黎鍵湧，劉 鵬，歐克緯，閻衛(wèi)清，凌 瑩，黃 威，金 剛，梁云濤，王麗萍，蔡中全*

(1.廣西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 崇左 530028； 2.廣西大學(xué)，廣西 南寧530004； 3.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001； 4.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530006)

0 引言

【研究意義】水稻是重要的糧食作物，也是生物研究的模式植物，水稻器官的紫色是花色素苷積累顯色的結(jié)果，是重要的標(biāo)記性狀，水稻紫色部位的花色苷等生物活性物質(zhì)含量高于其他部位[1-3]。由于葉舌紫色性狀是一種不受環(huán)境及其他生物指標(biāo)影響的表現(xiàn)型性狀，可作為標(biāo)記性狀應(yīng)用于輔助育種、品種鑒定、制種除雜和植物新品種權(quán)保護(hù)等方面。因此，探索水稻紫色性狀的遺傳模式、控制基因等，可為相關(guān)種質(zhì)資源以及基因的利用提供參考。【前人研究進(jìn)展】花色苷是花色素類物質(zhì)與糖類物質(zhì)結(jié)合而成，二者以糖苷鍵結(jié)合，而以花青素類物質(zhì)結(jié)合的花色苷，是水稻葉片等部位呈現(xiàn)紫紅色的主要物質(zhì)。NAGAO等[4]對(duì)水稻花色苷遺傳研究進(jìn)行總結(jié)，提出色素原基因C、酶激活及調(diào)節(jié)基因A與部位特異性基因P共同作用的遺傳模式。目前關(guān)于水稻花青素CAP遺傳系統(tǒng)的研究中，對(duì)于相關(guān)控制基因的位置已有多個(gè)成果。HU等[5]利用玉米花色苷調(diào)節(jié)基因的cDNA為探針，在水稻cDNA文庫(kù)中篩選出與玉米花色苷調(diào)節(jié)基因同源的水稻花色苷調(diào)節(jié)控制基因Pb(Prp-b)以及Pa(Prp-a)，并將2個(gè)基因分別定位在第1與第4染色體上；CAUSSE等[6]通過(guò)研究水稻種皮顏色遺傳，再次成功將Pb與Pa基因成功定位于第1與第4染色體上，并確定2個(gè)基因的互補(bǔ)遺傳模式?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】水稻葉舌顏色是常用的重要標(biāo)記性狀，但其顏色決定機(jī)制尚未明確。鮮見(jiàn)前人對(duì)水稻紫色葉舌性狀決定基因的研究，開(kāi)展其遺傳分析和相關(guān)基因的定位研究，對(duì)揭示葉舌顏色決定機(jī)制具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以葉舌表現(xiàn)為綠色的日本晴與葉舌表現(xiàn)為紫色的WPB-1作為親本，通過(guò)系列雜交、自交與回交構(gòu)建BC1F4代群體，包含18個(gè)遺傳群體共計(jì)1 500株單株，通過(guò)表型統(tǒng)計(jì)與遺傳分析進(jìn)行遺傳模型的預(yù)測(cè)，并根據(jù)葉舌表型進(jìn)行分區(qū)采樣，采用GSR40K基因芯片技術(shù)，利用SNP標(biāo)記進(jìn)行基因檢測(cè)，篩選出存在差異的分子標(biāo)記位點(diǎn)以尋找目標(biāo)基因可能存在的區(qū)段。通過(guò)表型的統(tǒng)計(jì)以及對(duì)遺傳模型的預(yù)測(cè)，對(duì)水稻紫色葉舌性狀基因進(jìn)行初步的定位分析，為水稻紫色葉舌性狀的利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選用日本晴和WPB-1為親本進(jìn)行雜交，通過(guò)系列雜交構(gòu)建BC1F4群體。WPB-1為熱帶粳亞種水稻，該品種植株內(nèi)富含花色素，葉片邊緣、葉耳、葉舌、莖基部以及穎殼等部位呈紫黑色或紫紅色。

1.2 方法

1.2.1 遺傳群體構(gòu)建 2017年4月，在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻育種試驗(yàn)田種植親本日本晴和WPB-1(紫色葉舌)，6月對(duì)親本進(jìn)行雜交，同年晚稻種植F1代。2018年早稻種植F2代，選取紫色葉舌單株與日本晴進(jìn)行回交，同年晚稻種植回交種子獲得BC1F1。2019年早稻種植BC1F2代群體，晚稻種植BC1F3。2020年早稻種植BC1F4株系34個(gè)，每個(gè)株系種植50～150株。BC1F4遺傳群體構(gòu)建詳見(jiàn)圖1。

圖1 BC1F4遺傳群體的構(gòu)建過(guò)程

1.2.2 性狀觀察及遺傳模型推測(cè) 觀察成株數(shù)大于50株且存在葉舌顏色分離的株系群體，統(tǒng)計(jì)各單株葉舌顏色。計(jì)算表型分離比例，根據(jù)分離比例進(jìn)行遺傳模型預(yù)測(cè)。

1.2.3 GSR40K水稻高密度全基因組SNP芯片測(cè)序與分析 成熟的水稻種子單株編號(hào)收種。選取不同葉舌顏色的單株各30～40株，取其種子進(jìn)行發(fā)芽，待葉片長(zhǎng)度達(dá)3 cm左右進(jìn)行取樣，分類取樣構(gòu)建混池。每混池包含30～40株水稻單株，樣品采用水稻GSR40K高密度SNP芯片(武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司)進(jìn)行檢測(cè)分型。檢測(cè)獲得芯片數(shù)據(jù)后，利用Genome Studio分析2個(gè)表型混樣池間的堿基差異，然后根據(jù)其在染色體位置繪圖展示，差異區(qū)段為目標(biāo)基因可能所在區(qū)間。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

芯片檢測(cè)的數(shù)據(jù)在染色體框架圖中展示，根據(jù)日本晴第6版基因組序列信息構(gòu)建水稻12條染色體的框架(條狀圖)，使用genome studio分析軟件對(duì)檢測(cè)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行展示，橫坐標(biāo)為染色體號(hào)數(shù)，縱坐標(biāo)為染色體長(zhǎng)度(單位為Mb)。雜合位點(diǎn)的展示，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將雜合堿基位點(diǎn)標(biāo)識(shí)在染色體框架圖上，繪圖展示雜合區(qū)域的位置和大小等情況。樣品間差異位點(diǎn)展示，分析2個(gè)樣品間的SNP標(biāo)記差異，然后根據(jù)其在染色體位置，繪圖直觀展示差異位點(diǎn)位置和區(qū)間大小，差異區(qū)段為目標(biāo)基因所在區(qū)間。純合的差異堿基，標(biāo)記為AA或BB，雜合的標(biāo)記為AB。利用The Rice Annotation Project Datebase網(wǎng)站(https://rapdb.dna. affrc.go.jp/viewer/gbrowse/irgsp1/)公布的日本晴基因組序列及基因信息，分析目標(biāo)區(qū)段內(nèi)與花色苷合成相關(guān)的基因，進(jìn)行目標(biāo)基因預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BC1F4代葉舌表型

觀察BC1F4代遺傳株系群體發(fā)現(xiàn)，葉舌顏色和穎尖色有3種分離情況，分別為葉舌紫色且穎尖片狀紫色的植株，樣品編號(hào)A-1；葉舌顏色為綠色但穎殼尖端點(diǎn)狀紫色的植株，樣品編號(hào)A-2；葉舌綠色且穎尖也綠色的植株，樣品編號(hào)A-3。

統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，不同株系表型分離情況不同，有不分離的株系，有分離紫色葉舌︰綠色葉舌近似3︰1的株系，還有近似9︰7的株系。紫色葉舌︰綠色葉舌=3︰1或者紫色葉舌︰綠色葉舌=9︰7的均通過(guò)卡方檢驗(yàn)，均達(dá)顯著水平(表1)。部分株系群體葉舌顏色分離呈9︰7，表明有2個(gè)基因分離，即水稻葉舌的顏色分離至少由2個(gè)基因控制，且表現(xiàn)為互補(bǔ)效應(yīng)。

表1 BC1F4代群體葉舌性狀的分離情況

2.2 GSR40K基因芯片檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 等位位點(diǎn)純合度 從各個(gè)樣品的各條染色體的純合(染色體條形圖空白區(qū))和雜合(染色體條形圖陰影區(qū))情況(圖2)看，整體上，各條染色體純合程度中等，反映混樣群體的純合進(jìn)程，與遺傳群體處于中高遺傳世代的情況吻合；染色體間存在明顯的差異，如第7染色體絕大部分已經(jīng)純合，而第4染色體純合程度較低，大部分區(qū)域仍處于雜合狀態(tài)。

注：1,2,3…12為染色體號(hào)；A-1為紫色葉舌，紫色稃尖；A-2為綠色葉舌，紫色稃尖； A-3為綠色葉舌，綠色稃尖，下同。條形圖中的陰影部分表示雜合堿基位點(diǎn)，空白表示純合位點(diǎn)。

2.2.2 芯片檢測(cè)的差異SNP位點(diǎn) 通過(guò)對(duì)A-1與A-2、A-1與A-3、A-2與A-3的SNP標(biāo)記兩兩比較，得出樣品間具有多態(tài)性SNP的情況(圖3)。A-1與A-2在第4染色體上有1段差異區(qū)間，在A-1中為雜合，在A-2中為純合，為概率較高的候選區(qū)間；A-1與A-3在第2、3、6、8、10染色體上存在差異位點(diǎn)；A-2與A-3在第2、3、4、6、8、11、12染色體上存在差異位點(diǎn)。A-1與A-2和A-3存在的差異區(qū)間為目標(biāo)區(qū)間。

圖3 樣本間的SNP差異位點(diǎn)

2.2.3 葉舌紫色性狀的基因初步定位 依據(jù)A-1與A-2和A-3存在的SNP差異，再結(jié)合3個(gè)樣品的表型(A-1雙顯性基因，A-2和A-3為單顯性或者無(wú)顯性基因)，篩選出27個(gè)候選SNP標(biāo)記，3個(gè)標(biāo)記位于第2染色體，6個(gè)位于第3染色體，2個(gè)標(biāo)記位于第8染色體，16個(gè)標(biāo)記位于第4染色體；分別對(duì)應(yīng)4個(gè)區(qū)間，為目標(biāo)基因所在的候選區(qū)間，其中第4和第3染色體的差異區(qū)間差異標(biāo)記數(shù)量較多，是候選區(qū)間的可能性更大(表2)。

表2 紫色葉舌性狀分子標(biāo)記信息

2.2.4 區(qū)間內(nèi)候選基因 分析候選區(qū)間發(fā)現(xiàn)，花青素積淀調(diào)控基因Os04g0557500位于第4染色體第27 915 598～27 939 357 bp區(qū)間[7](表3)，在本研究所定位的候選區(qū)間內(nèi)(第4染色體25 000 001～29 000 000 bp)。說(shuō)明本研究的目標(biāo)基因之一可能是已被發(fā)現(xiàn)的Os04g0557500基因。另1個(gè)目標(biāo)基因，推測(cè)位于第3染色體19 140 450～20 443 511 bp、第2染色體7 000 001～8 000 000 bp，或者第8染色體17 000 001～18 000 000 bp區(qū)間。

表3 花色苷生物合成控制基因

3 討論

花色素類物質(zhì)與糖類物質(zhì)結(jié)合而成的花色苷是水稻葉片等部位呈現(xiàn)紫紅色的主要物質(zhì)?；ㄉ諏?duì)于氧離子、氫氧根離子、過(guò)氧化氫、自由基等強(qiáng)氧化物質(zhì)的有效還原劑或螯合劑,能降低植物以及動(dòng)物體內(nèi)的過(guò)氧化作用。意大利的CIGNARELLA[2]、日本的DEGUCHI等[3]科學(xué)家先后利用大麥、藍(lán)莓等植物提取花色苷，研究花色苷對(duì)大鼠糖尿病等疾病的影響，發(fā)現(xiàn)花色苷有降血糖、抗腫瘤等動(dòng)物保健性作用。由于花色苷的保健價(jià)值，其生物合成在植物中已被廣泛研究[8-10]。該研究群體材料的表型統(tǒng)計(jì)與遺傳分析表明，在發(fā)生性狀分離的區(qū)號(hào)內(nèi)，出現(xiàn)紫色葉舌︰綠色葉舌=9︰7的性狀分離比，卡方檢驗(yàn)達(dá)顯著水平，說(shuō)明在研究群體中葉舌的顏色性狀是由2個(gè)基因控制，并且當(dāng)2個(gè)基因均為顯性時(shí)葉舌表現(xiàn)為紫色，否則表現(xiàn)為綠色。這2個(gè)基因的互作表現(xiàn)為互補(bǔ)作用。

BSA作為一種快速高效的基因定位方法，在遺傳分析與基因定位等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。借助BSA法，TAKESHIMA等[11]篩選出了與蕎麥發(fā)芽抗性相關(guān)的基因，張久坤等[12]在大豆基因組內(nèi)定位到10個(gè)與株高相關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)間；SEO等[13]定位到洋蔥塊莖顏色性狀的控制基因；GAO等[14]定位到1個(gè)調(diào)控水稻紫色葉片性狀的隱形基因Plr4。本研究所使用的BSA定位工具GSR40K基因芯片，其采用SNP標(biāo)記，針對(duì)水稻篩選出32 887個(gè)高質(zhì)量位點(diǎn)，在水稻目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)基因的尋找與分析上有廣泛應(yīng)用[15]。利用GSR40K基因芯片進(jìn)行基因檢測(cè)，篩選出研究群體內(nèi)與葉舌顏色性狀相關(guān)的存在差異的27個(gè)分子標(biāo)記位點(diǎn)，分別位于第2、3、4和8染色體上。

前人對(duì)水稻花青素遺傳模型已作出CAP基因系統(tǒng)的預(yù)測(cè)，在日本晴的基因組中共篩選出Os01g0633500、Os04g0557500與Os06g0205100等3個(gè)控制基因[7]。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，研究群體中位于第4染色體目標(biāo)區(qū)段上的目標(biāo)基因可能是Os04g0557500，該基因控制花色苷的積淀；該基因編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子，其啟動(dòng)子會(huì)由于反轉(zhuǎn)座子的插入而重排，最終導(dǎo)致異位表達(dá)[16]。另1個(gè)決定紫色葉舌的目標(biāo)基因可能位于第3染色體19 140 450～20 443 511 bp、第2染色體7 000 001～8 000 000 bp，或者第8染色體17 000 001～18 000 000 bp，而非目前已定位的Os01g0633500或Os06g0205100基因。由于未能在第2、3和8染色體上的目標(biāo)區(qū)段檢索到已定位或克隆的花色素合成相關(guān)的基因，故該基因可能是一個(gè)尚未被發(fā)現(xiàn)的新基因，需要進(jìn)行后續(xù)更精細(xì)的基因定位與功能驗(yàn)證加以證實(shí)。

4 結(jié)論

水稻葉舌顏色性狀至少受2個(gè)基因控制，當(dāng)2個(gè)基因均為顯性時(shí)葉舌表現(xiàn)為紫色，2個(gè)控制基因?yàn)轱@性互補(bǔ)效應(yīng)。2個(gè)控制基因中位于第4染色體目標(biāo)區(qū)段上的1個(gè)基因有可能是Os04g0557500，該基因控制花色苷的積淀；另1個(gè)基因初步定位于第2、3或8染色體上，可能是一個(gè)未被探知的與花色苷代謝相關(guān)的新基因，需要進(jìn)行后續(xù)更精細(xì)的定位與功能研究。