何昕孺 ，王玉靜，李妍穎，張 波，黃 婷，尹 躍，段淋淵，秦 墾，戴國(guó)禮

(國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心/寧夏農(nóng)林科學(xué)院 枸杞科學(xué)研究所，銀川 750002)

枸杞是“藥食兩用”植物資源，具有巨大的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著人們對(duì)枸杞營(yíng)養(yǎng)保健功效的不斷認(rèn)識(shí)和認(rèn)可，枸杞的市場(chǎng)需求日益旺盛[1]。枸杞種質(zhì)資源雖種類豐富，但因遺傳背景不清楚，制約了種質(zhì)資源深度挖掘與新品種選育，目前生產(chǎn)中的主栽品種優(yōu)良性狀退化，產(chǎn)量低，新品種少且推廣速度緩慢，已不能滿足產(chǎn)業(yè)多樣化的發(fā)展需求[2]。光合能力和效率的改善是提高作物產(chǎn)量的主要途徑。因此高光效種質(zhì)的篩選是挖掘光合增產(chǎn)潛力，高光效育種的基礎(chǔ)和前提[3-4]。在水稻、大豆等作物上已有高光效種質(zhì)篩選及選育的大量研究[5-9]，屠層平等[10-11]在水稻高光效育種中的研究認(rèn)為，單葉凈光合速率、葉面積指數(shù)、高效光合持續(xù)期是實(shí)現(xiàn)高光合生產(chǎn)力的重要光合特性。有研究表明[12-16]多年在大豆高光效育種中選育出在光合特性、光合勢(shì)、單株葉面積、RUBP羧化酶和光合產(chǎn)物的積累有較大遺傳改進(jìn)的高光效種質(zhì)，認(rèn)為單葉光合速率是高光效育種的重要指標(biāo)之一，同時(shí)結(jié)合育種目標(biāo)應(yīng)具有較大的光能截獲能力、光能高速傳遞能力、高光能轉(zhuǎn)化效率、高光合速率和高RUBP羧化酶、光合產(chǎn)物在籽粒中高比例分配、高光合持續(xù)期等綜合水平。牛寧等[17]對(duì)150份大豆光合特性的評(píng)價(jià)認(rèn)為高光效大豆應(yīng)具有高氣孔導(dǎo)度、高水分利用率和高光合效率等特性。張華等[18]利用主成分分析、聚類分析、判別分析相結(jié)合的方法研究152份甘蔗光合特性，認(rèn)為凈光合速率、蒸騰速率和水分利用效率結(jié)合較好的品種可應(yīng)用于光合生理育種。張耀文等[19]在油菜高光效育種研究中認(rèn)為高光效種質(zhì)篩選指標(biāo)應(yīng)從光合氣體交換參數(shù)、光合生理結(jié)構(gòu)等光合能力，單株、群體等株型、產(chǎn)量結(jié)構(gòu)，抗病、蟲(chóng)等抗性能力及品質(zhì)性狀等方面綜合評(píng)價(jià)、量化比較。目前枸杞種質(zhì)資源的挖掘及品種選育主要以多糖、單果質(zhì)量、抗性、果實(shí)大小等為目標(biāo)性狀，枸杞光合特性的研究以環(huán)境因子、水分、肥料、鹽堿脅迫等對(duì)光合氣體參數(shù)的影響為主[20]，種質(zhì)間光合特性的研究較少[21-24]。因此，篩選枸杞光合能力評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立有效的綜合評(píng)價(jià)方法，可以為枸杞新品種選育提供理論支撐。本研究連續(xù)2年對(duì)76份枸杞材料的葉片光合氣體交換參數(shù)和葉片物理性狀進(jìn)行調(diào)查，評(píng)價(jià)枸杞種質(zhì)資源的光合能力，篩選出高光效材料，對(duì)推進(jìn)枸杞育種和產(chǎn)量提升有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以寧夏銀川市蘆花臺(tái)寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞種質(zhì)資源圃的76份材料為供試材料(表1)。

表1 供試枸杞材料的編號(hào)及名稱Table 1 Code and name of tested wolfberry

1.2 測(cè)定方法

2019-2020年于枸杞春梢現(xiàn)蕾期進(jìn)行田間標(biāo)樣，標(biāo)樣要求參照[25]，1 a生果實(shí)成熟初期測(cè)定光合參數(shù)及葉片形態(tài)指標(biāo)。

1.2.1 光合參數(shù)測(cè)定 利用德國(guó)GFS-3000便攜式光合儀分別于2019年、2020年6-7月，選擇晴朗天氣的上午9:00-12:00測(cè)定葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)參數(shù)，葉片瞬時(shí)水分利用效率(WUE)=Pn/Tr。測(cè)定時(shí)設(shè)置氣體流速750 μmol·s-1，氣體混勻器的風(fēng)扇速度為7，葉室溫度為30 ℃，相對(duì)濕度為60%，利用外置光源將PAR設(shè)定為1 500 μmol·m-2·s-1，每份材料測(cè)3個(gè)葉片。

1.2.2 葉片形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 測(cè)定光合參數(shù)的同時(shí)，采集與其相對(duì)應(yīng)的葉片，利用Uniscan M1紫光掃描儀測(cè)定葉面積，電子分析天平稱量葉鮮質(zhì)量，在70 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱葉干質(zhì)量，比葉重=葉干質(zhì)量/葉面積。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用SPSS 21進(jìn)行方差分析、相關(guān)性分析、主成分分析、聚類分析、判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞光合氣體交換參數(shù)及葉片形態(tài)指標(biāo)的 差異

由表2可得知，2 a中2019年枸杞葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、葉面積、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量、比葉重的變異系數(shù)高，在2020年水分利用率的變異系數(shù)高。結(jié)合2 a的數(shù)據(jù)看氣孔導(dǎo)度、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量、比葉重、葉面積的變異系數(shù)大，為46.3%～57.6%，胞間CO2濃度、水分利用率的變異系數(shù)小，在10.9%～27.4%。品種(系)間凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、水分利用率、葉面積、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量均存在極顯著差異(P<0.01)，比葉重存在顯著差異(P<0.05)；年份間凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、水分利用率、葉面積、葉干質(zhì)量、比葉重均存在極顯著差異(P<0.01)，葉鮮質(zhì)量不存在顯著差異；品種與年份互作效應(yīng)對(duì)各指標(biāo)均達(dá)到極顯著水平 (P<0.01)。

表2 枸杞光合參數(shù)及葉片形態(tài)指標(biāo)的差異Table 2 Difference of photosynthetic parameter and leaf morphological index of wolfberry

2.2 葉片光合氣體交換參數(shù)及形態(tài)特征指標(biāo)的相關(guān)性分析

如表3所示，各指標(biāo)呈現(xiàn)不同程度的相關(guān)性。凈光合速率與氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、葉面積、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)；氣孔導(dǎo)度與胞間CO2濃度、蒸騰速率、葉面積、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)；胞間CO2濃度與蒸騰速率呈極顯著正相關(guān)，與水分利用率呈極顯著負(fù)相關(guān)；蒸騰速率與葉面積、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)；葉面積與葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)；葉鮮質(zhì)量與葉干質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)；葉干質(zhì)量與比葉重呈極顯著正相關(guān)。

2.3 高光效綜合指標(biāo)的篩選

采用主成分分析的結(jié)果見(jiàn)表4，前3個(gè)因子的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)86.88%，能夠代表9項(xiàng)指標(biāo)的大部分信息。9項(xiàng)指標(biāo)可分為葉片的光合性狀指標(biāo)和物理性狀指標(biāo)，其中因子1解釋的指標(biāo)為凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、葉面積、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量；因子2解釋的指標(biāo)為胞間CO2濃度、水分利用率，因子3解釋的指標(biāo)為比葉重。光合性狀指標(biāo)中水分利用率為凈光合速率與蒸騰速率的推導(dǎo)指標(biāo)，水分利用率與胞間CO2濃度呈極顯著相關(guān)(R=-0.774)，且胞間CO2濃度的權(quán)重高于水分利用率；物理性狀指標(biāo)中葉干質(zhì)量與葉面積、葉鮮質(zhì)量、比葉重呈極顯著相關(guān)(R= 0.893、0.846、0.320)，且權(quán)重最低。因此，選用凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、葉面積、葉鮮質(zhì)量、比葉重7項(xiàng)指標(biāo)作為枸杞高光效的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表4 各項(xiàng)指標(biāo)旋轉(zhuǎn)后的因子載荷值Table 4 Factor loading value after rotation of each index

根據(jù)主成分分析中各指標(biāo)的貢獻(xiàn)程度，構(gòu)造出枸杞高光效評(píng)價(jià)指標(biāo)的判斷矩陣(表5)。各層單排序一致性檢驗(yàn)結(jié)果CR分別為0、0.028 3、 0.046 2，層次總排序的一致性檢驗(yàn)結(jié)果CR為 0.035 1，均小于0.1(表6)，因此認(rèn)為層次總排序具有滿意的一致性，蒸騰速率、比葉重、葉鮮質(zhì)量、氣孔導(dǎo)度、葉面積、凈光合速率、胞間CO2濃度的權(quán)重值依次為0.2389、0.2063、0.1637、0.1468、0.129 9、0.089 6、0.024 6(表7)?？梢?jiàn)蒸騰速率、比葉重對(duì)枸杞高光效特性的貢獻(xiàn)最大，其次是葉鮮質(zhì)量、氣孔導(dǎo)度、葉面積，而凈光合速率、胞間CO2濃度的影響較小。

表5 枸杞光合能力評(píng)價(jià)因子的分層結(jié)構(gòu)Table 5 Layed structure of evaluation factors for photosynthetic capacity

表6 層次結(jié)構(gòu)的判斷矩陣及一致性檢驗(yàn)Table 6 Judgement matrix and its consisitency check of layed structure

2.4 枸杞光合能力的綜合評(píng)價(jià)

利用篩選出的指標(biāo)對(duì)枸杞種質(zhì)進(jìn)行K-均值聚類分析(表8)，將76份枸杞材料分為三大類，第I大類包括‘16-1-3-5’‘14-26-6’‘14-87’等6個(gè)枸杞品種(系)，該類群的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、葉面積、葉鮮質(zhì)量低，比葉重高；第II大類包括‘寧杞1號(hào)’‘大麻葉’‘寧杞5號(hào)’等51個(gè)枸杞品種(系)，該類群的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、葉面積、葉鮮質(zhì)量中等，比葉重低； 第III大類包括‘Z44’‘14-2-3-20’‘13-19’等19個(gè)枸杞品種(系)，該類群的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、葉面積、葉鮮質(zhì)量高，比葉重中等。

表7 指標(biāo)層對(duì)目標(biāo)層的權(quán)重值Table 7 Weight value of evaluation factors

表8 不同品種(系)枸杞的聚類結(jié)果Table 8 Clustering results of different varieties of wolfberry

為檢驗(yàn)聚類結(jié)果是否可靠，利用聚類結(jié)果進(jìn)行逐步判別分析，有3個(gè)變量最終引入判別函數(shù)，剔除了4個(gè)變量，得到判別函數(shù)如下：

Y1=-2.971+0.010X1+7.146X2- 12.624X3

Y2=-8.467+0.002X1+0.933X2+ 40.901X3

其中X1、X2、X3分別代表氣孔導(dǎo)度、比葉重、葉鮮質(zhì)量。根據(jù)判別函數(shù)對(duì)聚類結(jié)果重新進(jìn)行分類，結(jié)果只有1個(gè)品種被誤判，‘寧杞7號(hào)’由原來(lái)的3類誤判為2類，總誤判率為1.32%，判對(duì)的概率為98.68%。從圖1也可得出，判別函數(shù)可將3個(gè)類群明顯地區(qū)分開(kāi)。聚類分析與判別分析的結(jié)果比較一致，因此認(rèn)為對(duì)76份枸杞材料的分類結(jié)果是可靠的。

3 討 論

光合作用是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過(guò)程，植物光合性狀的差異與其自身的遺傳特性、植物學(xué)特征及外界生理生態(tài)環(huán)境的影響有關(guān)[26]。高光效育種研究最初是以理想株型指標(biāo)為種質(zhì)篩選的重要依據(jù)，隨著研究的深入，逐步將光合氣體交換參數(shù)、光合酶含量等光合功能的相關(guān)生理指標(biāo)作為高光效篩選的指標(biāo)[4]。有研究表明，光合速率是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的遺傳性狀[27-28],比葉重是反映葉片質(zhì)量，衡量植物相對(duì)生長(zhǎng)速率的重要參數(shù)，與葉綠素含量、光合功能等相關(guān)聯(lián)[29-32]。本試驗(yàn)中品種和年份對(duì)枸杞光合氣體交換參數(shù)及葉片形態(tài)指標(biāo)有一定的影響，方差分析表明品種因素對(duì)凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、葉面積等9個(gè)指標(biāo)的影響顯著，年際因素對(duì)除了葉鮮質(zhì)量外的8個(gè)指標(biāo)影響顯著。

圖1 不同類群枸杞的典型判別得分圖Fig.1 Scatter plot of canonical discriminant scores of different groups of wolfberry

近年來(lái)，針對(duì)不同作物某一性狀的評(píng)價(jià)主要采用多個(gè)指標(biāo)、多種統(tǒng)計(jì)方法相結(jié)合的方式進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，從而更加全面地反映某一性狀的差異，同時(shí)也能篩選出與該性狀相關(guān)的生長(zhǎng)及生理生化指標(biāo)[33-34]。常用評(píng)價(jià)方法中主成分分析法是能在較多的性狀指標(biāo)中篩選出重點(diǎn)指標(biāo)，但如果單用主成分分析法，數(shù)據(jù)可能會(huì)出現(xiàn)主要信息丟失和不重要指標(biāo)凸顯的現(xiàn)象[35]。而層次分析法是采用定性與定量相結(jié)合的方法, 可以較好地解決指標(biāo)相互關(guān)聯(lián)的問(wèn)題，在植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和品種篩選中已廣泛應(yīng)用[36]。但層次分析法的評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重的確定帶有一定的主觀性,不同人所構(gòu)造的判斷矩陣可能會(huì)有一定差異。因此將主成分分析法和層次分析法結(jié)合起來(lái)應(yīng)用，可將評(píng)價(jià)問(wèn)題做的更科學(xué)、合理[37]。本試驗(yàn)以國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心收集與創(chuàng)制的優(yōu)良品系為試材，對(duì)枸杞的光合氣體交換參數(shù)和葉片物理性狀參數(shù)共9個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，提取到3個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)86.88%，具有代表性，結(jié)合相關(guān)性分析最終篩選出凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、葉面積、葉鮮質(zhì)量、比葉重作為枸杞高光效的評(píng)價(jià)指標(biāo)，運(yùn)用層級(jí)分析法對(duì)主成分分析法確定指標(biāo)權(quán)重的計(jì)算及排序，其中權(quán)重值最大的指標(biāo)是蒸騰速率、比葉重，其次是葉鮮質(zhì)量、氣孔導(dǎo)度、葉面積，而凈光合速率、胞間CO2濃度的最小，得出的結(jié)果滿足一致性。在此基礎(chǔ)上，對(duì)參試材料進(jìn)行了聚類分析，并利用判別函數(shù)對(duì)聚類結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

本試驗(yàn)通過(guò)聚類分析將76份材料分為3類型，其中有6個(gè)為第Ⅰ類型(低光效)，占供試材料的7.9%，有51個(gè)為第Ⅱ類型(中等光效)，占供試材料的67.1%，有19個(gè)為第Ⅲ類型(高光效型)，占供試材料的25%，高光效類群的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、葉面積、葉鮮質(zhì)量均顯著高于低光效類群與中等光效的類群。結(jié)合大豆水稻[38]等作物的高光效育種實(shí)踐，本試驗(yàn)僅以光合氣體交換參數(shù)和葉片物理性狀等指標(biāo)建立的枸杞高光效評(píng)價(jià)方法, 缺乏光合作用中關(guān)鍵酶、群體光合、產(chǎn)量等指標(biāo)的驗(yàn)證。筆者認(rèn)為通過(guò)本文建立的方法雖不能夠完全真實(shí)可靠的評(píng)價(jià)枸杞種質(zhì)的光合能力，但可以作為枸杞高光效種質(zhì)的初篩依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究調(diào)查的76份枸杞種質(zhì)在光合氣體交換參數(shù)與葉片物理性狀指標(biāo)上表現(xiàn)出較大差異；綜合相關(guān)性分析與主成分分析，篩選出凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、葉面積、葉鮮質(zhì)量、比葉重可作為枸杞高光效的評(píng)價(jià)指標(biāo)；聚類分析將76份材料分為3個(gè)類群，其中6個(gè)低光效型，51個(gè)中等光效型，19個(gè)高光效型。本研究建立的枸杞高光效評(píng)價(jià)方法可為枸杞品種選育提供參考依據(jù)。