李穎，李玉杰，于敏

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科一病區(qū)，鄭州4500000

鼻咽癌是一種起源于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，其在中國尤其是南方地區(qū)具有較高的發(fā)病率和病死率[1]。鼻咽癌發(fā)病隱匿且病情進(jìn)展迅速，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。目前，鼻咽癌患者尤其是晚期患者的治療效果不佳，多數(shù)患者易出現(xiàn)放療抵抗和局部復(fù)發(fā)[3]。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)對于改善鼻咽癌患者預(yù)后十分重要。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）是兩類與人類腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的非編碼RNA，lncRNA 能夠作為競爭性內(nèi)源性RNA 結(jié)合miRNA，還可以控制miRNA 靶基因的表達(dá)，調(diào)控其下游信號(hào)通路，從而影響腫瘤的發(fā)展[4-7]。ASB16 反義RNA1（ASB16 antisense RNA 1，ASB16-AS1）是一種lncRNA，與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。Fu 等[8]研究顯示，胃癌組織中ASB16-AS1 表達(dá)上調(diào)，其通過競爭性結(jié)合miRNA-3918 和miRNA-4676-3p 促進(jìn)E3 泛素化連接酶TRIM37 的表達(dá)，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖能力和干細(xì)胞特性，在胃癌中發(fā)揮致癌基因的作用。Tan 等[9]研究顯示，ASB16-AS1 在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，干擾其表達(dá)可通過阻斷WNT/β-連環(huán)素（β-catenin）信號(hào)通路減弱NSCLC 細(xì)胞的增殖和菌落形成，并使G0/G1期細(xì)胞周期停滯，加速細(xì)胞凋亡。但目前關(guān)于ASB16-AS1 在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚不清楚。在線軟件預(yù)測顯示，ASB16-AS1可能與miRNA-363-5p具有靶向調(diào)控關(guān)系。本研究探討ASB16-AS1 在鼻咽癌組織中的表達(dá)及對鼻咽癌細(xì)胞C666-1 增殖和凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年5 月至2020 年12 月于鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診為鼻咽癌且具有完整病理資料的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查確診為鼻咽癌；未接受放化療；未合并其他惡性腫瘤；依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并自身免疫性疾??；合并肝、腎等器質(zhì)性病變。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入33 例患者。取患者的鼻咽癌組織和對應(yīng)的癌旁組織，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞和試劑

胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，鼻咽癌細(xì)胞系C666-1 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RPMI1640 培養(yǎng)基、CCK8 試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒均購自深圳晶美生物工程有限公司，兔抗人Ki-67、cleaved caspase 3、pro-caspase 3、磷酸甘油醛脫氫酶（phosphoglyceraldehyde dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司，LipofectamineTM2000 試 劑盒、Trizol 試 劑 均購 自美 國Invitrogen 公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、雙熒光素酶檢測試劑盒、凋亡試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PCR 引物、ASB16-AS1的小干擾RNA（si-ASB16-AS1）、miRNA-363-5p 模擬物（mimcs）與各自的對照序列anti-miRNA-NC、si-NC、miRNA-363-5p 抑制劑（anti-miRNA-363-5p）、miRNA-NC 均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測ASB16-AS1 和miRNA-363-5p 表達(dá) 應(yīng)用Trizol提取組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系：5×DNA loading buffer 2 μl，10×King RT buffer 2 μl，F(xiàn)astKing RT 酶1 μl，F(xiàn)Q-RT 引物2 μl，RNA 2 μg，無RNase ddH2O 補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：42 ℃15 min，95 ℃3 min。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μl，MgSO42.5 μl，dNTP 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，無RNase ddH2O 補(bǔ)足體系至25 μl；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性60 s，60 ℃退 火30 s，72 ℃延 伸30 s，共40 個(gè) 循 環(huán)。ASB16- AS1 上游引物5'- CTCATGTAGCCTGGACCTCC- 3'，下 游 引 物5'- TCACACCTGTAATCCCAGCA-3'；miRNA-363-5p 上 游引 物5'-GTGTCCCGTAAGCTGATC-3'，下游引物5'-CACGGTCACGTTGTCACAAG-3'；GAPDH上游引物5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，下游引物5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG- 3'；U6上 游 引 物5'-GAGCCAAGGAATCAACCTTTGAAG-3'，下 游 引物5'-GATCGTAGTCCAGGAGCAACTGAG-3'。以GAPDH、U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算ASB16-AS1、miRNA-363-5p 的相對表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組轉(zhuǎn)染 以含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)C666-1 細(xì)胞。于6 孔板中接種對數(shù)期C666-1 細(xì)胞，采用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體，將si-ASB16-AS1（si-ASB16-AS1 組）、si-NC（si-NC 組）、si-ASB16-AS1+anti-miRNA-363-5p（si-ASB16-AS1+anti-miRNA-363-5p 組）、si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC（si-ASB16-AS1+antimiRNA-NC 組）轉(zhuǎn)染至C666-1 細(xì)胞，并培養(yǎng)24 h。

1.3.3 CCK8 法檢測細(xì)胞增殖 于96 孔板中接種各組細(xì)胞，培養(yǎng)24、48、72 h，加入CCK8 試劑10 μl孵育2 h，酶標(biāo)儀測定光密度（optical density，OD）值，檢測波長為450 nm。

1.3.4 克隆形成實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞接種于6 孔板中（500/孔），置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)直至出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆團(tuán)，隨后棄培養(yǎng)基，并加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，按照每孔500 μl 的密度將甲醇加入其中，-20 ℃固定20 min，棄甲醇后按照每孔400 μl的密度將1%結(jié)晶紫染色液加入其中，室溫下染色15 min，采用蒸餾水洗滌后晾干，拍照并觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞。加入預(yù)冷的PBS 洗滌后棄上清，將500 μl binding buffer 加入細(xì)胞沉淀中重懸細(xì)胞，分別將5 μl膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）與5 μl 碘化丙啶（propidium iodide，PI）加入懸浮細(xì)胞中，充分混勻后室溫避光孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法檢測蛋白濃度，然后加入5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）上樣緩沖液，將其置于沸水中煮10 min 使蛋白變性，按照每孔20 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜后室溫封閉2 h，加入Ki-67（1∶1000）、cleaved caspase 3（1∶800）和pro-caspase 3（1∶800），置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育24 h，使用TBST 洗滌后加入山羊抗兔二抗（1∶3000），室溫條件下孵育1 h，滴加電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）工作液，于暗室下曝光顯影、定影，采用Quantity One 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 應(yīng)用PCR 法擴(kuò)增含miRNA-363-5p 結(jié)合位點(diǎn)的ASB16-AS1 的3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）序列，并利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變，插入熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-promoter，構(gòu)建ASB16-AS1野生型質(zhì)粒（WT-ASB16-AS1）和ASB16-AS1 突變型質(zhì)粒（MUT-ASB16-AS1）。分別將WT-ASB16-AS1、MUT-ASB16-AS1 與miRNA-363-5p mimic 或miRNA-NC 共轉(zhuǎn)染至C666-1 細(xì)胞，培養(yǎng)1 天后，檢測熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；采用Pearson 相關(guān)分析法分析鼻咽癌組織中ASB16-AS1 和miRNA-363-5p 表達(dá)的相關(guān)性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌組織中ASB16-AS1 和miRNA-363-5p表達(dá)情況的比較

鼻咽癌組織中ASB16-AS1 相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織，miRNA-363-5p 相對表達(dá)量明顯低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中ASB16-AS1 與miRNA-363-5p 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.992，P＜0.05）。

表1 鼻咽癌組織和癌旁組織中ASB16-AS1、miRNA-363-5p 相對表達(dá)量的比較（±s）

表1 鼻咽癌組織和癌旁組織中ASB16-AS1、miRNA-363-5p 相對表達(dá)量的比較（±s）

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2.2 C666-1 細(xì)胞增殖情況的比較

si-ASB16-AS1 組C666-1 細(xì)胞的ASB16-AS1 相對表達(dá)量為（0.31±0.02），明顯低于si-NC 組的（0.99±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=26.336，P＜0.01），表明si-ASB16-AS1 轉(zhuǎn)染成功。si-ASB16-AS1組C666-1細(xì)胞的miRNA-363-5p相對表達(dá)量高于si-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。si-ASB16-AS1組C666-1細(xì)胞的OD值（48、72 h）、克隆形成數(shù)及Ki-67蛋白相對表達(dá)量均低于si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。si-ASB16-AS1+antimiRNA-363-5p 組C666-1 細(xì) 胞 的miRNA-363-5p 相對表達(dá)量低于si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC 組，OD 值（48、72 h）、克隆形成數(shù)及Ki-67 蛋白相對表達(dá)量均高于si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。si-ASB16-AS1 組和si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC 組C666-1 細(xì) 胞 的miRNA-363-5p相對表達(dá)量、OD值（24、48、72 h）、克隆形成數(shù)及Ki-67 蛋白相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2、圖1、圖2）。

圖1 不同組別C666-1細(xì)胞的克隆形成情況

圖2 Western blot檢測不同組別C666-1細(xì)胞中Ki-67蛋白表達(dá)情況

表2 不同組別C666-1 細(xì)胞miRNA-363-5p 相對表達(dá)量、OD 值、克隆形成數(shù)及Ki-67 蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

表2 不同組別C666-1 細(xì)胞miRNA-363-5p 相對表達(dá)量、OD 值、克隆形成數(shù)及Ki-67 蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

注：a與si-NC組比較，P＜0.05；b與si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC組比較，P＜0.05

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2.3 C666-1 細(xì)胞凋亡情況的比較

si- ASB16- AS1 組C666- 1 細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase 3 蛋白相對表達(dá)量均高于si-NC 組，pro-caspase 3 蛋白相對表達(dá)量低于si-NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。si-ASB16-AS1+antimiRNA-363-5p 組C666-1 細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase 3 蛋白相對表達(dá)均低于si-ASB16-AS1+antimiRNA-NC 組，pro-caspase 3 蛋白相對表達(dá)量高于si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。si-ASB16-AS1 組和si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC 組C666-1 細(xì)胞凋亡率、cleaved caspase 3、pro-caspase 3 相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3、圖3、圖4）

圖3 不同組別C666-1細(xì)胞的凋亡情況

圖4 Western blot檢測不同組別C666-1細(xì)胞中cleaved caspase 3、pro-caspase 3蛋白表達(dá)情況

表3 不同組別C666-1細(xì)胞凋亡率及cleaved caspase 3、procaspase 3蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

表3 不同組別C666-1細(xì)胞凋亡率及cleaved caspase 3、procaspase 3蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

注：a與si-NC組比較，P＜0.05；b與si-ASB16-AS1+anti-miRNA-NC組比較，P＜0.05

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2.4 ASB16-AS1 靶向調(diào)控miRNA-363-5p 表達(dá)

ASB16-AS1 與miRNA-363-5p 的結(jié)合位點(diǎn)見圖5。共 轉(zhuǎn) 染W(wǎng)T-ASB16-AS1 的miRNA-363-5p 組C666-1 細(xì)胞熒光素酶活性明顯低于miRNA-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＜0.01）；共轉(zhuǎn)染MUTASB16-AS1 的miRNA-363-5p 組 與miRNA-NC 組C666-1 細(xì)胞熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。

表4 不同組別C666-1 細(xì)胞熒光素酶活性的比較（±s）

表4 不同組別C666-1 細(xì)胞熒光素酶活性的比較（±s）

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圖5 ASB16-AS1與miRNA-363-5p基因序列的結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，受多種基因調(diào)控，探討鼻咽癌相關(guān)基因及其作用機(jī)制可以為鼻咽癌的治療提供分子靶點(diǎn)。研究表明，GNAS-AS1[10]、LINC01385[11]和SNHG7[12]等多種lncRNA 在鼻咽癌組織中表達(dá)升高，能夠促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展，而HCG11[13]、CASC2[14]等lncRNA在鼻咽癌組織中低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因的作用。ASB16-AS1 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，其在骨肉瘤[15]、宮頸癌[16]和肝癌[17]等惡性腫瘤中表達(dá)水平均升高，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，然而ASB16-AS1 對鼻咽癌的作用還未知。

本研究采用qRT-PCR 法檢測鼻咽癌組織中ASB16-AS1 的表達(dá)，結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中ASB16-AS1 相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織，提示ASB16-AS1 在鼻咽癌中發(fā)揮促癌作用。細(xì)胞異常增殖和凋亡率下降均是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。Ki-67 與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)，是細(xì)胞增殖標(biāo)志物蛋白；caspase 是細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，caspase 3 是該通路的關(guān)鍵調(diào)控分子，其被激活后啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[18-19]。本研究探討了干擾ASB16-AS1對鼻咽癌C666-1 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示，干擾ASB16-AS1 可降低鼻咽癌C666-1 細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)及Ki-67 蛋白表達(dá)，提高鼻咽癌C666-1 細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase 3 蛋白表達(dá)，同時(shí)降低pro-caspase 3 蛋白表達(dá)，說明干擾ASB16-AS1 可有效抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，提示ASB16-AS1 有可能成為鼻咽癌治療的分子靶點(diǎn)。

為進(jìn)一步探究干擾ASB16-AS1 表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞的分子機(jī)制，本研究證實(shí)了ASB16-AS1 在細(xì)胞中靶向結(jié)合miRNA-363-5p 并負(fù)調(diào)控其表達(dá)，這與鼻咽癌組織中ASB16-AS1 與miRNA-363-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果一致。研究顯示，過表達(dá)miRNA-363-5p 可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖[20]；miRNA-363-5p 低表達(dá)與肝癌患者的總生存期更長有關(guān)，可能是肝癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物[21]；隨著膠質(zhì)瘤腫瘤級別的增高，miRNA-363-5p 表達(dá)水平逐漸上調(diào)[22]。本研究結(jié)果還顯示，同時(shí)干擾miRNA-363-5p 和ASB16-AS1 表達(dá)后，C666-1 細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于僅干擾ASB16-AS1 表達(dá)的細(xì)胞，而凋亡程度低于僅干擾ASB16-AS1 表達(dá)的細(xì)胞，提示干擾ASB16-AS1 可通過下調(diào)miRNA-363-5p 的表達(dá)控制鼻咽癌細(xì)胞增殖及凋亡。

綜上所述，鼻咽癌組織中ASB16-AS1 表達(dá)升高，而miRNA-363-5p 表達(dá)降低。ASB16-AS1 通過調(diào)控miRNA-363-5p 增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力，并抑制細(xì)胞凋亡。本研究尚存在不足之處，接下來將進(jìn)一步探究miRNA-363-5p 的靶基因及下游信號(hào)通路對鼻咽癌的影響，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ASB16-AS1/miRNA-363-5p 通路在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用。