李雪,王淳,王靜,程瑞明,趙金滿,韓馨悅,張志東

(1河北農業(yè)大學 林學院，河北 保定 071000；2河北省林木種質資源與森林保護重點實驗室,河北 保定 071000)

凋落葉是林木生長發(fā)育過程的代謝產物，是林地有機質的主要來源。凋落葉分解對于維持土壤肥力、植物生長和生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)等具有重要作用[1]。凋落葉分解為物理過程和生物化學過程[2-3]。分解初期，受淋溶作用的影響，氮、磷等元素快速損失，淋溶作用主要是將有機鹽、蛋白質等可溶性物質釋放出來，對于木質素等難溶解的物質影響不大。微生物能夠直接參與凋落葉的分解過程，如氧化、氨化、固氮等過程。凋落葉的碳、氮、磷等養(yǎng)分元素給微生物提供食物，微生物的代謝活動反過來會影響凋落葉的分解。在微生物參與的分解階段，氮、磷等營養(yǎng)元素難以滿足微生物的需要，因此，微生物會固定氮、磷等營養(yǎng)元素[4]。微生物的群落結構會隨著分解時間的變化而改變[5]。易分解的物質在分解初期被大量分解，微生物可利用的物質減少，從而引起微生物群落結構的變化[6]。也有研究表明氮、磷等營養(yǎng)元素的積累也可能與物理吸附有關[7]。

由于自身“基質質量”的影響，針葉樹種分解速率較慢。因此，采取有效措施提高凋落葉分解速率對于養(yǎng)分循環(huán)具有重要意義。研究表明，一種凋落葉的分解會受另外一種凋落葉的影響，存在混合效應[8]。與針葉凋落物相比，針闊混交能夠加快分解速率；也有研究得出針闊混交未起到促進作用[9-10]。目前，混合凋落葉對于分解的影響尚無定論[11]。

華北落葉松(Larixprincips-rupprechtii)是華北地區(qū)主要的速生用材林，在水土保持、涵養(yǎng)水源和防風固沙等方面發(fā)揮著極其重要的作用。塞罕壩機械林場營造了大面積的華北落葉松人工林[12]。白樺和蒙古櫟是華北落葉松人工林的常見混交樹種。本研究以塞罕壩地區(qū)華北落葉松、白樺(Betulaplatyphylla)和蒙古櫟(Quercusmongolica)凋落葉為研究對象，采用凋落物分解袋法，研究分解過程中凋落葉養(yǎng)分和細菌群落動態(tài)變化及其相關性，為華北落葉松人工林樹種混交和科學管理提供理論依據(jù)。

1 研究地區(qū)與研究方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于河北省北部，冀蒙交界地(E 116°51′～117°39′，N 42 °02 ′～42 °36 ′ )，屬于陰山余脈、大興安嶺余脈和內蒙草高原交錯地區(qū),是冀北地區(qū)森林-草原和干旱-半干旱交錯帶。海拔1 010～1 939.9 m，地勢較平坦，地形以曼甸和丘陵為主。該地區(qū)是典型的半干旱半濕潤寒溫帶大陸季風氣候，年均溫-1.3 ℃，年均最高氣溫33.4 ℃，年均最低氣溫-43.3 ℃。年均降水量460 mm,年均大風日數(shù)53 d，年均無霜期64 d。土壤類型以森林土和棕壤土為主。針葉樹種以華北落葉松、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)、云杉(Piceaasperata)為主，闊葉樹種以白樺和蒙古櫟為主。

1.2 試驗設計

華北落葉松人工林基本情況，見表1。

表1 華北落葉松人工林基本情況Table 1 Condition of sample plots

由表1可知，本試驗選擇的3塊落葉松人工林標準地基本信息，標準地大小為30 m×20 m。2017年10月收集華北落葉松、白樺和蒙古櫟凋落葉，帶回試驗基地風干，去除雜質后備用。凋落葉設置4個處理：純華北落葉松；華北落葉松×白樺(1∶1)；華北落葉松×蒙古櫟凋落葉(1∶1)；華北落葉松×白樺×蒙古櫟凋落葉(1∶1∶1)。按4個處理分別稱取24 g凋落葉裝入分解袋(網(wǎng)眼孔徑1 mm，規(guī)格30 cm×20 cm)。在每個樣地中心位置設4個埋放點(分別對應4個處理)，各埋放點間隔1 m，每個處理埋放6袋，共計72袋。埋放時去除林地上層凋落物，埋放深度與凋落物層齊平，使之與腐殖質層充分接觸，之后將少量凋落物覆蓋在擺放好的凋落葉袋上，避免雨水沖刷以及意外丟失。

2017年10月埋袋前每種處理各留3袋用作初始養(yǎng)分分析。2018、2019年的5、7、9月份取回凋落葉袋，每次取樣分別在3塊樣地中收集4種處理的樣品，不同處理的測量結果取3塊相同林齡樣地的平均值。取樣時要注意去除分解袋上附著的雜物，將分解袋帶回實驗室，分為2部分，一部分置于80 ℃烘箱內烘干48 h至恒重并記錄，用于養(yǎng)分含量測定；另外一部分置于-80 ℃超低溫冰箱內，用于微生物群落結構測定。

1.3 凋落葉化學性質測定

根據(jù)《土壤農化分析》，凋落葉全碳含量采用氧化法測定；全氮含量采用半微量凱式定氮法測定；全磷含量采用鉬藍比色法測定；全鉀含量采用火焰光度計測定；pH采用pH計測定。

1.4 細菌群落結構測定

采用CTAB方法對樣品的DNA進行提取，之后使用無菌水將樣本稀釋至1 g/μl。使用帶Barcode的特異引物和高效高保真酶進行PCR。采用OTU聚類分析和物種分類學分析來確定樣本細菌在門水平上的群落組成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

凋落葉養(yǎng)分釋放率計算式：

Rt=(M0C0-MtCt)/M0C0×100%

(1)

式中：M0表示凋落葉初始干重(g)；Mt表示凋落葉分解t時間后剩余干重(g)；C0表示凋落葉初始養(yǎng)分含量；Ct表示凋落葉分解t時間后的養(yǎng)分含量。

Shannon指數(shù)計算公式：

(2)

式中，Sobs是觀測的OTU數(shù)，F(xiàn)i是序列數(shù)為i的OTU數(shù)目，N是序列數(shù)目的和。

Simpson指數(shù)計算公式：

(3)

其中，Sobs是觀測的OTU數(shù)，F(xiàn)i是序列數(shù)為i的OTU數(shù)目，N是序列數(shù)目的和。

Chao1指數(shù)計算公式:

(4)

式中，Sobs表示樣本中觀察到物種數(shù)目，即實際OTU數(shù)；F1表示僅有1條read的OTU數(shù)；F2表示僅有2條read的OTU數(shù)。

ACE指數(shù)計算公式：

(5)

式中，Srare是小于等于“abound”條序列的OTU數(shù)目，Sabound為大于“abound”條序列的OTU數(shù)目，CACE是樣本豐富度預測值，F(xiàn)1是序列數(shù)為1的OTU數(shù)目，γACE是稀有OTU的預測變異系數(shù)。

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。凋落葉養(yǎng)分含量顯著性檢驗采用單因素方差分析(ANOVA) 和最小顯著差異法(LSD)，顯著性水平設定為 α = 0.05。

利用 Uparse 軟件對所有細菌樣品進行聚類。采用Mothur方法進行物種注釋分析，獲得分類學信息并在門分類水平上統(tǒng)計各樣本的細菌群落組成。使用Qiime軟件計算Shannon，Simpson，Chao1和ACE等多樣性指數(shù)，并用Origin軟件作圖。采取R軟件的 Vegan 軟件包中的冗余分析(Redundancy analysis, RDA)解釋凋落葉養(yǎng)分與細菌群落之間的關系。

2 結果與分析

2.1 凋落葉養(yǎng)分含量變化

不同混合凋落葉養(yǎng)分含量，見圖1。

圖1 不同混合凋落葉土壤養(yǎng)分變化Figure 1 Changes of soil nutrients in different mixed litters注：L是華北落葉松；LB是華北落葉松+白樺；LQ是華北落葉松+蒙古櫟 ；LBQ是華北落葉松+白樺+蒙古櫟；下同。不同小寫字母代表相同時間不同處理之間存在顯著性差距(P<0.05)。

由圖1可知，不同處理凋落葉的C含量整體上呈緩慢下降趨勢；分解300 d時，LQ的C含量顯著低于LBQ；分解360 d、600 d、660 d和720 d時，L的C含量高于LB、LQ和LBQ。不同處理的N含量隨分解時間均呈上升趨勢；L的初始N含量顯著高于其他處理；分解600 d、660 d和720 d時，L的N含量低于其他混合凋落物葉。不同處理的P含量隨時間變化呈波動上升趨勢，各處理間無顯著差異。各處理的K含量整體呈波動下降趨勢；L和LB的初始K含量顯著高于LQ和LBQ；分解240 d，LB的K含量顯著高于其他處理。其他時期各處理間K含量無顯著差異。從整體上看，各處理的凋落葉pH呈先降低后上升的趨勢；不同處理的初始pH有顯著差異,L的初始pH顯著低于其他混合凋落葉。分解240 d，各處理差異不顯著；分解300 d、360 d、600 d、660 d和720 d，L的pH顯著低于其他混合凋落葉。

2.2 養(yǎng)分釋放率

不同混合凋落葉養(yǎng)分釋放率，見圖2。

圖2 不同混合凋落葉養(yǎng)分釋放率隨分解時間的變化Figure 2 Change of nutrient release rate of different mixed litters during decomposition time

由圖2可知，凋落葉分解過程中，凋落葉C、N、K釋放率為正值，表現(xiàn)為直接釋放狀態(tài)；P釋放率隨分解時間表現(xiàn)為正-負-正，表現(xiàn)為淋溶-富集-釋放狀態(tài)。分解720 d時，凋落葉C釋放率大小順序為LBQ>LB>LQ>L；N釋放率為L>LQ>LB>LBQ；P釋放率為L>LBQ>LQ>LB；K釋放率為LBQ>LB>LQ>L。

2.3 細菌群落結構變化

不同混合凋落葉細菌優(yōu)勢群落組成隨時間的變化,見表2。

表2 不同混合凋落葉細菌優(yōu)勢群落組成隨時間的變化Table 2 Changes of bacterial dominant community composition in different mixed litters with decomposition time

由表2可知，在凋落物分解過程中，變形菌門(39.83%～77.16%)、藍細菌門(0.17%～25.92%)、擬桿菌門(3.95%～23.88%)和放線菌門(1.64%～15.20%)是優(yōu)勢細菌門。微生物群落結構的變化主要是由優(yōu)勢菌的變化引起[13]。因此本研究只對凋落葉優(yōu)勢細菌進行分析，對于4種凋落葉來說，不同分解時間的優(yōu)勢細菌門存在顯著差異。在L處理中，隨分解時間增加，變形菌門相對豐度呈下降趨勢，240 d、300 d、360 d的變形菌門相對豐度顯著高于720 d；藍細菌門相對豐度隨分解時間增加呈下降趨勢，240 d的藍細菌門相對豐度顯著高于其他分解時間；擬桿菌門相對豐度呈波動上升趨勢，600 d和720 d擬桿菌門相對豐度顯著高于240 d；放線菌門相對豐度呈上升趨勢,600 d、660 d和720 d的放線菌門相對豐度顯著高于240 d、300 d和360 d。在LB處理中，變形菌門相對豐度隨林齡的增加波動性降低，240 d的變形菌門相對豐度顯著高于720 d；240 d的藍細菌相對豐度顯著高于720 d；擬桿菌門相對豐度先升高后降低，分解300 d達到最大值；放線菌門相對豐度波動性上升，720 d達到最大值。在LQ處理中，變形菌門相對豐度呈下降趨勢；藍細菌門相對豐度波動下降，分解240 d相對豐度最高；擬桿菌門相對豐度隨分解時間的增加先升高后降低，分解300 d達到最大值；放線菌門相對豐度波動性上升，720 d達到最大值。在LBQ處理中，變形菌門和藍細菌門相對豐度呈下降趨勢，240 d二者的相對豐度顯著高于其他分解時間；隨時間增加擬桿菌門相對豐度呈先升后降的趨勢，600 d達到最大值。放線菌門相對豐度隨時間的增加而上升，720 d達到最大值。

對于不同處理的混合凋落葉來說，240 d和600 d不同處理的4種優(yōu)勢菌沒有顯著差異；300 d和360 d不同處理的變形菌門、藍細菌門和放線菌門相對豐度沒有顯著差異，LB的擬桿菌門相對豐度顯著高于L；660 d的LQ的擬桿菌門相對豐度顯著高于L、LB和LBQ；720 d不同處理的藍細菌門和放線菌門相對豐度沒有顯著差異，LQ的變形菌門相對豐度顯著高于L、LB和LBQ ,L的擬桿菌相對豐度顯著高于LB和LBQ。

2.4 細菌多樣性差異

不同混合凋落葉細菌多樣性指數(shù)，見表3。

表3 不同混合凋落葉細菌多樣性指數(shù)Table 3 Diversity index of bacteria in different mixed leaf litter

表3(續(xù))

由表3可知，對于4種處理的凋落葉來說，不同分解時間的細菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)存在顯著差異。其中Shannon和Simpson指數(shù)均隨分解時間的增加呈上升趨勢，在720 d達到最大值。Chao1和ACE指數(shù)隨分解時間的增加呈波動性增加，L在360 d達到最大值；LB和LQ在720 d達到最大值； LBQ在360 d和720 d達到最大值。分解600 d、660 d、720 d時，混合凋落物(LB、LQ和LBQ)的Chao1和ACE指數(shù)均大于L，在720 d時，存在顯著差異。

2.5 細菌群落與養(yǎng)分的關系

凋落葉細菌群落與養(yǎng)分的相關系數(shù)，見表4。

表4 凋落葉細菌與養(yǎng)分的相關系數(shù)Table 4 Correlation coefficient between litter bacteria and nutrients

由表4可知，凋落葉C含量與放線菌門呈極顯著負相關；凋落葉N含量與變形菌門和藍細菌門呈極顯著負相關，與放線菌門呈極顯著正相關；凋落葉P含量與擬桿菌門呈顯著正相關；K含量與放線菌門呈顯著負相關；凋落葉pH與變形菌門和藍細菌門呈極顯著負相關，與擬桿菌門和放線菌門呈極顯著正相關。N和pH均與Shannon、Simpson、Chao1和ACE多樣性指數(shù)呈極顯著正相關；P、Chao1和ACE呈極顯著正相關；K與Shannon指數(shù)呈顯著負相關。

3 討論

3.1 混合凋落葉對養(yǎng)分含量和養(yǎng)分釋放的影響

凋落葉分解過程中養(yǎng)分元素會發(fā)生變化，其元素遷移模式公認有3種：(1)淋溶-富集-釋放；(2)富集-釋放；(3)直接釋放[14]。各處理凋落葉中C、N、K呈直接釋放狀態(tài)，P呈淋溶-富集-釋放狀態(tài)，這與已有研究結果相似[15]。根據(jù)本課題組對20年華北落葉松人工林凋落葉的養(yǎng)分釋放率發(fā)現(xiàn)，與本試驗結果相比，華北落葉松及其混合凋落葉的C和N釋放率均相對較高，可能是由于林齡不同導致[16]。凋落葉分解是以C元素為主導的物質循環(huán)過程。C組成了植物體內大部分的干物質，以碳水化合物形式存在，在淋溶作用下，C呈凈釋放[17]。經過720 d的分解，C含量整體上呈下降趨勢。分解360 d后，與混合凋落葉相比，L的C含量維持在相對較高的水平且C的釋放率較低，說明受混合凋落葉的影響，C含量釋放加快，混和凋落葉對C的釋放有促進作用，與已有研究結果相似[18]。N是組成蛋白質和氨基酸的基本元素，微生物可以通過氨化和硝化作用將凋落葉中的N轉化為植物可以吸收的離子狀態(tài)。N含量雖表現(xiàn)為上升趨勢，但為直接釋放模式，這與許多研究結果產生差異；可能存在以下原因，凋落葉分解過程中N元素固定與釋放的模式與凋落葉初始N含量有關，養(yǎng)分釋放是養(yǎng)分含量和凋落葉干質量共同作用的結果[19-20]。本研究中初始N含量較高，導致N為直接釋放模式；P是組成植物遺傳物質的重要元素，P的累積和釋放與P含量密切相關。分解初期，P呈現(xiàn)淋溶狀態(tài)，P元素含量下降。分解過程中，P作為限制微生物生長的養(yǎng)分元素而被固定，因此P表現(xiàn)為富集狀態(tài)。當P含量升高到不在限制微生物生長時會被微生物礦化，導致P元素被釋放；K在植物體內多以離子形式存在，易受到淋溶作用呈釋放狀態(tài)，各處理的K含量整體上呈下降趨勢；LB、LQ和LBQ的pH呈緩慢增加的趨勢，L則相反。凋落葉在微生物的分解作用下，產生富里酸水溶液，凋落葉呈酸性[21]。凋落葉含鹽基、灰分較多，對酸性物質起到一定的中和作用，導致土壤pH先降低再緩慢增加。L的pH顯著低于LB、LQ和LBQ，說明凋落葉混合能夠改善凋落葉分解過程中的酸化程度。

3.2 細菌群落結構變化特征

相關研究表明，在分解過程中，凋落葉營養(yǎng)元素和微環(huán)境的變化會引起微生物群落結構的改變[22]。分解初期，土壤優(yōu)勢細菌門為放線菌門、藍細菌門、擬桿菌門和放線菌門。分解中后期,土壤優(yōu)勢細菌門為放線菌門、擬桿菌門和放線菌門，藍細菌門相對豐度顯著降低，說明分解過程中細菌群落發(fā)生了演替[23]。分解前期，不同處理的優(yōu)勢細菌門無顯著差異；從分解300 d開始，不同混合凋落物的變形菌門和擬桿菌門相對豐度差異顯著。隨著分解時間增加，不同混合凋落葉的變形菌門和藍細菌門相對豐度均減少；凋落葉的放線菌門相對豐度均呈上升趨勢。L的擬桿菌門相對豐度呈波動性上升趨勢，LB、LQ和LBQ的擬桿菌門相對豐度呈先升高后降低，產生該差異的原因可能是由于細菌作為異養(yǎng)生物，擬桿菌門能夠直接參與木質纖維素的降解[24]。不同細菌群落對養(yǎng)分和環(huán)境的需求不同，從而產生了不同的生長策略，導致細菌群落隨分解時間的變化響應不同[25]。分解過程中，不同混合凋落葉的細菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢。這是因為隨著凋落物分解，C、N、K等營養(yǎng)物質大量釋放，供給微生物生長，導致細菌群落多樣性和豐富度增加[26]。有研究表明，細菌在凋落葉分解后期起主要作用[27]。分解過程中，LB、LQ和LBQ的細菌群落豐富度指數(shù)高于L,可能是因為混合凋落物為細菌群落提供的分解底物種類也越多，有利于多種不同類型的細菌群落的生長，最終使得LB、LQ和LBQ的細菌豐富度高于L[28]。

3.3 凋落葉微生物與養(yǎng)分的關系

養(yǎng)分是微生物生長的物質條件，養(yǎng)分的變化影響微生物的群落結構。有研究表明，pH和全氮對微生物群落結構有重要影響，與本研究結果一致[29]。pH與優(yōu)勢細菌門(變形菌門、藍細菌門、擬桿菌門和放線菌門)、細菌多樣性指數(shù)均存在顯著相關，對細菌群落影響較大；凋落葉為細菌生長提供氮源，N通常在凋落葉分解過程中成為限制因素，影響微生物的群落變化[30]。在本研究中N與優(yōu)勢細菌門(變形菌門、藍細菌門和放線菌門)、細菌多樣性指數(shù)均存在顯著相關。pH和N可能是限制細菌群落結構和凋落葉分解的主要因素。

4 結論

在凋落葉720 d的分解過程中，不同混合凋落葉養(yǎng)分變化趨勢一致，N和P含量整體上呈上升趨勢，C和K含量變化趨勢則相反，pH呈先下降后上升趨勢。混合凋落葉(LB、LQ和LBQ)的C和K釋放率均高于華北落葉松凋落葉，N和P釋放率則相反。華北落葉松凋落葉pH顯著低于混合凋落葉(LB、LQ和LBQ)。C、N、K為直接釋放狀態(tài)，P為淋溶-富集-釋放狀態(tài)。華北落葉松、白樺和蒙古櫟凋落葉混合分解可以促進華北落葉松凋落葉中C的釋放，但對N的釋放有一定的抑制作用。凋落葉分解初期，不同處理凋落葉的優(yōu)勢細菌門為變形菌門、藍細菌門、擬桿菌門和放線菌門；分解300 d后，優(yōu)勢細菌門為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門。在凋落物分解過程中，變形菌門和藍細菌門相對豐度降低，擬桿菌門和放線菌門相對豐度升高。對于4種處理的凋落葉來說，不同分解時間的細菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)存在顯著差異。細菌多樣性指數(shù)和豐富度呈上升趨勢。凋落葉C含量與放線菌門呈極顯著負相關(P<0.01)；pH和N含量與細菌多樣性指數(shù)呈極顯著正相關(P<0.01)，P與Chao1和ACE存在極顯著正相關(P<0.01)；K與Shannon指數(shù)存在顯著負相關(P<0.05)。華北落葉松、白樺和蒙古櫟凋落葉混合可以提高部分C釋放率，改善凋落葉酸堿度，提高分解過程中細菌多樣性。