曲 東燕 飛劉欣瑞彭 雪張 羽秦公偉

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723000;2.陜西理工大學(xué) 陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,果樹(shù)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)研究所,陜西漢中 723001)

獼猴桃為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl.)木質(zhì)藤本果樹(shù),其果實(shí)富含膳食纖維、維生素C 等益于人體健康的功能營(yíng)養(yǎng)成分,且經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高,具有良好的市場(chǎng)發(fā)展前景[1]。目前,我國(guó)獼猴桃的栽培種植面積和產(chǎn)量越居世界第一。然而由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonas syringaepv.actinidiae,Psa)引起的獼猴桃潰瘍病正嚴(yán)重影響著中國(guó)及世界各國(guó)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2],該病害傳播速度快、傳播途徑多樣、防治難度極大,病原菌主要通過(guò)危害獼猴桃樹(shù)干、枝條、葉片及花的生長(zhǎng)發(fā)育,導(dǎo)致獼猴桃果實(shí)大量減產(chǎn)甚至毀園,因此激活植物的固有防御系統(tǒng)提高獼猴桃抗病能力或選育獼猴桃抗病品種是降低獼猴桃潰瘍病危害的有效辦法。目前有關(guān)獼猴桃抗病機(jī)理的研究報(bào)道較少,因此挖掘獼猴桃抗病相關(guān)的關(guān)鍵基因,對(duì)于了解獼猴桃的抗病機(jī)制具有重要作用,對(duì)于獼猴桃抗病育種的工作具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

病程相關(guān)基因非表達(dá)子1(Nonexpressor of Pathogenesis-Related genes,NPR1)隸屬于NPR1基因家族[3],是水楊酸(Salicylic acid,SA)介導(dǎo)的植物系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic acquired resistance,SAR)以及茉莉酸(Jasmonic jcid,JA)和乙烯(Ethylene,ET)介導(dǎo)的植物誘導(dǎo)獲得抗性(Induced systemic resistance,ISR)的一個(gè)主要調(diào)控因子,是植物多種抗病性信號(hào)傳導(dǎo)途徑的交叉點(diǎn)[4]。當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí),NPR1 特異性結(jié)構(gòu)域能夠與WRKY 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合激活植物免疫系統(tǒng),作用于相關(guān)抗病基因,使基因表達(dá)水平上調(diào),從而增強(qiáng)植物抗病能力[5]。NPR1基因包含一個(gè)N-末端BTB/POZ結(jié)構(gòu)域、一個(gè)中心錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域ANKs(Ankyrin repeats)和一個(gè)C-末端反式激活結(jié)構(gòu)域,其中BTB-POZ 結(jié)構(gòu)域參與NPR1蛋白的同源二聚的形成[4,6-7],而ANKs與冗余的TGACG 序列元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TGA2、TGA5和TGA6相互作用共同激活植物抗性基因的表達(dá),從而提高植物抗病能力[8-10]。NPR1基因及其同源基因已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsis thaliana)[11-12]、水稻(Oryza sativa)[13-14]、蘋(píng)果(Malus domestica)[15]、葡萄(Vitis vinifera)[16-17]等多種植物中被分離克隆,過(guò)表達(dá)At-NPR1基因的水稻中發(fā)現(xiàn)當(dāng)水稻感染白葉枯病、稻瘟病時(shí),At NPR1基因表達(dá)量明顯提高[18];過(guò)表達(dá)At NPR1基因的小麥提高了其對(duì)鐮刀菌赤霉病的抗病能力[12],在水稻中過(guò)表達(dá)Os NPR1基因后,不僅提高了水稻白葉枯病抗病性[14],而且提高了水稻對(duì)草食動(dòng)物的敏感性。在雙子葉植物中也發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)At NPR1基因的柑橘加強(qiáng)了柑橘對(duì)黃龍病、潰瘍病的耐受[19],在蘋(píng)果中過(guò)表達(dá)Malus NPR1基因,蘋(píng)果中PR 基因被激活,提高了蘋(píng)果樹(shù)對(duì)細(xì)菌和真菌病原菌的抗性[15],NPR1基因參與了植物免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。

越來(lái)越多的研究證據(jù)表明NPR1是SA 的受體[20]。在擬南芥中NPR1基因是SA 誘導(dǎo)PR(Pathogenesis-Related,PR)基因表達(dá)和抵抗病原體所必需的[4]。當(dāng)植物未感染病原菌時(shí),SA 水平較低,NPR1主要存在于通過(guò)分子間二硫鍵形成的低聚物中;當(dāng)植物感染病原菌后,SA 水平升高,NPR1低聚物被還原為單體以響應(yīng)病原體感染期間SA 積累增加引起的氧化還原變化[21]。

鑒于NPR1蛋白在植物防御反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用,而獼猴桃NPR1基因在抗病中的功能研究目前報(bào)道較少,故本研究選用高感病品種‘紅陽(yáng)’和抗病品種‘徐香’獼猴桃為材料[22],克隆Ac NPR1基因序列,利用生物信息學(xué)方法對(duì)Ac-NPR1蛋白的理化性質(zhì),二、三級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位等特性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,用DNAMAN 和MEGA 7.0 進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)和進(jìn)化關(guān)系的分析與構(gòu)建。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析獼猴桃Ac NPR1基因組織表達(dá)情況,以及獼猴桃潰瘍病致變種(Psa)、水楊酸加病原菌(SA+Psa)處理不同時(shí)間基因的表達(dá)量變化,旨在為初步明確獼猴桃Ac NPR1基因在抗病中的作用機(jī)制提供初步的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

試驗(yàn)材料源自陜西省漢中市城固縣自然好獼猴桃專(zhuān)業(yè)合作社獼猴桃園,移栽于陜西理工大學(xué)資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的嫁接2 a生高感病品種‘紅陽(yáng)’獼猴桃(Actinidia chinensisvar.chinensis‘Hongyang’)、抗病品種‘徐香’(Actinidia deliciosavar.‘Xuxiang’)獼猴桃幼苗,試驗(yàn)于2021年3月進(jìn)行。

分別取‘紅陽(yáng)’獼猴桃和‘徐香’獼猴桃的莖、花、葉片,裝入無(wú)菌的樣品管內(nèi)標(biāo)記,放入液氮速凍,并保存于-80 ℃冰箱備用。將‘紅陽(yáng)’獼猴桃和‘徐香’獼猴桃幼苗分為3組,噴灑水為第1組(對(duì)照組,CK)、先水對(duì)葉片進(jìn)行噴灑,1周后用丁香假單胞桿菌獼猴桃致變種(Pseudomonas syringaepv.actinidiae,Psa)菌液(陜西理工大學(xué)資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存菌種,Genbank 序列登錄號(hào) MW404385,菌液濃度108cfu/m L)進(jìn)行噴灑處理為第2組(Psa)、先用水楊酸(2.5 mmol/L)對(duì)葉片進(jìn)行噴灑預(yù)處理,1周后用丁香假單胞獼猴桃致變種液噴灑葉片為第3組(SA+Psa),預(yù)處理方法參照文獻(xiàn)[23];處理后分別在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣,裝入無(wú)菌的樣品管內(nèi),用記號(hào)筆標(biāo)記采取樣品的處理和時(shí)間,立即放入液氮中進(jìn)行速凍,轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存待用,每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.2 RNA提取及cDNA合成

采用TransZol Plant 試劑(TransGen Biotech)提取不同處理時(shí)期樣品RNA,經(jīng)電泳檢測(cè)(1%瓊脂糖凝膠)合格,Thermo NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定各樣品的濃度以及OD260/OD280、OD260/OD230值;后 反 轉(zhuǎn) 錄 為cDNA(TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix,TransGen Biotech)并保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 獼猴桃Ac NPR1 基因的克隆及測(cè)序

根據(jù)獼猴桃數(shù)據(jù)庫(kù)(http://kiwifruitgenome.org/)中注釋為Regulatory protein NPR1蛋白基因的序列(編號(hào)Acc15406),利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物,Ac NPR1基因上下游引物見(jiàn)表1。分別為ATGGCAAATTCTGC 和TTACGACAATTTTCTAATCTTGTAATTC。以Psa菌液處理12 h的獼猴桃葉片cDNA 為模板,利用高保真酶進(jìn)行PCR,退火溫度為60 ℃,PCR 產(chǎn)物檢測(cè)(1%瓊脂糖凝膠)、膠回收(E.Z.N.A.○RGel Extraction Kit)、載體連接等方法參照本實(shí)驗(yàn)室方法[24],選取陽(yáng)性克隆送北京擎科生物有限公司(西安測(cè)序部)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 AcNPR1 序列的生物信息學(xué)分析

利用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線分析開(kāi)放閱讀框,通過(guò)SMART 在線分析Ac NPR1蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域(https://smart.embl-heidelberg.de/);利用DNAMAN 9.0 軟件對(duì)獼猴桃Ac NPR1 蛋白質(zhì)與其他物種NPR1 蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì)分析;使用Clutsal Xv1.83 程序進(jìn)行多序列比對(duì),然后將比對(duì)結(jié)果輸入到MEGA 7.0 軟件中,利用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),Bootstrap 值 取1 000 次;利 用ExPASy-ProtParam tool 在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析;利用Expasy中的ProtScale 在線軟件(http://web.expasy.org/protscale/)分析Ac NPR1蛋白質(zhì)的親水性和疏水性;利用NetPhos v3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線工具對(duì)獼猴桃Ac NPR1蛋白進(jìn)行潛在的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析;利用SOPMA 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)得 到Ac NPR1 可能的二級(jí)結(jié)構(gòu);利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org)進(jìn)行同源建模,構(gòu)建Ac-NPR1的三級(jí)結(jié)構(gòu)域模型;通過(guò)TMPred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)預(yù)測(cè)該蛋白跨膜區(qū)域;通過(guò)CELLO2GO 在線分析工具(http://cello.life.nctu.edu.tw/cello2go/)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞的可能定位。

1.5 AcNPR1 基因?qū)崟r(shí)熒光定量分析

熒光定量反應(yīng)程序及反應(yīng)體系按照熒光定量試劑盒(Perfectstart Green qPCR Supermix,全式金生物,北京)說(shuō)明完成,采用美國(guó)ABI Step One-Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。熒光定量上、下游引物分別為5′-CACAAGGCTTAGACTCAGA-3′和5′-CAAGCACTTCAGACACAAC-3′。內(nèi)參基因上下游引物分 別 為5′-CTGTGAAACTGCGAATGGCTC-3′和5′-TTCCAGAAGTCGGGGTTTGT-3′。采用3次生物學(xué)重復(fù),不同材料中目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT方法計(jì)算。利用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ac NPR1 基因克隆以及序列分析

以病原菌Psa處理12 h后的‘紅陽(yáng)’、‘徐香’獼猴桃葉片為試驗(yàn)材料,提取總RNA 反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,克隆至T 載體并送樣測(cè)序,得到‘紅陽(yáng)’Ac NPR1基因序列全長(zhǎng)為1 770 bp(Gen-Bank登錄號(hào)為MW881148)(圖1-A)。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)‘徐香’Ac NPR1基因序列只有個(gè)別堿基與‘紅陽(yáng)’不同(未列出)。本研究進(jìn)一步對(duì)‘紅陽(yáng)’序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,利用NCBI 網(wǎng)站中ORF Finder在線工具分析該序列開(kāi)放閱讀框,發(fā)現(xiàn)該基因序列開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為1 770 bp,可編碼589個(gè)氨基酸;利用SMART 分析該蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域,結(jié)果表明在第64位至第190位,第266位至361位,第371位至575位區(qū)域間分別含有N 端保守的BTB-POZ、錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域An Ks、C端NPR1_like_C 植 物NPR1 蛋 白 所 共有的保守結(jié)構(gòu)域(圖1-B)。

圖1 ‘紅陽(yáng)’AcNPR1 基因PCR 擴(kuò)增(A)和AcNPR1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(B)Fig.1 The PCR amplified product of AcNPR1 gene(A)and the conserved domain of AcNPR1 protein(B)in‘Hongyang’

2.2 AcNPR1蛋白的理化性質(zhì)及磷酸化位點(diǎn)分析

利用在線工具ProtParam 分析Ac NPR1基因編碼的蛋白分子式為C2895H4639N799O889S29,分子質(zhì)量為65 792.24 ku,理論等電點(diǎn)(pI)為6.27,其中異亮氨酸和絲氨酸的使用頻率最高,均占所有氨基酸的10.9%;然后依次為丙氨酸,含量最少的為色氨酸,占所有氨基酸的0.2%。Ac NPR1蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為43.75;總平均親水性為-0.245,脂肪系數(shù)為89.56。ProtScale在線軟件分析蛋白質(zhì)的親水性和疏水性,發(fā)現(xiàn)該蛋白為親水性蛋白(圖2-A);利用NetPhos對(duì)該蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)Ac NPR1蛋白均具有絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Try)磷酸化位點(diǎn)(圖2-B)。通過(guò)TMPred 預(yù)測(cè)該蛋白跨膜區(qū)域,跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示獼猴桃Ac NPR1蛋白可能為一個(gè)跨膜蛋白,分別在第5～26、115～134、160～182、193～216個(gè)氨基酸處含有4個(gè)從內(nèi)到外的跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2-C)。

2.3 AcNPR1蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)特征和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

通過(guò)SMOPA 數(shù)據(jù)庫(kù)得到二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,AcNPR1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由α螺旋、β折疊、延伸鏈、無(wú)規(guī)則卷曲所組成,占據(jù)比例分別為53.14%、3.57%、7.47%、35.82%(圖3-A);其中α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲所占比例較高,為其主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。通過(guò)SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)Ac NPR1蛋白質(zhì)三級(jí)空間結(jié)構(gòu)模型,含有α螺旋至少35個(gè),β折疊至少7個(gè),無(wú)規(guī)則卷曲至少25個(gè),主要是以螺旋為基本結(jié)構(gòu)單元形成的平行或反向平行螺旋結(jié)構(gòu)(圖3-B)。利用CELLO2GO 在線分析工具對(duì)Ac NPR1蛋白亞細(xì)胞的可能定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示,獼猴桃Ac NPR1 蛋白亞細(xì)胞定位最可能位于細(xì)胞核(表1)。

表1 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Table 1 Prediction of AcNPR1 protein in‘Hongyang’

圖3 ‘紅陽(yáng)’獼猴桃AcNPR1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)、三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of secondary(A)and tertiary structure(B)of AcNPR1 protein in‘Hongyang’

2.4 AcNPR1 基因編碼的氨基酸序列的比對(duì)分析

利用DNAMAN 7.0軟件,將克隆得到的‘紅陽(yáng)’獼猴桃Ac NPR1基因編碼的氨基酸序列與在NCBI網(wǎng)站上獲取其他物種的NPR1氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)(圖4),結(jié)果表明獼猴桃Ac NPR1氨基酸序列與茶樹(shù)(XP_028062623.1)、葡萄(XP_002274045.1)、銀白楊(XP_034927243.1)、酸棗(XP_015882955.1)、煙草(XP_016442273.1)和胡桃(XP_018835840.1)的NPR 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域一致性較高。在N 端包含BTB_POZ結(jié)構(gòu)域、Ank2保守域,C 端有NPR1_Like_C 結(jié)構(gòu)域,與大多數(shù)物種NPR1 蛋白序列相似,蛋白相似性分別為83.94%、79.63%、78.10%、76.27%、75.62%和74.28%。

圖4 ‘紅陽(yáng)’獼猴桃AcNPR1 與不同物種NPR1 轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列多重比對(duì)Fig.4 Multiple alignment of amino acid sequences of AcNPR1 in‘Hongyang’and NPR1 transcription factors in different species

采用 MEGA 7.0 軟件分析8 個(gè)物種的NPR1蛋白序列與‘紅陽(yáng)’獼猴桃Ac NPR1 蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖5),結(jié)果顯示NPR1蛋白被大致分為兩組,‘紅陽(yáng)’獼猴桃Ac NPR1蛋白與銀白楊、簸箕柳、大豆、葡萄、酸棗、茶樹(shù)聚為一組,‘紅陽(yáng)’獼猴桃Ac NPR1 蛋白與茶樹(shù)CsNPR1 蛋白親緣關(guān)系最近。

圖5 ‘紅陽(yáng)’獼猴桃AcNPR1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of AcNPR1 protein in‘Hongyang’

2.5 AcNPR1 基因表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)‘紅陽(yáng)’和‘徐香’不同組織中的莖、葉、花Ac NPR1基因表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明,Ac NPR1基因在‘徐香’品種不同組織的表達(dá)量從大到小依次為葉、花、莖(圖6-A);在‘紅陽(yáng)’品種同樣是在葉片中的表達(dá)量最高,其次是莖,表達(dá)量最小的為花(圖6-B);兩品種Ac NPR1基因均在葉片中表達(dá)量最高。

圖6 ‘徐香’獼猴桃(A)和‘紅陽(yáng)’獼猴桃(B)AcNPR1 基因組織表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of AcNPR1 gene in different tissues of‘Xuxiang’(A)and‘Hongyang’(B)

以正常生長(zhǎng)處理組(CK)為對(duì)照,分析Psa以及SA+Psa處理下不同抗性品種獼猴桃在不同處理時(shí)間下Ac NPR1基因表達(dá)水平變化情況。結(jié)果表明,在Psa處理下,0 h 時(shí)‘紅陽(yáng)’品種中Ac NPR1基因相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照,而‘徐香’中Ac NPR1基因相對(duì)表達(dá)量迅速上升至對(duì)照的3.7倍;6 h后兩品種中Ac NPR1基因相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)(圖7),‘紅陽(yáng)’和‘徐香’品種分別在48 h和24 h時(shí)基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大,Psa處理下‘紅陽(yáng)’Ac NPR1基因相對(duì)表達(dá)量始終低于‘徐香’(圖7-A)。在SA+Psa處理下,0 h時(shí)‘紅陽(yáng)’品種中Ac NPR1基因相對(duì)表達(dá)量略高于對(duì)照,而‘徐香’中Ac NPR1基因相對(duì)表達(dá)量迅速升高至對(duì)照的2.9倍;之后‘徐香’Ac NPR1基因相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),在24 h時(shí)基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大為對(duì)照的7.7倍,‘紅陽(yáng)’Ac NPR1基因相對(duì)表達(dá)量在6 h至48 h內(nèi)波動(dòng)變化,72 h達(dá)到最大,為對(duì)照的1.6倍,且該處理下‘紅陽(yáng)’基因表達(dá)量始終低于‘徐香’(圖7-B)。不同處理下,‘徐香’品種Ac-NPR1基因相對(duì)表達(dá)量高于‘紅陽(yáng)’,且‘徐香’中基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高的時(shí)間早于‘紅陽(yáng)’。

圖7 病原菌(A)、SA加病原菌(B)處理下兩品種葉片AcNPR1 基因表達(dá)量Fig.7 Expression of AcNPR1 gene in leaves of two varieties under Psa(A)and(SA+Psa)(B)treatment

3 討論

NPR1基因是介導(dǎo)植物免疫系統(tǒng)的重要調(diào)控因子[20],病原菌侵染時(shí)其特異性結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合激活植物免疫系統(tǒng),相關(guān)抗病基因如PR 基因表達(dá)量上調(diào),從而提高植物抗病能力。本研究以病原菌侵染12 h 后的高感病品種‘紅陽(yáng)’和抗病品種‘徐香’獼猴桃葉片為試驗(yàn)材料,克隆得到兩個(gè)品種獼猴桃AcNPR1基因序列,對(duì)‘紅陽(yáng)’Ac NPRN1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該基因完整開(kāi)放閱讀框(ORF)大小為1 770 bp,編碼589個(gè)氨基酸,含有典型的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域、ANK 錨蛋白重復(fù)序列和NPR1_like_C 3個(gè)結(jié)構(gòu)域,多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與已報(bào)道的茶樹(shù)、葡萄、煙草等物種中NPR1類(lèi)蛋白保守結(jié)構(gòu)域一致,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示Ac NPR1蛋白與茶樹(shù)親緣關(guān)系最近。

在擬南芥、水稻、番茄以及小麥中過(guò)量表達(dá)At NPR1基因能夠提高植物對(duì)細(xì)菌和真菌的抗性[4,11-13];在水稻中過(guò)量表達(dá)OsNPR1基因提高了水稻對(duì)細(xì)菌性枯萎病的抗病性[14];與之類(lèi)似,在兩個(gè)蘋(píng)果栽培品種中過(guò)表達(dá)MalusNPR1基因后,發(fā)現(xiàn)其激活了PR基因增強(qiáng)了其對(duì)火疫病及兩種蘋(píng)果的重要真菌病原體的抗性[15]。研究表明,毛花獼猴桃(Actinidia eriantha)接種獼猴桃潰瘍病病原菌后發(fā)現(xiàn),Ae NPR1基因被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),從而提高了毛花獼猴桃的抗病性[25]。本研究中在獼猴桃潰瘍病致變菌侵染獼猴桃后,抗病品種‘徐香’和高感病品種‘紅陽(yáng)’中Ac NPR1基因表達(dá)量均被上調(diào),表明Ac NPR1基因在獼猴桃抵御潰瘍病過(guò)程中發(fā)揮了一定作用;并且‘紅陽(yáng)’品種Ac NPR1基因表達(dá)量始終低于抗病品種‘徐香’,抗病性不同的獼猴桃品種在響應(yīng)病原菌脅迫的抗病機(jī)制方面存在差異,抗性品種為了抵御病原菌造成的傷害,會(huì)迅速啟動(dòng)抗性反應(yīng),在抗病品種‘徐香’中AcNPR1基因被迅速誘導(dǎo)表達(dá),參與了植物對(duì)病原菌的早期抗性反應(yīng),從而啟動(dòng)下游與抗病相關(guān)基因的表達(dá),這與水稻、百合和猴面花中NPR1基因表達(dá)結(jié)果一致[14,26-27]。

水楊酸(SA)是一種酚類(lèi)植物激素,能夠作用于植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,也是植物免疫系統(tǒng)的主要調(diào)控激素之一,在植物抵御生物營(yíng)養(yǎng)性和半生物營(yíng)養(yǎng)性病原菌方面起著重要作用[28]。SA 介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic Acquired Resistance,SAR)是植物的一種廣譜抗病機(jī)制,NPR1是其關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一,是將SA 信號(hào)轉(zhuǎn)化為PR相關(guān)基因表達(dá)所必需的[29]。研究表明,外源SA、JA 等可以誘導(dǎo)NPR1基因或其同源基因表達(dá)從而激活植物抗病反應(yīng)[30-32]。本研究中經(jīng)SA 預(yù)處理后,在抗病品種‘徐香’和高感病品種‘紅陽(yáng)’中Ac NPR1基因表達(dá)水平均升高,表明SA 對(duì)誘導(dǎo)Ac NPR1基因表達(dá)從而激活獼猴桃抗病反應(yīng)具有一定作用,與上述報(bào)道中結(jié)果一致。此外,侯琿等[33]的研究表明輪紋病抗病蘋(píng)果品種的抗性基因更容易受到SA 的誘導(dǎo)表達(dá),這與本研究結(jié)果類(lèi)似,在抗病品種‘徐香’中Ac NPR1基因表達(dá)變化受SA 誘導(dǎo)影響較大。SA 預(yù)處理過(guò)的抗病品種‘徐香’Ac NPR1基因表達(dá)量約是未做SA 預(yù)處理組的2倍,而感病品種‘紅陽(yáng)’則相反;這表明不同抗性獼猴桃品種間NPR1響應(yīng)SA 誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控機(jī)制可能存在差異。研究表明,SA 含量影響植物抗病反應(yīng)的發(fā)生、強(qiáng)度及快慢,SA、病原菌的誘導(dǎo)可以使植物體內(nèi)SA 水平升高,不同抗性品種間SA 水平的差異可能造會(huì)成抗性反應(yīng)及NPR1等相關(guān)抗性基因表達(dá)的差異。但是,抗病信號(hào)傳遞途徑是一個(gè)非常復(fù)雜的體系,不同抗病性品種間Ac NPR1基因表達(dá)為什么會(huì)呈現(xiàn)出差異,需要后續(xù)進(jìn)一步深入研究。