張金鶴石慧 周英 張麗艷張海董秀劉雄偉俸婷婷*

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 貴州550025； 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥食兩用資源應(yīng)用與開發(fā)研究中心，貴陽 貴州550025； 3.貴州三力制藥股份有限公司，安順 貴州561100）

開喉劍噴霧劑（兒童型）是貴州三力制藥股份有限公司生產(chǎn)的獨(dú)家苗藥大品種，由八爪金龍、山豆根、蟬蛻、薄荷腦組成，具有清熱解毒、消腫止痛之功效［1］，臨床上用于治療兒童急性咽炎、扁桃體炎［2-3］、皰疹性口腔炎［4］、皰疹性咽峽炎［5］、手足口?。?］、鵝口瘡［7］等疾病，療效顯著，而且安全性高，無不良反應(yīng)。其中，收載至《貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》 的八爪金龍包含朱砂根、百兩金、紅涼傘三個(gè)基原，開喉劍噴霧劑組方所用藥材為朱砂根。目前，關(guān)于開喉劍噴霧劑（兒童型）質(zhì)量控制的研究較少，主要指標(biāo)成分僅為巖白菜素和苦參堿［8-9］，專屬性較差。前期報(bào)道，巖白菜素為朱砂根主要化學(xué)成分，具有良好的止咳、抗炎作用［10-11］；山豆根含有生物堿、黃酮、三萜等多種成分［12］，其中苦參堿具有抗炎、抑菌、保肝等作用［13］，三葉豆紫檀苷、馬卡因在誘導(dǎo)白血病HL-60 細(xì)胞凋亡方面療效顯著［14］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用一測多評法同時(shí)測定開喉劍噴霧劑（兒童型）中苦參堿、巖白菜素、三葉豆紫檀苷、馬卡因的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；XS-205 型電子天平（十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 試劑與藥物 苦參堿（批號PS011495，純度≥98.5%）、巖白菜素（批號PS010520，純度≥98.0%）、三葉豆紫檀苷（批號PS012410，純度≥98.0%）、馬卡因（批號PS210802-06，純度≥98.0%）對照品均購自成都普思生物科技有限公司。開喉劍噴霧劑（兒童型）（貴州三力制藥股份有限公司，批號 20200706、20200720、20200730、20200733、20200736、20200748、20200804、20200805、20200812、20200814）。甲醇、磷酸、三乙胺均為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為純凈水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Platisil-ODS 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）-0.1% 磷酸（三乙胺調(diào)節(jié)pH 至5.0）（B），梯度洗脫（0～8 min，10% A；8～19 min，10%～30% A；19～28 min，30%A；28～32 min，30%～40% A；32～40 min，40%～60% A；40～70 min，60%～100%A）；體積流量0.8 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長220 nm（苦參堿）、275 nm（巖白菜素）、300 nm（三葉豆紫檀苷、馬卡因）；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取苦參堿、巖白菜素、三葉豆紫檀苷對照品適量，置于10 mL 量瓶中；精密稱取馬卡因?qū)φ掌愤m量，置于25 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，作為貯備液，分別精密量取3.5、4.0、1.0、0.6 mL，置于同一10 mL量瓶中，甲醇定容，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為0.709 1、0.802 4、0.103 6、0.024 56 mg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 精密吸取本品2.5 mL，置于5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按本品處方工藝，分別制備缺朱砂根、缺山豆根的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專屬性考察 吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰均具有良好的分離度，與對照品色譜峰保留時(shí)間一致，并且未在相應(yīng)陰性樣品中檢測出，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液0.4、1.2、2.0、2.5、3.5 mL，置于5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得苦參堿、巖白菜素、三葉豆紫檀苷、馬卡因峰面積RSD 分別為1.09%、1.68%、1.24%、1.16%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批本品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得苦參堿、巖白菜素、三葉豆紫檀苷、馬卡因峰面積RSD 分別為2.00%、0.81%、1.81%、0.88%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得苦參堿、巖白菜素、三葉豆紫檀苷、馬卡因含量RSD 分別為1.38%、1.18%、1.50%、1.55%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取各成分含量已知的同一批本品1.25 mL，共6份，置于5 mL 量瓶中，加入對照品溶液（含苦參堿0.352 6 mg／mL、巖白菜素0.645 2 mg／mL、三葉豆紫檀苷0.056 45 mg／mL、馬卡因0.013 50 mg／mL）1.25 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.9 相對校正因子計(jì)算 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以巖白菜素為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他3 種成分相對校正因子fk／s，公式為fk／s＝fk／fs＝（WkAs）／（WsAk）（Wk為其他成分質(zhì)量濃度，Ak為其他成分峰面積，Ws為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度，As為內(nèi)標(biāo)峰面積），結(jié)果見表3。

表3 各成分相對校正因子Tab.3 Relative correlation factors of various constituents

2.10 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響考察Agilent 1260、Waters e2695 色譜儀及Platisil-ODS、Diamonsil-C18、Agilent 5 TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對相對校正因子的影響，結(jié)果見表4，可知均無明顯影響（RSD＜5%）。

表4 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.11 不同柱溫對相對校正因子的影響 采用Agilent 1260 色譜儀、Platisil-ODS 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），考察柱溫30、35、40 ℃對相對校正因子的影響，結(jié)果見表5，可知均無明顯影響（RSD＜5%）。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.12 不同體積流量對相對校正因子的影響 采用Agilent 1260 色譜儀、Platisil-ODS 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），考察體積流量 0.7、0.8、0.9 mL／min對相對校正因子的影響，結(jié)果見表6，可知均無明顯影響（RSD＜5%）。

表6 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.6 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.13 色譜峰定位 對各成分色譜峰進(jìn)行定位時(shí)，主要采用相對保留時(shí)間定位法或保留時(shí)間差值定位法［15-17］。以巖白菜素為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他3 種成分相對保留時(shí)間（ti／s）、保留時(shí)間差（Δti／s），結(jié)果見表7～8。由此可知，三葉豆紫檀苷、馬卡因ti／s、Δti／s的RSD 均小于5%，但苦參堿兩者RSD 均大于5%，故采用對照品定位。2.14 樣品含量測定 取10 批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法、一測多評法計(jì)算含量，結(jié)果見表9。由此可知，2 種方法所得結(jié)果相近（相對誤差＜3%），表明一測多評法可用于含量測定。

表7 各成分相對保留時(shí)間Tab.7 Relative retention time of various constituents

表8 各成分保留時(shí)間差Tab.8 Retention time differences of various constituents

表9 各成分含量測定結(jié)果（mg／mL）Tab.9 Results of content determination of various constituents（mg／mL）

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1% 磷酸、甲醇-0.25% 磷酸、乙腈-0.25%磷酸，發(fā)現(xiàn)磷酸體積分?jǐn)?shù)對分離效果無明顯差異，以檢測成分較多、色譜峰分離效果較好為指標(biāo)，同時(shí)為了抑制峰拖尾加入三乙胺，最終確定流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸（三乙胺調(diào)pH 至5.0）。

3.2 柱溫、體積流量選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了不同柱溫（25、30、35 ℃）、體積流量（0.8、1.0、1.2 mL／min）對色譜峰的分離情況，以各成分色譜峰的分離效果為指標(biāo)，最終確定柱溫為35 ℃，體積流量為0.8 mL／min。

3.3 檢測波長選擇 本實(shí)驗(yàn)采用DAD 檢測器對各成分進(jìn)行全波長掃描（190～400 nm），發(fā)現(xiàn)苦參堿、巖白菜素分別在220、275 nm處，三葉豆紫檀苷、馬卡因在300 nm 處吸收較好，并與附近色譜峰分離情況理想，故選擇三者作為檢測波長。

3.4 內(nèi)標(biāo)選擇 綜合考慮含量、色譜峰峰面積和保留時(shí)間、價(jià)格、易得程度，本實(shí)驗(yàn)選擇巖白菜素作為內(nèi)標(biāo)［18］。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立一測多評法同時(shí)測定開喉劍噴霧劑（兒童型）中巖白菜素、苦參堿、三葉豆紫檀苷、馬卡因的含量，所得結(jié)果與外標(biāo)法無明顯差異，表明該方法穩(wěn)定可靠，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考依據(jù)，并對保證其質(zhì)量和療效具有重要意義。