾病靶點(diǎn)取交集，將交集靶點(diǎn)作為潛在靶點(diǎn)，潛在靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分視為潛在活性成分。將當(dāng)歸揮發(fā)油的活性成分和靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，構(gòu)建當(dāng)歸揮發(fā)油活性成分作用靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖，預(yù)測(cè)當(dāng)歸揮發(fā)油治療失眠的主要靶點(diǎn)和活性成分。

2.7 蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)[15]中，設(shè)置Organism為人類“Homosapiens”，以置信度(combined score)≥0.40為篩選標(biāo)準(zhǔn)，PPI結(jié)果以tsv格式下載，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，運(yùn)用Network Analyzer插件對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行運(yùn)算分析，以拓?fù)鋮?shù)度值(degree)大于各節(jié)點(diǎn)度值平均數(shù)的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。

2.8 信號(hào)通路與生物過(guò)程分析 將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)[16-17](DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)，Select Identifier選擇“official gene symbol”，List Type設(shè)置為“gene list”，物種選擇為“Homosapiens”，設(shè)定閾值P<0.01。對(duì)當(dāng)歸揮發(fā)油防治失眠的靶點(diǎn)進(jìn)行g(shù)eneontology選項(xiàng)下(GO，功能富集分析)生物過(guò)程(biology process)和Pathways選項(xiàng)下(KEGG，基因組百科全書(shū))信號(hào)通路富集分析，獲得當(dāng)歸揮發(fā)油與疾病之間的生物過(guò)程和信號(hào)通路富集分析。利用在線繪圖平臺(tái)ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)將其結(jié)果進(jìn)行可視化。

2.9 靶點(diǎn)-組織分布網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)[18]，查找潛在靶點(diǎn)組織分布，下載tsv的格式文件，對(duì)數(shù)據(jù)表達(dá)量(NX)大于10的的組織或器官(tissue)進(jìn)行分析，應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-組織網(wǎng)絡(luò)。

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸揮發(fā)油的GC-MS分析結(jié)果 通過(guò)GC-MS分析鑒定出了14個(gè)化學(xué)成分，如圖1所示，相對(duì)含量為當(dāng)歸揮發(fā)油的99.57%，其中最高的是Ligustilide(81.70%)、trans-beta-Ocimene(7.96%)，見(jiàn)表1。

圖1 當(dāng)歸揮發(fā)油GC-MS總離子流圖

3.2 潛在靶點(diǎn)的篩選 采用TCMSP、Pubchem、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的成分靶點(diǎn)，TTD、DrugBank、DisGeNET、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的疾病靶點(diǎn)，分別剔除重復(fù)靶點(diǎn)，得到144個(gè)成分靶點(diǎn)和172個(gè)疾病靶點(diǎn)，兩者取交集得到41個(gè)交集靶點(diǎn)，作為潛在靶點(diǎn)。

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 如圖2所示，包含了38個(gè)節(jié)點(diǎn)，161條邊。運(yùn)用Cytoscape 3.7.1中Network Analyzer插件對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行運(yùn)算分析，degree平均值為8.47，degree值表示靶點(diǎn)之間的相互作用，其值越大，節(jié)點(diǎn)也越大，表明當(dāng)歸揮發(fā)油可能通過(guò)作用于這些關(guān)鍵靶點(diǎn)得以在失眠癥中發(fā)揮作用。根據(jù)靶點(diǎn)運(yùn)算分析結(jié)果，SLC6A4的degree值最大，其次是CHRNA4、DRD2、HTR2A等，見(jiàn)表2。

3.4 當(dāng)歸揮發(fā)油成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 如圖3所示，有54個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中化合物節(jié)點(diǎn)12個(gè)，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)41個(gè)，126條邊，每條邊代表當(dāng)歸揮發(fā)油成分-疾病靶點(diǎn)之間的相互作用，用degree值表示，節(jié)點(diǎn)大小代表degree值大小(紅色三角形節(jié)點(diǎn)代表當(dāng)歸，綠色V形節(jié)點(diǎn)代表化學(xué)成分，藍(lán)色圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn))，degree值越大與節(jié)點(diǎn)連接的靶點(diǎn)越多。在網(wǎng)絡(luò)中，有16個(gè)節(jié)點(diǎn)的degree值≥ 4.67(平均值)，有效成分節(jié)點(diǎn)有9個(gè)，見(jiàn)表3。

表1 當(dāng)歸揮發(fā)油主要化學(xué)成分

圖2 核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 當(dāng)歸揮發(fā)油成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)信息

表3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)成分信息

3.5 GO生物過(guò)程分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO生物富集分析得到104個(gè)條目，以條形圖展示排名前20的通路，其中包含63個(gè)生物過(guò)程(BP)條目，25個(gè)分子功能(MF)條目和16個(gè)細(xì)胞組成(CC)條目，見(jiàn)圖4。生物過(guò)程主要涉及G-蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路(G-protein coupled receptor signaling pathway)、氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(chloride transmembrane transport)、γ-氨基丁酸信號(hào)通路(gamma-aminobutyric acid signaling pathway)、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號(hào)通路(adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway)、細(xì)胞增殖(cell proliferation)等；分子功能主要涉及質(zhì)膜(plasma membrane)、突觸后膜(postsynaptic membrane)、神經(jīng)元細(xì)胞體(neuronal cell body)、GABA-A 受體復(fù)合物(GABA-A receptor complex)、氯離子通道復(fù)合體(chloride channel complex)等；細(xì)胞組成主要涉及細(xì)胞外配體門控離子通道活性(extracellular ligand-gated ion channel activity)、GABA-A受體活性(GABA-A receptor activity)、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性(G-protein coupled acetylcholine receptor activity)、腎上腺素結(jié)合(epinephrine binding)、苯二氮卓受體活性(benzodiazepine receptor activity)等。

3.6 KEGG信號(hào)通路分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析得到18條信號(hào)通路(P<0.01)，如圖5所示，主要涉及神經(jīng)活動(dòng)配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣離子信號(hào)通路(Calcium signaling pathway)、γ-氨基丁酸能突觸(GABAergic synapse)、膽堿能突觸(Cholinergic synapse)、cGMP-PKG信號(hào)通路(cGMP-PKG signaling pathway)、5-羥色胺能突觸(Serotonergic synapse)等。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG富集通路

3.7 組織-靶點(diǎn)分布圖 通過(guò)整理分析，共獲得2 483條組織數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)表達(dá)量NX大于10的組織進(jìn)行分析，篩選出280條組織(tissue)數(shù)據(jù)，見(jiàn)圖6(綠色圓形節(jié)點(diǎn)代表交集靶點(diǎn)，紅色菱形節(jié)點(diǎn)代表組織或器官靶點(diǎn)，度值越大，節(jié)點(diǎn)越大)。結(jié)果表明41個(gè)潛在靶點(diǎn)分別在基底神經(jīng)節(jié)、大腦皮層、嗅覺(jué)、腦橋和髓質(zhì)、海馬等組織中表達(dá)。

圖6 組織-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

4 結(jié)論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，通過(guò)多學(xué)科的交叉應(yīng)用和整體生物網(wǎng)絡(luò)的整合與分析，構(gòu)建藥物與疾病作用靶點(diǎn)間的相互作用，闡述中藥活性成分間的協(xié)同作用，通過(guò)“中藥-成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，探討藥物與疾病間的相互作用，為藥物開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)[19]。

研究表明，當(dāng)歸揮發(fā)油主要是由苯酞類化合物、苯酚類二聚體、萜類、酚類及烷烴化合物為主，其藁本內(nèi)酯(Ligustilide)含量最高,其次是丁烯基酞內(nèi)酯[3-Butylisobenzofuran-1(3H)-one][20]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[21]，當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用，通過(guò)腹腔注射藁本內(nèi)酯98、196 mg/kg，均能抑制小鼠的自發(fā)活動(dòng)，延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠持續(xù)時(shí)間，降低體溫，抑制電刺激誘發(fā)的激怒反應(yīng)(P<0.01)。王宇等[22]研究發(fā)現(xiàn)，藁本內(nèi)酯能結(jié)合和激動(dòng)GABAA受體的苯二氮卓類位點(diǎn)，達(dá)到鎮(zhèn)靜、抗焦慮、抗癲癇的作用。丁烯基酞內(nèi)酯是當(dāng)歸揮發(fā)油中苯酞類活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其不僅是有效的5-HT和去甲腎上腺素再攝取的抑制劑，而且對(duì)單氨氧化酶具有一定的抑制作用[23]。Deng等[24]發(fā)現(xiàn)苯酞類二聚體化合物Riligustilide、Gelispirolide與GABA受體具有較號(hào)的結(jié)合能力，這表明苯酞類化合物具有防治失眠的潛力。

通過(guò)GC-MS結(jié)果分析顯示，當(dāng)歸揮發(fā)油主要包含Ligustilide、trans-beta-Ocimene、Z-Butylidenephthalide等14種活性成分，對(duì)當(dāng)歸揮發(fā)油進(jìn)行檢索和篩選，獲得14種成分對(duì)應(yīng)144個(gè)靶點(diǎn)。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明，當(dāng)歸揮發(fā)油中SLC6A4、CHRNA4、DRD2、HTR2A、CHRM1等靶點(diǎn)治療失眠的可能性較大。SLC6A4、HTR2A是色氨酸途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因，維持5-HT的穩(wěn)態(tài)[25]。CHRNA4是神經(jīng)元nAChR的主要基因，其突變可能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[26]。DRD2廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是最重要的多巴胺自身受體[27]。綜上所述，當(dāng)歸揮發(fā)油中的關(guān)鍵靶點(diǎn)可能是通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而防治失眠，間接證明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是預(yù)測(cè)成分靶點(diǎn)的有力工具。

核心靶點(diǎn)與組織分布結(jié)果表明，41個(gè)潛在靶點(diǎn)在神經(jīng)遞質(zhì)中高表達(dá)。KEGG結(jié)果顯示，當(dāng)歸揮發(fā)油治療失眠潛在作用靶點(diǎn)主要涉及G-蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、γ-氨基丁酸信號(hào)通路等生物過(guò)程，主要涉及細(xì)胞外配體門控離子通道活性、GABA-A受體活性、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性等分子功能，主要涉及質(zhì)膜、神經(jīng)元細(xì)胞體、GABAA受體復(fù)合物等細(xì)胞組成。主要與神經(jīng)活動(dòng)配體-受體相互作用、鈣信號(hào)通路、γ-氨基丁酸能突觸、膽堿能突觸、cGMP-PKG信號(hào)通路、5-羥色胺能突觸等通路有關(guān)。當(dāng)歸揮發(fā)油的活性成分主要與以上生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組成以及信號(hào)通路達(dá)到治療失眠癥的目的。

綜上所述，當(dāng)歸揮發(fā)油治療失眠的作用靶點(diǎn)，分布于不同的代謝通路，多成分、多靶點(diǎn)以及多通路的相互作用是治療失眠癥的特點(diǎn)。研究結(jié)果初步驗(yàn)證了當(dāng)歸揮發(fā)油的作用機(jī)制和基礎(chǔ)藥理學(xué)作用，為進(jìn)一步研究探討作用機(jī)制提供了理論依據(jù)及研究方向。