肌少癥以骨骼肌力量及質(zhì)量下降為特征。除年齡因素外，骨骼肌細胞去神經(jīng)支配、線粒體功能障礙、炎癥反應、營養(yǎng)障礙、廢用、肥胖以及內(nèi)分泌改變等多種原因均可導致肌少癥的發(fā)生。肥胖引起的異位脂肪沉積會導致骨骼肌生物功能改變，包括胰島素抵抗、線粒體功能障礙、氧化應激和炎癥等。這些改變進一步加劇了骨骼肌的丟失和身體功能障礙。患有肌肉減少癥的老年人更容易發(fā)生跌倒、骨折等不良事件，生活質(zhì)量隨之下降，死亡風險顯著增高。肥胖引起的脂肪沉積會增加代謝性疾病、心血管疾病、阿爾茨海默病、抑郁癥和癌癥的患病風險。研究發(fā)現(xiàn)，老年肌少性肥胖人群與單純少肌癥或肥胖患者比較，患代謝綜合征的風險明顯增加。臨床研究發(fā)現(xiàn)肌少性肥胖患者的疾病負擔比只患有肥胖癥或肌少癥患者更加嚴重。目前關(guān)于肌少性肥胖發(fā)生機制的探究也引起學界的廣泛關(guān)注。

水庫在遭遇防洪標準以內(nèi)洪水時，應該考慮下游河道安全，實行控泄，使下泄流量小于等于河道安全泄量。因為橡膠壩未安裝，防洪能力不足，而且下游河道行洪能力較差，當來水量大于下游河道現(xiàn)狀承受能力時，水庫無法使泄量小于河道過流能力。如果降低汛限水位，增大水庫防洪能力，興利用水將受到影響。

Mibefradil是一種選擇性T型鈣通道拮抗劑。T型鈣通道是一種激活電位低、失活快的電壓門控通道，參與受精、神經(jīng)元放電、激素分泌和肌纖維發(fā)育等多種生理過程。研究發(fā)現(xiàn)T型鈣通道在融合前表達于成肌細胞，在終末分化成肌細胞的鈣離子流動中起重要作用。高脂飲食會引起肌肉內(nèi)脂肪過度沉積，引起肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制T型鈣通道可以抵抗高脂飲食誘導的體質(zhì)量增加。也有研究顯示mibefradil可以改善糖尿病小鼠的糖代謝；mibefradil可以抑制饑餓誘導的心肌細胞自噬。但目前關(guān)于mibefradil對肥胖小鼠骨骼肌的影響尚未見報道，因此，本研究目的在于探討mibefradil對肥胖小鼠骨骼肌的影響及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑及儀器

Mibefradil（MCE），P62 抗體（Abways），LC3 B抗體（Bimake），GAPDH抗體（武漢三鷹公司），山羊抗兔Ig G-HRP（北京中杉金橋公司）山羊抗小鼠Ig G-HRP（北京中杉金橋公司），電子抓力儀（cat.47200,Ugo Basil），雙 能X 線吸光測定儀器（Discovey A，HOLOGIC），甘油三酯試劑盒（南京建成），總膽固醇試劑盒（南京建成），蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（武漢賽維爾生物公司）。

1.2 實驗動物及分組

15只SPF級C57BL/6雄性小鼠（浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），將小鼠隨機分成3組（5只/組）：普通飲食組（Control組，普通飲食，能量比為10%脂肪、20%蛋白質(zhì)和70%碳水化合物），高脂飲食組（HFD組，高脂飲食，能量比為60%脂肪、20%蛋白質(zhì)和20%碳水化合物），高脂飲食加mibefradil 干預組（HFD+Mibe組）。所有動物實驗均按照標準動物護理規(guī)程進行。實驗過程中小鼠分籠飼養(yǎng)，5只/籠，自由飲水、飲食，飼養(yǎng)在恒溫22±2 ℃、相對濕度為60%的環(huán)境中，每周定時清理鼠籠、更換墊料，添加飼料，12 h明暗周期。本研究動物實驗過程已通過重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會審查。

1.3 給藥方法

肌肉質(zhì)量和肌纖維大小由肌纖維內(nèi)蛋白質(zhì)合成與分解之間的平衡調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)過度分解會造成蛋白質(zhì)平衡失調(diào)，引起肌肉萎縮。自噬在機體的生理和病理過程中都能見到，基礎水平的自噬能清除受損細胞器和異常蛋白，對細胞是一種保護性作用，但也有研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細胞過度自噬，會導致急性心血管事件的發(fā)生。間歇性低氧干預小鼠會導致自噬被過度激活，最終導致膈肌萎縮，表明自噬的過度激活也會引起自噬性細胞死亡甚至加速疾病發(fā)展。LC3和P62是常用的自噬檢測標志物，LC3蛋白有兩種存在形式LC3I和LC3 Ⅱ，LC3I主要在胞漿分布，自噬激活過程中，LC3I與磷脂酰乙醇胺共價結(jié)合成為LC3 Ⅱ，而后者是自噬小體的主要成分，LC3 Ⅱ的表達量與自噬體的數(shù)量成正相關(guān)，LC3 Ⅱ表達水平升高提示自噬激活，P62分子參與連接自噬體膜與靶分子或細胞器，并隨自噬體降解而降解，P62表達水平升高提示自噬活動降低。因此本研究首先通過免疫熒光技術(shù)檢測各組小鼠骨骼肌細胞中LC3的變化，結(jié)果顯示：HFD組和HFD+Mibe組的LC3均勻分布于細胞漿，呈淺淡紅色熒光，表明主要以LC3I的形式存在，自噬未被激活；而在HFD組檢測到不同程度的明亮斑點狀紅色熒光，表明LC3I轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ，自噬被激活。我們進一步檢測LC3 Ⅱ和P62蛋白在各組中的表達水平，評價高脂飲食和mibefradil對骨骼肌自噬的影響，結(jié)果顯示：肥胖小鼠肌肉組織中LC3 Ⅱ蛋白的表達水平較普通飲食組小鼠升高，P62蛋白表達水平較普通飲食組小鼠降低，表明肥胖小鼠肌肉組織中自噬活動增強，因此我們推測高脂誘導的肥胖小鼠會出現(xiàn)過度自噬，引起肌細胞蛋白質(zhì)分解加劇，造成蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，進而出現(xiàn)肌肉萎縮，抓力降低。給予mibefradil干預后，觀察到肥胖小鼠的抓力增強，肥胖小鼠肌肉組織中LC3 Ⅱ蛋白表達水平降低，P62蛋白表達水平升高。自噬的調(diào)控有多種信號通路參與，AKT/mTOR信號通路是其中之一，AKT 作為mTOR的上游分子，能正向調(diào)節(jié)mTOR的表達，mTOR是自噬主要的負向調(diào)節(jié)蛋白，失活后可導致自噬水平升高。但mibefradil介導的自噬是否與AKT/mTOR信號通路有關(guān)未見報道，本研究通過Western blot檢測AKT/mTOR信號通路的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Con組小鼠相比，HFD組小鼠肌肉中p-AKT和p-mTOR表達降低；肥胖小鼠進行mibefradil干預后，p-AKT和p-mTOR的表達升高，表明mibefradil可能通過激活AKT/mTOR信號通路抑制過度自噬從而改善肥胖小鼠的肌肉功能障礙。

1.4 小鼠前肢抓力的測量

HE染色的腓腸肌橫切面顯示，Control組和HFD+Mibe組小鼠肌纖維呈不同形狀的塊狀，排列緊密；而高脂組肌纖維排列疏松。HFD組平均肌纖維橫截面積低于Control組（＜0.05），而HFD+Mibe組平均肌纖維橫截面積較HFD組升高（＜0.05，圖2）。

1.5 雙能X射線吸收測定（DXA）試驗

通過相對抓力及抓力/體質(zhì)量評估肌肉的力量，結(jié)果顯示，與Con組相比，HFD組相對抓力下降，與HFD組相比，HFD+Mibe組小鼠相對抓力以及后肢肌肉比率明顯升高（＜0.05）。脂代謝指標檢測顯示，與Con組相比，HFD組甘油三酯和總膽固醇升高，與HFD組相比，HFD+Mibe組小鼠甘油三酯和總膽固醇明顯下降（＜0.05，表1）。

與Control組小鼠相比，HFD組小鼠體質(zhì)量增加明顯（圖1），HFD組小鼠肥胖度均超過20%，平均36.1%，高脂誘導肥胖小鼠模型成功。HFD+Mibe組與HFD組的體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學意義，mibefradil干預能降低肥胖小鼠的體質(zhì)量增加（＜0.05，表1）。

1.6 組織制備和組織學分析

喂養(yǎng)13周后，所有小鼠經(jīng)水合氯醛聯(lián)合戊巴比妥鈉進行深度麻醉，通過摘眼球取血。然后，所有樣品進行離心保留血清（4 ℃，3000 g，10 min）。用酶標儀通過GPO-PAP法測定甘油三酯和總膽固醇水平。處死小鼠，取出腓腸肌放入40 g/L多聚甲醛中性溶液中固定24 h。然后用石蠟包埋后，切成4～6 μm厚的切片。切片用進行熒光以及蘇木精伊紅染色，然后在顯微鏡下觀察記錄。用Image J軟件進行分析。

1.7 Western blot

提取各組肌肉組織總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。等量上樣至SDS-PAGE凝膠中，電泳電壓設置為60 V 出孔后轉(zhuǎn)120 V，100 min。蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，快速封閉液室溫封閉1 h，將膜分別置于溶有LC3 B、P62 和GAPDH 的一抗稀釋液中4 ℃過夜。第2天用TBST洗膜3次，10 min/次，將膜轉(zhuǎn)入已稀釋的二抗中室溫1 h，再次用TBST 洗膜3 次，10 min/次。ECL顯影，調(diào)節(jié)Bio-1D軟件（VilberLourmat，法國）凝膠成像儀的參數(shù)進行曝光，采圖。Image J軟件分析，測定并計算出LC3 Ⅱ、P62和GAPDH條帶灰度值比值，進行統(tǒng)計學分析。

1.8 統(tǒng)計分析

通過間接免疫熒光技術(shù)在熒光顯微鏡下進行觀察，LC3I主要分布在細胞漿，自噬激活后LC3I共價結(jié)合磷脂酰乙醇胺變?yōu)長C3Ⅱ，在免疫熒光中表現(xiàn)為彌散分布的LC3變?yōu)辄c狀聚集分布。細胞核顯藍色熒光，LC3顯紅色熒光（圖3）。HFD組和HFD+Mibe組的LC3均勻分布于細胞漿，呈淺淡紅色熒光，即主要以LC3I的形式存在；而在HFD組檢測到不同程度的明亮斑點狀紅色熒光。HFD組與Control組、HFD+Mibe組與HFD組熒光強度差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05，圖3）。

2 結(jié)果

2.1 Mibefradil對肥胖小鼠體質(zhì)量、肌肉質(zhì)量、相對抓力和脂代謝指標的影響

2.4 OSCE考試方案考生反饋 考試結(jié)束后，共發(fā)放自設調(diào)查問卷162份，回收162份，回收率100%。61.3%的考生對考試所提供的場所、設施及考場服務滿意。21.4%的考生在考試之前對OSCE有所了解，45.12%的考生認為本次OSCE考試人文護理溝通考站最難，但能夠考查自身的溝通交流能力。52.3%的考生認為臨床思維考站最簡單。41.5%的考生認為SP能夠形象的模擬臨床患者。78.3%的考生認為考試總體難度一般，有助于促進臨床技能及理論知識的掌握。從調(diào)查問卷可以看出，大部分考生認可OSCE考試，認為考核方式新穎、客觀，能夠促進理論知識的學習及臨床技能的掌握，值得推廣。

小鼠用4%水合氯醛（0.1 mL/100 g）聯(lián)合戊巴比妥鈉麻醉后俯臥在掃描儀床上。掃描結(jié)束后，記錄小鼠體質(zhì)量和瘦質(zhì)量，并計算出小鼠后肢肌肉比率。

2.2 Mibefradil對肥胖小鼠骨骼肌肌纖維橫截面積的影響

將小鼠前肢放置在電子抓力儀的感應桿上，待小鼠緊緊抓住感應桿后，拉住小鼠尾巴并向后拉，直到松開為止，記錄小鼠的抓力。重復測量3次，取最大值為小鼠的絕對抓力，測量1次/周。同時使用電子體重稱測量小鼠體質(zhì)量。

2.3 各組小鼠肌肉組織LC3免疫熒光

實驗數(shù)據(jù)由GraphPad Prism 8、Image J 和SPSS 26.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料均采用均數(shù)±標準差表示，用重復測量方差分析比較小鼠體質(zhì)量及抓力的變化。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用最小顯著差異法（LSD法），＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有實驗均獨立重復3次。

2.4 Mibefradil對肥胖小鼠P62、LC3 Ⅱ蛋白表達水平以及AKT/mTOR信號通路的影響

HFD 組中P62 蛋白表達水平低于Control 組和HFD+Mibe組（＜0.05）；HFD組中LC3 Ⅱ蛋白表達水平高于Control組和HFD+Mibe組（＜0.05，圖4）。與Control組相比，HFD 組信號通路 蛋白p-AKT 和pmTOR 表達下降；給與mibefradil 干預后p-AKT 和pmTOR表達升高（＜0.05，圖5）。

3 討論

研究表明，肥胖引起血液游離脂肪酸濃度升高，此時骨骼肌的脂肪酸攝入增加而氧化能力下降，因此脂肪在骨骼肌中大量沉積，造成線粒體脂質(zhì)負荷增加，骨骼肌的胰島素敏感性改變，出現(xiàn)胰島素抵抗，進而引起肌肉結(jié)構(gòu)改變。甘油三酯、總膽固醇、血糖、體質(zhì)量指數(shù)等代謝危險因素均與肌少癥相關(guān)。本研究顯示，給予高脂喂養(yǎng)的小鼠體質(zhì)量增加明顯，相對抓力降低，后肢肌肉比率下降，通過HE染色檢測進一步發(fā)現(xiàn)骨骼肌肌纖維平均橫截面積減小。表明高脂喂養(yǎng)的小鼠會出現(xiàn)肥胖并伴有肌肉質(zhì)量減少和功能障礙。對肥胖小鼠進行mibefradil干預后，結(jié)果顯示小鼠體質(zhì)量減輕，相對抓力、后肢肌肉比率及肌纖維橫截面積升高，同時對各組小鼠的脂代謝指標進行檢測發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)的小鼠甘油三酯和總膽固醇濃度較普通飲食小鼠增高，而HFD+Mibe 組甘油三酯和總膽固醇濃度較HFD 組低，表明mibefradil干預可以減輕肥胖引起的肌肉損失和功能障礙，可能與抵抗高脂誘導的肥胖和改善脂代謝有關(guān)。有研究報道，mibefradil可以抑制饑餓誘導的心肌細胞自噬，結(jié)合課題組前期發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的小鼠肌肉中LC3 Ⅱ蛋白表達水平升高，我們推測自噬可能在該過程中發(fā)揮重要作用。

HFD+Mibe組給予mibefradil 30 mg/（kg·d）（用生理鹽水溶解）干預2周，普通飲食組及高脂飲食組給予等體積生理鹽水，給藥方式均為腹腔注射，分早晚兩次給藥。

ICMI還有一些附屬的研究組和國際或跨國的組織，如數(shù)學史與數(shù)學教學的關(guān)系國際研究小組（簡稱HPM）、國際數(shù)學教育心理學研究小組（簡稱PME）、數(shù)學建模和應用國際研究小組（簡稱ICTMA）、國際數(shù)學競賽聯(lián)盟（簡稱WFNMC）、國際數(shù)學教學研究與改進研究會（簡稱CIEAEM）等．

線上線下混合教學培訓模式就是要把傳統(tǒng)的線下學習方式（面授教學 ）和線上學習方式（數(shù)字化或網(wǎng)絡化學習）的優(yōu)勢結(jié)合起來。

綜上所述，mibefradil可抵抗高脂飲食誘導的體質(zhì)量增加，改善肥胖小鼠肌肉質(zhì)量與功能，其作用機制可能與改善脂代謝和抑制AKT/mTOR信號通路介導的自噬有關(guān)，但mibefradil對肌肉產(chǎn)生的作用及相關(guān)機制十分復雜，仍有待進一步研究。

體育作為人的實踐活動，對體育的研究，就是對人的系列問題的追問與省思。探索體育與人存在的關(guān)系，應從人的本質(zhì)屬性入手。馬克思人學存在論解釋了人的存在問題，人在感性存在、現(xiàn)實生存、實踐發(fā)展與完整追求中與體育建立多維度聯(lián)系。體育在“感性的人”中出場，以“現(xiàn)實的人”為起點，關(guān)照“實踐的人”的價值，終極回歸到“全面發(fā)展的人”，體育促進人的全面發(fā)展，使人得以完整，成為哲學文化的必要補充，是省思人之為人的價值所向。本文以馬克思人學存在論為理論依據(jù)，對體育與人的關(guān)系進行了多維省思。