朱凱， 利婕， 武瀟逸， 胡薇薇， 吳冬梅， 虞誠瀟， 葛志偉， 葉興乾，2，3， 陳士國，2，3

基于多孔石墨化碳柱-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜解析甜菜果膠精細(xì)結(jié)構(gòu)

朱凱1， 利婕1， 武瀟逸1， 胡薇薇1， 吳冬梅1， 虞誠瀟1， 葛志偉4， 葉興乾1，2，3， 陳士國1，2，3

（1. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院, 智能食品加工技術(shù)與裝備國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南方果蔬保鮮技術(shù)集成科研基地, 浙江省健康食品制造與品質(zhì)控制國際合作基地, 杭州 310058； 2. 浙江大學(xué)馥莉食品研究院, 杭州 310058； 3. 浙江大學(xué)寧波研究院, 寧波 315100； 4. 浙江大學(xué)農(nóng)生環(huán)測試中心, 杭州 310058）

采用高溫酸法提取甜菜果膠(SBP), 經(jīng)強(qiáng)陰離子交換柱層析分離, 獲得甜菜果膠水洗脫組分(SBPW)和鹽洗脫組分(SBP3). 單糖組成分析和分子量表征結(jié)果表明, SBPW主要由半乳糖(Gal)、 阿拉伯糖(Ara)和半乳糖醛酸(GalA)組成, 分子量為1100； SBP3則以GalA為主, 分子量為41450. 通過順序酶法降解, 應(yīng)用多孔石墨化碳柱-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(PGC-Triple-Tof MS)聯(lián)用技術(shù)分析鑒定了SBPW和SBP3寡糖的精細(xì)結(jié)構(gòu). 結(jié)果表明, SPBW的主鏈為[→4)--GalA-(1→2)--Rha-(1→]重復(fù)單元構(gòu)成的Ⅰ型聚鼠李半乳糖醛酸(RG-Ⅰ果膠), 鼠李糖-4位被中性糖側(cè)鏈[-(1→5)阿拉伯聚糖和-(1→4)半乳聚糖]所取代. SBP3由-1,4鏈接的聚半乳糖醛酸(HG)和RG-Ⅰ構(gòu)成, HG和RG-Ⅰ通過-1,4糖苷鍵直接相連, 并發(fā)現(xiàn)了-GalA(1→2)-Rha(1→4)-Rha(1→4)-GalA(1→2)-Rha的新特征結(jié)構(gòu).

甜菜； 果膠； 寡糖； 結(jié)構(gòu)解析； 多孔石墨化碳柱-多級(jí)質(zhì)譜

果膠（Pectin）是一類富含半乳糖醛酸（GalA）的雜多糖， 廣泛存在于植物細(xì)胞的胞間層和初生壁中. 現(xiàn)有研究根據(jù)果膠分子主鏈和支鏈結(jié)構(gòu)的不同， 大致將其分為4類結(jié)構(gòu)域： 同型半乳糖醛酸聚糖（Homogalacturonan， HG）、 鼠李半乳糖醛酸聚糖I（Rhamngalacturonan Ⅰ， RG-Ⅰ）、 鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ（Rhamngalacturonan Ⅱ， RG-Ⅱ）和木糖半乳糖醛酸聚糖（Xylogalacturonan， XG）［1，2］. 由于來源、 提取條件、 植物發(fā)育階段、 植物種類、 細(xì)胞壁位置和環(huán)境因素不同， 果膠在其組成上也呈現(xiàn)多樣化， 至今關(guān)于果膠結(jié)構(gòu)域的相對(duì)位置以及果膠中這些結(jié)構(gòu)域之間如何連接仍有疑問［3］. 果膠不僅可用作增稠劑、 膠凝劑和乳化劑等， 也有益生、 抗腫瘤和降低血糖等生理活性功能［4～6］. 果膠的結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)［7］， 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)， 不同結(jié)構(gòu)的果膠在凝膠構(gòu)成、 腸道菌群調(diào)節(jié)和抗結(jié)腸炎功能等方面差異顯著［8～11］. 因此， 解析果膠精細(xì)結(jié)構(gòu)是利用豐富果膠資源的前提.

甜菜果膠（Sugar beet pectin， SBP）是一種相對(duì)較新的果膠， 具有比柑橘和蘋果果膠更好的乳化特性［12，13］. 研究顯示， SBP主要以富含中性糖側(cè)鏈的RG-Ⅰ結(jié)構(gòu)為主， 但精細(xì)結(jié)構(gòu)仍不明晰， 其結(jié)構(gòu)研究仍滯后于功能研究［14］. Funami等［15］發(fā)現(xiàn)SBP的分子結(jié)構(gòu)對(duì)其乳化作用具有非常重要影響， 因此深入探究SBP結(jié)構(gòu)有助于其后續(xù)開發(fā)和應(yīng)用.

果膠結(jié)構(gòu)復(fù)雜， 且黏度較大， 單純使用高碘酸-Smith降解、 甲基化和核磁共振波譜等方法對(duì)其進(jìn)行解析存在困難［16］. 近年來， 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）在解析多糖精細(xì)解析方面顯示出巨大的潛力［17—19］. 本文以SBP為研究對(duì)象， 通過離子交換層析分離純化， 采用紅外光譜和高效液相色譜表征了各組分其結(jié)構(gòu). 最后， 通過順序酶法降解， 基于多孔石墨化碳柱串聯(lián)多級(jí)質(zhì)譜（PGC-MS/MS）對(duì)SBP寡糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析， 進(jìn)而探究SBP的精細(xì)結(jié)構(gòu)， 建立了一種分步降解聯(lián)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS）分析果膠的方法， 為SBP資源的開發(fā)利用提供了依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

甜菜（10月購于杭州當(dāng)?shù)厥袌觯﹥龈珊蠓鬯椋?用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡脫色素和游離糖， 重復(fù)12次； 木糖（Xyl）、 甘露糖（Man）、 鼠李糖（Rha）、 葡萄糖（Glc）、 半乳糖（Gal）、 葡萄糖醛酸（GlcA）、 半乳糖醛酸（GalA）、 阿拉伯糖（Ara）、 巖藻糖（Fuc）、 三氟乙酸（TFA）和硼氫化鈉， 色譜純， 美國Sigma公司； 乙腈和醋酸銨， 色譜純， 德國Merck公司； 其它試劑均為分析純， 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水為純凈水.

Alpha 1-4 LDplus型凍干機(jī)， 德國Marin Christ公司； ICS-5000+Dionex型離子色譜儀， 美國賽默飛公司； UV-2600型紫外-可見（UV-Vis）分光光度計(jì)， 日本島津公司； A VA TAR370型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）， 美國尼高力儀器公司； Waters 2659型高效液相色譜儀（LC）， 美國Waters公司； ROD-20A型示差檢測器， 日本島津公司； DAW NHELE 505Ⅱ型18角激光光散射儀， 美國Wyatt公司； Acqtity UPLC classic型超高效液相系統(tǒng)， 美國Waters公司； Triple-TOF 5600+型飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)， 美國AB SCIEX公司： 負(fù)離子掃描模式； 掃描范圍：100～1500； 霧化氣： 55 psi； 霧化氣： 55 psi； 氣簾氣（CUR）： 35 psi； 離子源溫度（TEM）： 550 ℃； 離子源電壓（IS）： ?4500 V； 一級(jí)掃描： 去簇電壓（DP）： 100 V；聚焦電壓（CE）： 10 V； 二級(jí)掃描： 使用TOF MS-Product Ion-IDA模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)， CID能量為（40±20） eV， 進(jìn)樣前， 用CDS泵做質(zhì)量軸校正使質(zhì)量軸誤差小于2×10?6. 采用Peakview進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.

1.2　實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1SBP的提取將5 g甜菜粉末加入200 mL 1 mol/L鹽酸中， 用3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)提取體系pH值至1.7， 于0 ℃攪拌（1000 r/min）提取2 h， 冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH值至5.0～6.0， 以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min后取上清液， 加入2倍體積的乙醇后于4 ℃靜置2 h， 以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min， 用乙醇清洗SBP沉淀后溶解于水中， 用截留分子量為1×107的透析袋透析2～3 d， 凍干.

1.2.2甜菜果膠的分離純化使用HiTrap CaptoTMQ 5mL強(qiáng)陰離子交換柱進(jìn)行分離純化. 樣品濃度為10 mg/mL， 以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min， 上樣2.5 mL， 梯度洗脫用NaCl溶液最高濃度為1 mol/L ， 控制流速為2.5 mL/min， 梯度洗脫： 0～10 min， 0 mol/L NaCl； 10～50 min， 0～0.8 mol/L NaCl； 50～60 min， 1 mol/L NaCl； 60～70 min， 0 mol/L NaCl； 每1 min收集一次洗脫液， 并測定總糖和糖醛酸含量， 繪制洗脫曲線. 分別收集合并洗脫曲線上同一個(gè)峰的樣品， 用截留分子量為10000的透析袋透析2 d后凍干， 用于后續(xù)理化分析.

1.2.3總糖和糖醛酸的測定分別采用苯酚-硫酸法［20］和間羥基聯(lián)苯法［21，22］測定SBP中總糖和糖醛酸含量.

1.2.4分子量測定采用凝膠滲透色譜串聯(lián)18角度激光光散射-示差檢測（SEC-MALLS-RI）測定SBP的分子量. 色譜柱為Shodex OH SB-G以及Shodex SB-806 HQ和SB-804 HQ串聯(lián)， HPSEC檢測條件： Waters 2695型高效液相色譜儀， 流動(dòng)相為0.15 mol/L NaCl（含體積分?jǐn)?shù)0.02% Procolin）， 流速 0.5 mL/min， 柱溫40 ℃. 用純凈水溶解SBP樣品， 濃度為3 mg/mL， 用0.22 μm水膜過濾后上樣， 上樣量50 μL.

1.2.5單糖組成分析向1 mL 2 mg/mL SBP樣品溶液中加入1 mL 4 mol/L TFA溶液， 熔封后于110 ℃酸解6 h， 用N2氣吹干， 并用水定容至5 mL， 經(jīng)0.22 μm水膜過濾后待測. 標(biāo)準(zhǔn)品處理： 取Fuc， Rha， Ara， Xyl， Glc， Gal， Man， GlcA和GalA等摩爾混合制成1 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)單糖混合液， 梯度稀釋， 用0.22 μm水膜過濾后待測.

采用Thermo ICS-5000+（HPAEC-PAD）分析單糖組成： CarboPac PAl0色譜柱（4.6 mm×250 mm， Dionex， Thermo Fisher， USA）， 柱溫30 ℃， 上樣體積25 μL， 流動(dòng)相A為24 mmol/L NaOH溶液， 流動(dòng)相B為100 mmol/L NaOAc和24 mmol/L NaOH溶液. 流速l.0 mL/min， 梯度洗脫： 0～15 min， 100%A；15～35 min， 0%～100%B.

1.2.6酯化度分析參照文獻(xiàn)［23］方法并略有改動(dòng)進(jìn)行酯化度分析. 將5 mg SBP樣品加入0.5 mL含10 mmol/L CuSO4和10 mmol/L異丙醇的水溶液中， 混合均勻， 加入0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液再次混合均勻， 進(jìn)行皂化； 混合物在4 ℃反應(yīng)30 min. 以10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min， 取上清液并調(diào)節(jié)pH值至3.0， 用0.22 μm水膜過濾后待測.

配制甲醇、 乙酸和異丙醇質(zhì)量比為3：1：1的色譜級(jí)混合液， 作為混合標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)樣， 用于測量甲醇和乙酸的響應(yīng)因子. SinoChromODS-BP C18色譜柱（5 μm， 4.6 mm×250 mm， 依利特）， 流動(dòng)相為 4 mmol/L H2SO4溶液， 流速0.8 mL/min， 洗脫時(shí)間20 min， 進(jìn)樣量20 μL， 柱溫30 ℃， 示差折光檢測， 檢測溫度30 ℃.

1.2.7順序酶解法制備SBP寡糖將5 mg SBP3樣品溶解于2 mL 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液（pH=4.0）中， 再分別加入2 U的阿拉伯糖內(nèi)切酶（endo-1，5--L-arabinase）和半乳糖內(nèi)切酶（endo-1，4--galactanase）， 搖蕩均勻；于40 ℃反應(yīng)24 h后， 加入相同量的阿拉伯糖內(nèi)切酶和半乳糖內(nèi)切酶再反應(yīng)24 h； 反應(yīng)結(jié)束后于100 ℃滅酶10 min， 采用SuperdexTMpeptide 10/300 GL檢測.

中性糖酶解完成后， 向樣品溶液中加入2 U/mg的果膠酶（pectinase）進(jìn)行主鏈酶解， 分別于40 ℃反應(yīng)2 h和6 h后取樣， 于100 ℃滅酶10 min， 采用SuperdexTMpeptide 10/300 GL檢測.

1.2.8果膠寡糖還原脫鹽將SBPW和SBP3順序酶解后， 向寡糖中加入300 μL 10 mg/mL NaBH4溶液（溶于20 mmol/L 醋酸銨）， 于暗處還原12 h； 利用GCC SPE（250 mg， 3 mL， Supelclean ENVI carb， Sigma-Aldrich， USA）， 使用前分別用10 mL乙腈和水活化. 上樣后用10 mL水脫鹽， 用5 mL體積分?jǐn)?shù)40%乙腈（含體積分?jǐn)?shù)0.1% TFA）洗脫并收集洗脫液， 真空干燥后待測.

1.2.9PGC-ESI-MS/MS解析甜菜果膠寡糖參照文獻(xiàn)［24］方法并作一定修改， 利用UPLC-PGC-MS/MS分析降解后的寡糖組分. 采用Hypercarb多孔石墨化碳柱（3 μm， 2.1 mm×150 mm， Thermo Scientific）， 溶劑A為水（含體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸）， 溶劑B為乙腈（含體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸）， 柱溫40 ℃， 流速300 μL/min， 洗脫梯度： 0～2 min， 3%B；2～33.2 min， 3%～11%B；33.2～40 min， 11%～100%B；40～42 min， 100%B；42～50 min， 100%～3%B；50～60 min， 3%B.

2 結(jié)果與討論

2.1　甜菜果膠提取和分離純化

采用高溫酸法提取甜菜果膠（Sugar beet pectin， SBP）， 收率［（甜菜果膠）/5 g甜菜粉×100］為（8.16±0.13）%， 與文獻(xiàn)［25，26］報(bào)道的收率（6.0%～10.3%）一致. 實(shí)驗(yàn)測得SBP總糖含量為82.14%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）， 甜菜果膠的半乳糖醛酸含量為71.16%. 采用強(qiáng)陰離子色譜對(duì)甜菜果膠進(jìn)行分離純化， 洗脫情況如圖1所示. 根據(jù)其出峰順序分別命名為SBPW， SBP1， SBP2， SBP3， SBP4， SBP5和SBP6， 回收率（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為7.5%， 8.0%， 10.3%， 9.1%， 8.2%和10.0%， SBP6組分量不足支持后續(xù)分析.

Fig.1　Purification of sugar beet pectin by gradient elution(a) and absorbance of SBP detected by phenol?sulfuric acid method(b) and hydroxybiphenyl method(c)

2.2　甜菜果膠的基本結(jié)構(gòu)信息表征

對(duì)SBP進(jìn)行了基本信息表征， 結(jié)果列于表1， 可見其分子量為3444000， 是一類低酯果膠（DM質(zhì)量分?jǐn)?shù)43.14%， DAc質(zhì)量分?jǐn)?shù)21.23%）［26，27］. 離子色譜結(jié)果［圖2（A）及表1］顯示， SBP主要由GalA（57.02%， 摩爾分?jǐn)?shù)）， Rha（16.09%， 摩爾分?jǐn)?shù)）和Ara（13.67%， 摩爾分?jǐn)?shù)）組成， Rha/GalA大于0.05［28］， 同型半乳糖醛酸聚糖的摩爾分?jǐn)?shù)［（HG）］為40.93%， 鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ［（RG-Ⅰ）］為47.86%， 說明甜菜果膠是側(cè)鏈含量豐富的RG-Ⅰ型果膠. 利用紅外光譜分析了SBP的官能團(tuán)組成， ［圖2（B）］中1745 cm-1處為羧基（COOH）的伸縮振動(dòng)峰， 1635 cm-1處為羥基（C=O）的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰， 1441 cm-1處為C=O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰， 均為糖醛酸中質(zhì)子化羧基的特征峰. 此外， 832 cm-1和919 cm-1附近均有較強(qiáng)吸收峰， 說明SBP中既含有-糖苷鍵， 也含有一定量的-糖苷鍵， 這與單糖表征結(jié)果相符. 進(jìn)一步分析了純化后的樣品， 從表1可知， SBPW主要以中性糖為主， 隨著洗脫液中鹽濃度的增加， 洗脫的SBP組分中GalA含量也呈現(xiàn)增加趨勢. SBP1， SBP2和SBP3均為富含中性糖側(cè)鏈的RG-Ⅰ型果膠， 而SBP4和SBP5則是HG型果膠（GalA的摩爾分?jǐn)?shù)>60%）. 純化后各組分的分子量為1100～100200，w/n在1.535～2.875之間， 表明純化后的甜菜果膠不具有多分散性. 研究表明， 果膠中的甲酯基團(tuán)會(huì)阻礙強(qiáng)陰離子填料對(duì)果膠的吸附作用， 因此在梯度洗脫過程中甲酯化度越高的甜菜果膠越早被洗脫出來［29］. SBP各組分的酯化度數(shù)據(jù)見表1， 可見隨著洗脫濃度的增大， SBP洗脫組分酯化度降低.

Table 1　Monosaccharide composition(%, molar fraction) and molecular weight of pectin

.（HG）=（GalA）-（Rha）： the molar fraction of HG domains on pectin；.（RG-Ⅰ）=2（Rha）： the proportions of RG-Ⅰ domains on pectin；. DM： degree of methylation；. DAc： degree of acetylation；w： weight-average of molar mass；. not detected.

Fig.2　Overlaid HPAEC?PAD chromatograms of different pectin fractions after purification(A) and FTIR(B) of sugar beet pectin

2.3　順序酶降解方法的優(yōu)化

Fig.3　Overlaid HPGPC profiles of oligosaccharide distribution of side chain enzymolysis(A) and main chain enzymolysis(B) by superdex peptide

(A). 0.4 U/mg,. 0.8 U/mg; (B). 4 h,. 6 h.

研究表明， 半乳糖和阿拉伯糖內(nèi)切酶對(duì)果膠中性糖側(cè)鏈的酶解效率很低［30］， 通過控制酶解時(shí)間和酶濃度優(yōu)化了SBP3的側(cè)鏈酶解條件. 由圖3（A）可見， 采用0.4 U/mg的酶與底物比酶解48 h后， 出現(xiàn)了不同聚合度的寡糖低豐度信號(hào)峰， 說明SBP3中部分中性糖側(cè)鏈被降解. 隨著酶量增加至0.8 U/mg， 不同聚合度的中性糖寡糖豐度顯著增加. 因此， 確定SBP中性糖側(cè)鏈酶解條件如下： 40 ℃反應(yīng)48 h， 每24 h分別加入0.4 U/mg的阿拉伯糖和半乳糖內(nèi)切酶.

果膠側(cè)鏈酶解后進(jìn)行主鏈酶解， 按照2 U/mg酶與底物比加入果膠酶， 隨著酶解時(shí)間的延長 ［圖3（B）］， SBP3的主鏈被酶解得更徹底， 更多半乳糖醛酸寡糖被釋放出來， 選取主鏈酶解時(shí)間為6 h的條件進(jìn)行分析.

2.4　PGC-MS/MS解析甜菜果膠寡糖

多孔石墨化碳柱（PGC）表面是由碳原子排布成類似芳環(huán)的六角形結(jié)構(gòu)， 分子表面越平， 極性越大與其相互作用的機(jī)會(huì)也越大； 此外， 由于為全碳基材料， PGC在極端pH和溫度下仍穩(wěn)定， 在分離寡糖類極性分子方面具有良好的優(yōu)勢.

由圖4可見， SBPW［圖4（A）］和SBP3［圖4（B）］順序酶解后產(chǎn)生一系列寡糖， 在50 min內(nèi)被 PGC-triple-Tof-MS成功分離并檢測. 根據(jù)質(zhì)譜信息中的分子量數(shù)據(jù)、 單糖組成和斷裂碎片峰信息推測各組分可能的寡糖序列如表2和表3所示.與半乳糖寡糖相比， 阿拉伯寡糖能在PGC中保留得更久； 此外， 帶有電荷的半乳糖醛寡糖在PGC中被強(qiáng)烈保留， 洗脫時(shí)間顯著增加， 與Westphal等［31］的研究結(jié)果相吻合.

Fig.4　Annotated base peak chromatogram of characterized oligosaccharides from SBPW(A) and SBP3(B)

SBPW經(jīng)順序酶降解后共檢測到22種寡糖［圖4（A）］. 從一級(jí)質(zhì)譜圖可以看到， 中性糖寡糖存在 ［M-H］-和［M+HCOO］-離子， 而半乳糖醛酸寡糖僅以［M-H］-的離子存在. 根據(jù)確定各峰的歸屬 （表3）， 寡糖聚合度范圍集中在2～7， 主要為阿拉伯糖寡糖和半乳糖寡糖， 證明中性糖內(nèi)切酶能有效地降解果膠的側(cè)鏈. 此外， 還有少量的半乳糖醛酸寡糖（GalA oligo）和鼠李糖半乳糖醛酸寡糖（Rha-GalA oligo）， 分別來自SBPW的HG和RGI結(jié)構(gòu)域.

Table 2　Signal attribution of SBPW

Table 3　Signal attribution of SBP3

進(jìn)一步結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜分析了寡糖結(jié)構(gòu)， 阿拉伯二糖（Ara2）的二級(jí)質(zhì)譜見圖5. C1（149.0460）和Y1（151.0571）是典型糖苷鍵斷裂產(chǎn)生的碎片離子峰， 環(huán)內(nèi)裂解碎片的缺失使得難以確定其具體鏈接信息， 結(jié)合endo-arabinanase能在一定程度上專一酶解斷裂1，5連接的阿拉伯聚糖， 因此推斷Ara2是-1，5鏈接的阿拉伯二糖［32］. 保留時(shí)間17.8 min處的=593.19的離子歸屬于［Ara4+HCOO］-， 除糖苷鍵斷裂產(chǎn)生的C1（149.04）， B2（265.09）， B3397.14）， Y1（151.06）和Y2（283.10）等碎片外， 阿拉伯四糖也產(chǎn)生了0，3A2（191.06）. 結(jié)合文獻(xiàn)［14］報(bào)道， 推斷該寡糖為-Ara（1→5）-Ara （1→5）-Ara（1→5）-Ara. 進(jìn)一步分析了半乳寡糖鏈的連接情況結(jié)構(gòu)［圖5（E）］， 對(duì)于1，4連接的六碳糖而言， 易發(fā)生0，2A，2，4A和2，5A的跨環(huán)斷裂［1］， 由此可確定SBPW中半乳四糖的結(jié)構(gòu)為-Gal（1→4）-Gal（1→4）-Gal（1→4）-Gal， 與endo-galactanase的酶解規(guī)律保持一致［33］. 此外， 圖5（C）顯示了Ara2Gal的二級(jí)質(zhì)譜圖， 出現(xiàn)的Y1181.07）說明還原后的Gal位于為還原末端， C1（149.04）和C2（281.09）片段則表明Ara位于非還原端， 由碎片0，3A2（191.06）可推斷阿拉伯糖為1，5連接， 未觀察到Gal產(chǎn)生環(huán)內(nèi)斷裂［34］， 推測Ara和Gal之間是1，3連接， 因此Ara2Gal的結(jié)構(gòu)為-Ara（1→5）-Ara（1→3）-Gal. 根據(jù)MS/MS分析， SBPW其余寡糖結(jié)構(gòu)見表3. 中性糖側(cè)鏈主要以1，5連接的阿拉伯聚糖和1，4連接的半乳聚糖為主， 部分的Gal和Ara的-3位分別被-Ara和-Gal取代構(gòu)成了帶分枝的結(jié)構(gòu)， 并且中性糖側(cè)鏈主要通過1，4糖苷鍵與甜菜果膠的RG-Ⅰ的-Rha連接［圖5（E）］.

Fig.5　MS/MS spectra of SBP3 reduced oligosaccharides and oligosaccharides Ara2(A) , Ara4(B), Gal5(C), Ara2Gal(D), Gal3Rha(E), GalA2(F), Rha2GalA2(G) and Rha3GalA2(H)(alditol form of reduced oligosaccharides)

圖4（B）給出順序酶解得到的SBP3的寡糖序列， 共解析到22種寡糖結(jié)構(gòu)， 聚合度分布在2～7， 與酶解后凝膠色譜柱分析結(jié)果一致［圖3（B）］. 與水洗脫組分SBPW相比， SBP3降解后的寡糖主要為GalA Oligo， 其次是Rha-GalA oligo， 結(jié)合單糖分析（表1）結(jié)果， SBP3鏈由HG和RG-Ⅰ構(gòu)成［（HG）/（RG）= 3∶2］. 在GalA2（371.09）的MS/MS譜圖［圖5（F）］中， 除了B1（177.02）， C1（193.04）和Y1（195.05）的糖苷鍵碎片外， 也產(chǎn)生了環(huán)內(nèi)裂解的2，4A2（235.05）， 推斷該寡糖為-GalA（1→4）- GalA［35］. 以此解析其它的半乳糖醛酸寡糖（表4）. 值得注意的是， 在SBPW和SBP3中， 帶有甲酯基團(tuán)的半乳糖醛酸寡糖幾乎沒有被檢測到， 這是因?yàn)楣z酶僅能高效地作用于HG結(jié)構(gòu)域中無甲酯基的-1，4-D-GalA， 釋放出半乳糖醛酸寡糖. 圖5（G）為GalA2Rha2的二級(jí)質(zhì)譜圖， 通過糖苷鍵碎片B1（175.02）， C1（193.03）， B2（323.08）和C2（339.09）確定了非還原端是GalA， 而Rha則位于還原端，1，3A2（235.05）碎片說明GalA于Rha之間以1，2糖苷鍵鏈接， 結(jié)合RG-Ⅰ結(jié)構(gòu)域的特征， 確定GalA2Rha2的結(jié)構(gòu)為-GalA（1→2）-Rha（1→4）α-GalA（1→2）-Rha. 在寡糖GalA2Rha3（809.26）的二級(jí)質(zhì)譜圖［圖5（G）］中， Z1（165.08）說明Rha位于還原端， 同時(shí)， B1（175.02）， C1（193.03）， B2（323.10）， C2（339.09）， C3（485.15）和B4（648.19）離子說明GalA2Rha3從非還原端開始順序?yàn)镚alA-Rha-Rha-GalA-Rha，1，3A2（235.05）和2，4A3（381.10）碎片證明GalA連接于Rha的-2位， 而2個(gè)相鄰Rha則以1，4糖苷相連， 即該寡糖片段為-GalA（1→2）-Rha（1→4）-Rha（1→4）-GalA（1→2）-Rha. 結(jié)合MS/MS解析SBP3寡糖具體結(jié)構(gòu)見表4.

3 結(jié) 論

通過高溫?zé)崴崽崛〉玫教鸩斯z（SBP）， 分析結(jié)果顯示SBP是一類高中性糖側(cè)鏈的低酯果膠（w=344400）. 用強(qiáng)陰離子交換色譜分離純化SBP后， 以水洗脫組分（SBPW）和鹽洗脫組分（SBP3）為研究對(duì)象， 采用順序酶降解法， 聯(lián)合PGC-MS/MS分析， 共鑒定出22種寡糖序列. 進(jìn)一步結(jié)合單糖分析發(fā)現(xiàn)， SPBW是一類富含中性糖側(cè)鏈的RG-Ⅰ果膠， 在Rha的-4被1，5連接的阿拉伯聚糖和1，4連接的半乳聚糖取代. SBP3主鏈由HG和RG-Ⅰ構(gòu)成［（HG）/（RG）=3∶2］， HG為-1，4鏈接的同聚半乳糖醛酸， RG-Ⅰ 結(jié)構(gòu)域主要由［→4）--GalA-（1→2）--Rha-（1→］重復(fù)單元構(gòu)成， 但也發(fā)現(xiàn)了-GalA（1→2）-Rha（1→4）-Rha（1→4）-GalA（1→2）-Rha的新特征結(jié)構(gòu)， HG和RG-Ⅰ結(jié)構(gòu)域直接通過-1，4糖苷鍵相連. SBP3的RG-Ⅰ區(qū)域側(cè)鏈主要為包括-（1→4）半乳聚糖和（1→5）阿拉伯聚糖， 以及帶有少量Ara分支的-（1→4）半乳聚糖. 本文實(shí)現(xiàn)了對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的果膠精細(xì)結(jié)構(gòu)的高效快速分析， 新發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)信息完善了現(xiàn)有的甜菜果結(jié)構(gòu)研究， 也為SBP的功能研究和應(yīng)用提供了理論依據(jù).

［1］ Mao G. Z.， Wu D. M.， Wei C. Y.， Tao W. Y.， Ye X. Q.， Linhardt R. J.， Orfila C.， Chen S. G.，， 2019，， 65—78

［2］ Somerville C.， Bauer S.， Brininstool G.， Facette M.， Hamann T.， Milne J.， Osborne E.， Paredez A.， Persson S.， Raab T.， Vorwerk S.， Youngs H.，， 2004，（5705）， 2206—2211

［3］ Atmodjo M. A.， Hao Z. Y.， Mohnen D.， 2013，， 747—779

［4］ Blanco P. F.， Steigerwald H.， Schulke S.， Vieths S.， Toda M.， Scheurer S.，， 2021，（10）， 43

［5］ Gao X. G.， Zhi Y.， Sun L.， Peng X. X.， Zhang T.， Xue H. T.， Tai G. H.， Zhou Y. F.，， 2013，（47）， 33953-33965

［6］ Mohnen D.，， 2008，（3）， 266—277

［7］ Larsen N.， de Souza C. B.， Krych L.， Cahu T. B.， Wiese M.， Kot W.， Hansen K. M.， Blennow A.， Venema K.， Jespersen L.，， 2019，， 223

［8］ Zhu K.， Mao G. Z.， Wu D. M.， Yu C. X.， Cheng H.， Xiao H.， Ye X. Q.， Linhardt R. J.， Orfila C.， Chen S. G.，， 2020，（32）， 8688—8701

［9］ Wu D. M.， Chen S. G.， Ye X. Q.， Ahmadi S.， Hu W. W.， Yu C. X.， Zhu K.， Cheng H.， Linhardt R.J.， He Q. J.，， 2022， 107209

［10］ Wu D. M.， Zheng X. L.， Hu W. W.， Zhu K.， Yu C. X.， He Q. J.， Linhardt R. J.， Ye X. Q.， Chen S. G.，， 2021，， 100283

［11］ Mao G. Z.， Li S.， Orfila C.， Shen X. M.， Zhou S. Y.， Linhardt R. J.， Ye X. Q.， Chen S. G.，， 2019，（12）， 7828—7843

［12］ Wei Z. H.， Zhu P.， Huang Q. R.，， 2019，， 448—458

［13］ Gromer A.， Penfold R.， Gunning A. P.， Kirby A. R.， Morris V. J.，， 2010，（16）， 3957—3969

［14］ Levigne S.V.， Ralet M. C. J.， Quéméner B. C.， Pollet B. N. L.， Lapierre C.， Thibault J. F. J.，， 2004，（3）， 1173—1180

［15］ Funami T.， Nakauma M.， Ishihara S.， Tanaka R.， Inoue T.， Phillips G. O.，， 2011，（2）， 221—229

［16］ Zhu K.， Ye X. Q.， Liu D. H.， Chen S. G.，， 2021，（1）， 23—32（朱凱， 葉興乾， 劉東紅， 陳士國. 未來食品科學(xué)， 2021，（1）， 23—32）

［17］ Wang J. Q.， Zhao J.， Nie S. P.， Xie M. Y.， Li S. P.，， 2021，， 116436

［18］ Liang Q. T.， Zou Q.， Lin J. H.， Liu S. T.， Wei Z.，， 2021，（6）， 1776—1784（梁群燾， 鄒強(qiáng)， 林江慧， 劉樹滔， 魏崢. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)， 2021，（6）， 1776—1784）

［19］ Li C.， Wang C. J，. Jin W. J.， Han J. L.， Yang M. F.， Gao X.， Huang L. J.， Wang Z. F.，， 2019，（1）， 69—75（李成， 王承健， 晉萬軍， 韓健利， 楊梅芳， 郜茜， 黃琳娟， 王仲孚. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)， 2019，（1）， 69—75）

［20］ Dubois M.， Gilles K. A.， Hamilton J. K.， Rebers P. A.， Smith F.，， 1956，（3）， 350—356

［21］ Meseguer I.， Aguilar V.， González M. A. J.， Mart??Nez C.，， 1998，（4）， 285—291

［22］ de Arcuri B. E. F.， de Recondo M. E. F.， Recondo E. F.， Carbohydrate Research， 1980，（2）， 165—176

［23］ Levigne S.， Thomas M.， Ralet M. C.， Quemener B.， Thibault J. F.，， 2002，（6）， 547—550

［24］ Logtenberg M. J.， Donners K. M. H.， Vink J. C. M.， van Leeuwen S. S.， de Waard P.， de Vos P.， Schols H. A.，， 2020，（29）， 7800—7808

［25］ Sun R. C.，Hughes S.，， 1999，（3）， 273—281

［26］ Yapo B.M.， Robert C.， Etienne I.， Wathelet B.， Paquot M.，， 2007，（4）， 1356—1364

［27］ Buchholt H. C.， Christensen T. M. I. E.， Fallesen B.， Ralet M. C.， Thibault J. F.，， 2004，（2）， 149—161

［28］ Wang X.， Chen Q. R.， Lu X.，， 2014，， 129—137

［29］ Guillotin S. E.， Van Loey A.， Boulenguer P.， Schols H. A.，Voragen A .G. J.，， 2007，（1）， 85—91

［30］ Ognyanov M.， Remoroza C.， Schols H. A.， Georgiev Y. N.， Petkova N. T.， Krystyjan M.，， 2020，， 115549

［31］ Westphal Y.， Schols H. A.， Voragen A. G. J.， Gruppen H.，， 2010，（5）， 689—695

［32］ Huang C. C.， Yan J. Y.， Zhan L. P.， Zhao M.， Zhou J. Y.， Gao H. Y， Xie W. C.， Li Y.， Chai W. G.，， 2019，， 25—35

［33］ Lee S. J.， In G.， Lee J. W.， Shin K. S.，， 2021，， 13—22

［34］ Palma A. S.， Liu Y.， Zhang H. T.， Zhang Y. B.， McCleary B. V.， Yu G. L.， Huang Q. L.， Guidolin L. S.， Ciocchini A. E.， Torosantucci A.， Wang D. N.， Carvalho A. L.， Fontes C. M. G. A.， Mulloy B.， Childs R. A.， Feizi T.， Chai W. G.，， 2015，（4）， 974—988

［35］ XIE B. Y.， Yi L.， Zhu Y. T.， Chang X. M.， Hao J.， Pang L.， Ouyang Y. L.， Yuan S.， Zhang Z. Q.，， 2021，， 117080

Combined PGC-Triple-Tof-MS Enables the Separation， Identification of Sugar Beet Pectin Derived Oligomers

ZHUKai1， LIJie1， WUXiaoyi1， HUWeiwei1， WUDongmei1， YUChengxiao1， GEZhiwei4， YEXinqian1，2，3， CHENShiguo1，2，3*

（，，，，，，310058，；，，310058，；，，315100，；，，310058，）

Sugar beet pectin（SBP） was extracted by high-temperature acid method， the water-eluted components（SBPW） and salt-eluted components（SBP3） were obtained by strong anion exchange chromatography. The results of monosaccharide composition and molecular weight analysis showed that SBPW was mainly composed of galactose（Gal）， arabinose（Ara） and galacturonic acid（GalA）， with a molecular weight of 1100， while SBP3 was dominated by GalA and weighted 41450. Combined sequential enzymatic degradation and porous graphitized carbon column-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry（PGC-Triple-Tof MS）， the fine structure of SPPW and SPP3 oligosaccharides was analyzed. The results showed that the main chain of SPBW was ［→4）--GalA-（1→2）--Rha-（1→］ repetitive units composed of RG-Ⅰ pectin， and neutral sugar side chain ［-（1→5） arabinan and-（1→4） galactan］ were substituted for Rha at the-4 position. SBP3 consisted of HG and RGⅠ with a molar of 3：2， HG was a linear structure of-1，4-linked GalA， HG and RG-Ⅰ domains were connected directly by-1，4 glycoside bonds. New characteristic structures of oligosaccharide have also been found， similar to-GalA（1→2）-Rha（1→4）-Rha（1→4）-GalA（1→2）-Rha.

Sugar beet； Pectin； Oligosaccharide； Structure analyses； Porous graphitized carbon column-Tandem mass spectrometry

O629.1

A

10.7503/cjcu20220023

2022-01-09

2022-02-16.

陳士國， 男, 博士, 教授, 主要從事碳水化合物功能研究，果蔬副產(chǎn)物可持續(xù)加工技術(shù)的研究. E?mail: chenshiguo210@163.com

浙江省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào)：2021C02001)和浙江大學(xué)校級(jí)科研發(fā)展專項(xiàng)(批準(zhǔn)號(hào)：2021FZZX001?54)資助.

the Zhejiang Province Key R & D Projects, China(No.2021C02001) and the Zhejiang University Scientific Research Development Project, China(No.2021C02001).

（Ed.： L， H， W， K）