王鑫，李浩楠，鄭麗婷，雷嗣超，涂芬，董錫鵬，楊芳

（武漢工程大學環(huán)境生態(tài)與生物工程學院，湖北武漢 430205）

板栗（Castanea mollissimaBlume）屬于殼斗科栗屬堅果類植物[1]。從2011 年起，我國板栗種植面積穩(wěn)居世界首位，產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的60%[2]。作為板栗食品加工的副產(chǎn)物，板栗殼一般作為燃料或直接丟棄，造成資源的浪費。板栗殼中含有色素、有機酸、多酚類、多糖（或苷類）和鞣質等化學成分[3]，其中含有的具有抗氧化活性成分原花青素（Procyanidins，PC）含量為40.23 mg/g[4]。原花青素具有較強的清除自由基和抗氧化、改善心血管疾病、抗癌、抗輻射和抗病毒等[5-8]生物活性。

PC 在體內消化過程中，容易受到消化液酸堿度、熱、過渡金屬離子、單線態(tài)氧以及自由基等的影響而降低其結構穩(wěn)定性和生物活性[5]；而將其負載于納米載體中，可提高其生物利用率。在常用納米材料中，介孔二氧化硅納米顆粒具有高穩(wěn)定、比表面積大、孔徑和孔道均可調節(jié)、易于修飾的內外表面以及良好的生物相容等特點[6]，作為藥物載運和可控釋放材料，廣泛應用于生物醫(yī)藥領域，尤其是在藥物緩釋方面發(fā)揮著越來越重要的作用[7]。然而，目前這些納米載藥系統(tǒng)面臨著結構和工藝復雜等難題，載體的特性與結構對負載效果影響較大，需要針對不同被負載物進行研究，才能滿足“安全、有效和質量可控”的三大原則[8]。本文在提取板栗殼PC 的基礎上，將其負載于介孔二氧化硅顆粒中，并對負載工藝進行優(yōu)化，為提高PC 生物利用率提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗2019 年秋產(chǎn)自湖北省羅田縣，選擇成熟、新鮮、未破損的板栗，將人工剝除的板栗殼放入保鮮袋內，封口后低溫保存。兒茶素標準品（C114051），購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；香蘭素、無水乙醇、無水甲醇、濃硫酸等，分析純，購于國藥集團公司。

1.2 儀器與設備

V-5100 可見分光光度計、TG16-WS 臺式高速離心機，上海元析儀器有限公司；高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-D3 循環(huán)水式多用真空泵，河南省予華儀器有限責任公司；旋轉蒸發(fā)器（RE-2000A），上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 板栗殼PC 的提取

將板栗殼洗凈并干燥，粉碎后過60 目篩。采用1:15（g/mL）料液比，70%乙醇-水混合溶劑浸提板栗殼PC[9]，將提取液真空抽濾，并在40 ℃條件下真空濃縮，冷凍干燥，稱量質量，在低溫下保存，備用。

1.3.2 板栗殼提取物PC 含量的測定

（1）標準曲線

分別配制0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 兒茶素標準品溶液，采用硫酸-香草醛比色法[10]，得到PC 的質量濃度X和吸光度Y的標準回歸方程：Y=1.485X-0.001 6，R2=0.9995 mg/mL。

（2）板栗殼提取物PC 含量的測定

稱量板栗殼粗提物凍干粉，配制成一定濃度的樣品溶液，采用硫酸-香草醛比色法，將吸光度值代入上述標準回歸方程中，得到PC 的質量濃度，根據(jù)式（1）計算PC含量。

式中，c為板栗殼提取物PC 質量濃度，mg/mL；V為定容的試樣體積，mL；m為稱取的板栗殼提取物質量，g；N 為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 MSNs 載體的制備

采用氣溶膠法制備MSNs[11]。通過氮氣發(fā)生器將空氣壓縮、冷凍干燥制備氮氣。稱取4.0 g 四乙氧基硅烷（teraethoxysilance，CTAB）依次加入1.12 g、1 mol/L 鹽酸溶液、22.8 g 無水乙醇、56 g 蒸餾水、10.4 g 十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium brmide，TEOS）、4.0 g NH4Cl，攪拌均勻，得到前驅體溶液。用霧化器將配制好的前驅體溶液以氮氣作為載體生成氣溶膠液滴，于管式爐中400 ℃凝固，得到白色的顆粒。將白色顆粒在500 ℃、煅燒5 h 除去CTAB 和NH4Cl，得到MSNs 載體。

1.3.4 MSNs 的透射電子顯微鏡（TEM）分析

采用TEM 對MSNs 的孔道結構及孔徑進行分析[12]，將MSNs 用無水乙醇溶解后，采用超聲波進行分散，將樣品溶液沉積到鍍有碳膜的銅網(wǎng)上，于45 ℃干燥2 h 后進行抽真空處理，在加速電壓200 kV 下觀察。

1.3.5 MSNs 負載板栗殼PC 的單因素試驗

（1）PC 濃度對負載率的影響

稱取0.005 g MSNs 于1.5 mL 離心管中，加入1 mL濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL 的PC 溶液。對該體系進行變溫交替處理，即在30 ℃和4 ℃分別交替處理0.5 h。樣品于30 ℃處理0.5 h，記為1 次變溫處理，再于4 ℃處理0.5 h，此為2 次變溫處理，取出后于30 ℃處理0.5 h，為3 次變溫處理。本試驗變溫交替處理次數(shù)為3 次。變溫交替處理完成后以8 000 r/min 轉速離心15 min，收集上清液，采用硫酸-香草醛法測量上清液的吸光度值，根據(jù)公式（2）計算負載率?？瞻捉M為不加MSNs，其余同上。

式中，A1為上清液在500 nm 處的吸光度值，A0為空白組上清液在500 nm 處的吸光度值。

（2）MSNs 添加量對負載率的影響

分別稱取0.001、0.003、0.005、0.007、0.009、0.011、0.013、0.015 g MSNs 于1.5 mL 離心管中，加入1 mL、1.0 mg/mL 的PC 溶液。對該體系進行變溫交替處理3 次后，參考（1）方法測定負載率。

（3）變溫交替次數(shù)對負載率的影響

分別稱取0.005 g MSNs 于1.5 mL 離心管中，加入1 mL、為1.0 mg/mL 的PC 溶液。分別對該體系進行變溫交替處理1、2、3、4、5 次后，參考（1）方法測定負載率。

1.3.6 響應面法優(yōu)化MSNs 負載板栗殼PC 工藝

通過上述單因素試驗，選取PC 濃度、MSNs 添加量以及變溫交替次數(shù)這3 個因素，采用試驗設計軟件Design-Expert（Version 8.0.6），以PC 負載率為響應值，設計3 因素3 水平響應面優(yōu)化試驗，因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Coding table of factor are level

2 結果與分析

2.1 MSNs 顯微結構分析

氣溶膠法制備的MSNs 顆粒的TEM圖見圖1，結果顯示MSNs 顆粒大小均一，直徑大小約為300 nm，顆粒壁厚大約20 nm，中間有明顯介孔。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 PC 濃度對負載率的影響

采用1.3.2（2）方法測定出板栗殼提取物中PC 含量為2.58%±0.06%。PC 濃度對負載率的影響見圖2。由圖2 可知，在低濃度時，負載率隨PC 濃度的增高呈現(xiàn)先增高后曲折下降的趨勢，當PC 濃度為0.2 mg/mL 時，負載率達到最大值，為13.75%。

2.2.2 MSNs 添加量對負載率的影響

MSNs 添加量對負載率的影響見圖3。由圖3 可知，PC 負載率隨MSNs 添加量的增加而增加，當MSNs 添加量為0.005 g 時，PC 負載率最高，為13.6%。

2.2.3 變溫交替次數(shù)對負載率的影響

變溫交替次數(shù)對負載率的影響見圖4。由圖4 可知，負載率與變溫交替次數(shù)無明顯的線性關系，不同條件下所對應的負載率不同，在第3 組條件（變溫交替3 次）時，PC 負載率最高，為12.33%。

2.3 響應面試驗分析

2.3.1 響應面分析方案與響應值

分別固定PC 溶液濃度、MSNs 添加量和變溫交替次數(shù)三個因素的變化對PC 負載率的影響，將這三個因素設為變量，以PC 負載率為響應值，利用BBD 響應面原理設計試驗方案，進行負載率條件的優(yōu)化，響應面分析方案與響應值見表2。

2.3.2 回歸模型的方差分析

在回歸方程中，二次項系數(shù)為負，表明方程具有開口向下的拋物面，在對應因素的所選水平范圍內有極大值點，可以進行最優(yōu)分析。

表2 響應面試驗設計方案與響應值Table 2 Design plan and response value of response surface test

根據(jù)各項的回歸系數(shù)，以此建立PC 負載率與A、B、C 三個因素的二次因素回歸模型：PC 負載率/%=15.78+0.82A-0.67B-0.17C-1.28AB+0.14AC+0.28BC-4.29A2-1.3B2-1.7C2。從回歸模型的方差分析可知，在模型中F值是35.47，這說明模型有顯著性。從P<0.000 5 可知，模型是極顯著。方程的擬合度用模型的校正系數(shù)R2來表示，越高的R2值代表越好的方程擬合度。試驗的精確度用離散系數(shù)CV值來表示，越低的CV 值代表越高的試驗可靠性。該試驗的R2=0.978 5，CV=4.97%，這說明該模型能說明97.85%的試驗方程的擬合度。從表3（見下頁）可以看出，模型的一次項影響是A 極顯著，C 不顯著。從F值可以看出，單因素對負載率的影響順序是A＞B＞C，也就是PC 濃度>MSNs 添加量>變溫交替次數(shù)。交互項BC、AC 不顯著，BC 顯著。二次項均為極顯著。故可以得出選取的各影響因素是合理的，由此可知，這個模型可靠性較高。

2.3.3 響應面交互作用分析

根據(jù)回歸模型，將任一因素固定在零水平，可以得到體現(xiàn)另外2 個因素及交互作用影響的響應曲面圖如圖5所示。

由圖5（A）可以看出，隨著變溫交替次數(shù)和PC 濃度的增加，PC 負載率呈先增大后減小的趨勢，在響應面中心處時出現(xiàn)PC 負載率最大值。在圖5（B）中，隨著變溫交替次數(shù)和MSNs 質量的增加，PC 負載率呈先增大后減小的趨勢，在響應面中心處時出現(xiàn)PC 負載率最大值。在圖5（C）中，隨著PC 濃度和MSNs 質量的增加，PC 負載率呈先增大后減小的趨勢，在響應面中心處時達到PC 負載率最大值。

通過Design-Expert 響應面分析軟件進一步對試驗數(shù)據(jù)進行分析，篩選出3 個因素所選的水平范圍內的最佳PC 的負載率。得到最優(yōu)工藝條件，即PC 濃度0.21 mg/mL、MSNs 添加量0.004 g、變溫交替2.93 次。響應面模型預測在這個條件下PC 的負載率是15.96%?？紤]實際情況，對此進行修正后，確定最優(yōu)的負載工藝是PC 濃度0.3 mg/mL、MSNs 添加量為0.005 g、變溫交替3 次。

3 結論

以響應面法優(yōu)化MSNs 負載板栗殼PC 工藝，擬合了PC 濃度、MSNs 添加量以及變溫交替次數(shù)三個因素對負載率影響的回歸方程，分析認為各因素對負載率的影響大小順序為PC 濃度＞MSNs 添加量＞變溫交替次數(shù)。最佳工藝參數(shù)為PC 濃度0.3 mg/mL、MSNs 添加量0.005 g、變溫交替3 次，在此條件下PC 的負載率為15.96%，其R2=0.978 5，說明該試驗優(yōu)化得到的技術參數(shù)是可靠的。試驗得到的最佳PC-MSNs 復合體能為今后提高PC 生物利用率和在體內可控釋放研究提供參考依據(jù)。