梁青蘭，喬艷輝，韓友吉，任 飛，劉桂民，張升祥，李善文，董玉峰，張?zhí)m英，張富國

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省林業(yè)科學(xué)研究院 山東省林木遺傳改良重點實驗室，山東 濟(jì)南 250014；3.濟(jì)南市國有北郊林場，山東 濟(jì)南 250119；4.山東繪園地理信息有限公司，山東 濟(jì)南 250101)

黑楊派(Sect.Aigeiros)樹種是楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)落葉喬木，由于生長速度快、品質(zhì)好、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點，在全世界范圍內(nèi)廣泛栽培，是我國重要的工業(yè)用材林和生態(tài)防護(hù)林樹種，在鹽堿地改良方面也有較好的應(yīng)用前景。 鹽脅迫作為影響全世界作物產(chǎn)量的重要非生物因子[1]，給植物造成滲透脅迫，致使細(xì)胞內(nèi)離子代謝紊亂[2]，制約其基礎(chǔ)代謝活動，對植物正常生理進(jìn)程造成影響[3]。 研究表明，鹽脅迫環(huán)境可以通過降低土壤滲透勢、破壞植物根系離子平衡[4-6]、影響抗氧化酶機(jī)制[7-8]以及滲透調(diào)節(jié)方式[9-11]來影響植物生理機(jī)能，從而對植物生長發(fā)育產(chǎn)生抑制作用，嚴(yán)重時會導(dǎo)致植物死亡。 因此，研究鹽脅迫下楊樹的耐受機(jī)制，對于其在鹽堿地區(qū)合理種植和推廣應(yīng)用具有重要意義[12]。

目前，關(guān)于楊樹的耐鹽性進(jìn)行了大量研究報道。 程方等[13]、羅永亞[14]、楊傳寶等[15-16]對不同楊樹無性系的在鹽脅迫下的生理特性進(jìn)行了研究。 本試驗利用盆栽試驗方法， 對8 個初選的黑楊派無性系進(jìn)行NaCl 處理，以目前推廣應(yīng)用品種為對照，通過測定鹽脅迫下各供試無性系苗期生長指標(biāo)、生理生化指標(biāo)，探討各供試新無性系對逆境的適應(yīng)能力，采用主成分分析法進(jìn)行綜合評價，篩選出耐鹽性強(qiáng)的無性系，為鹽堿地區(qū)造林提供無性系選擇和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為10 個黑楊派無性系， 其中8 個是山東省林業(yè)科學(xué)研究院根據(jù)3年生試驗林的表型性狀初選的優(yōu)良無性系，以目前推廣應(yīng)用的I-107 楊和2025 楊為對照。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗方法和設(shè)計

采用營養(yǎng)液沙培法。2021年2月下旬取各無性系1年生扦插苗的苗干放于2～4℃冷庫中密封儲藏備用，于2021年4月中旬截取插穗進(jìn)行扦插試驗。 在規(guī)格為170 mm×150 mm的底部有透氣孔的花盆底部放置一層無紡布，然后裝入等質(zhì)量消毒后的細(xì)沙， 將3 個花盆放在長×寬×高為540 mm×360 mm×150 mm 的同一塑料箱中。 將黑楊派無性系插穗扦插入花盆中，每個無性系重復(fù)3 次，扦插時應(yīng)將插條頂端的芽露出沙子表面。用1/2 Hoaglang 營養(yǎng)液定期向箱內(nèi)補(bǔ)充定量的營養(yǎng)液，保證植株正常生長。 扦插后的無性系置于山東省林業(yè)科學(xué)研究院試驗苗圃的溫室中，進(jìn)行管理。

扦插苗生長2 個月后，于2021年6月27日進(jìn)行NaCl 脅迫試驗，用1/2 Hoaglang 營養(yǎng)液和NaCl 配制溶液，分別設(shè)置5 個鹽濃度梯度：0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，即CK、T1、T2、T3、T4，將這5 種濃度的溶液(pH值為7.0)分別倒入5 個塑料箱。

1.2.2 測定指標(biāo)及方法

(1)生長指標(biāo)的測定

苗高和地徑：于2021年6月27日在脅迫開始前測定所有供試無性系的苗高H0和地徑B0，7月11日測定脅迫后各無性系的苗高H1和地徑B1，試驗期間的生長量增量為：

苗高增量= H1-H0

地徑增量= B1-B0

其中，無性系苗高(cm)用刻度尺測量，地徑(mm)使用游標(biāo)卡尺測量。

生物量：在完成試驗各指標(biāo)取樣結(jié)束后，將各處理的無性系苗木拔出洗凈，去除表面雜物，將植株的根、莖、葉分開，放入烘箱在105℃殺青，并在75℃下烘至恒重，然后用電子天平稱其干重。

(2)生理生化指標(biāo)的測定

2021年7月11日取樣，每株苗木取第4 片、第5 片和第6 片葉(從頂端數(shù))，3 次重復(fù)。 參照李合生[17]的方法進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定。 葉綠素含量采用乙醇提取比色法測定；細(xì)胞膜透性采用相對電導(dǎo)率法測定；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定，SOD 活性采用(NBT)光還原法測定；POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法測定；游離脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮染色法測定。 各指標(biāo)測定均重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運用Excel 2010 整理數(shù)據(jù)和作圖，用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行多重比較(Duncan’法)、相關(guān)分析、主成分分析等，對黑楊派無性系進(jìn)行耐鹽性綜合評價。

表1 試驗材料Table 1 Experimemntal materials

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對黑楊派無性系苗高的影響

通過比較NaCl 處理期間各無性系苗高的增量可以看出， 鹽脅迫對各供試無性系的苗高生長有明顯的抑制作用，見表2。隨著鹽脅迫程度加深，10 個無性系的苗高增量顯著下降， 不同無性系的下降程度不同。在T1 處理時，各無性系與對照2025 相比差異顯著， 在該處理下苗高增量最高的是無性系I-107、1733、1725， 增長量分別為8.0 cm、6.9 cm、6.3 cm。 在T2、T3 和T4處理下， 苗高增量排在前3 位的均是無性系1725、I-107 和1733。 說明在不同濃度鹽脅迫下， 這3 個無性系具有較大的生長量，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性。

表2 鹽脅迫對各無性系苗高增量（mm）的影響Table 2 Effect of salt stress on plant height growth increase of each clones

2.2 鹽脅迫對黑楊派無性系地徑的影響

通過比較NaCl 處理期間各無性系地徑的增量可知，隨著鹽脅迫程度的加劇，10個無性系的地徑增量顯著降低， 不同無性系的降低程度不同。 如表3 所示，在T1 處理時， 與CK 相比各供試無性系的地徑增量具有顯著變化。 在T3 處理時， 無性系1725 和1733 的地徑增量最大， 顯著高于對照2025； 在T4 處理時， 無性系1725、1627、1733 的地徑增量排在前3 位， 表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽能力。不同濃度的NaCl 處理下，CK 處理與其他各處理濃度對地徑增量的影響差異顯著， 這說明鹽分脅迫明顯抑制了植株地徑的生長。

表3 鹽脅迫對各無性系地徑增量（mm）的影響Table 3 Effect of salt stress on diameter of stem increase of each clones

2.3 鹽脅迫對黑楊派無性系生物量的影響

由表4 可以看出，隨著NaCl 濃度的提高， 各供試無性系生物量的變化趨勢基本一致， 均不斷降低。 在不同濃度的鹽處理下，無性系的生物量有所差異，其中，CK 處理下的生物量最高，其次是T1 處理，再次是T2 處理，T3、T4 處理下的生物量比較小。 在T4 處理時， 生物量最大的無性系是1733 和1725， 分別為1.49g、1.36g，與對照2025 的差異達(dá)顯著水平；生物量最小的是2025，為0.85g，這說明無性系1733 和1725受到NaCl 脅迫的影響較小，2025 受到的影響較大。

表4 鹽脅迫對各無性系生物量的影響Table 4 Effect of salt stress on biomass of each clones

2.4 鹽脅迫對黑楊派無性系葉綠素含量的影響

隨著鹽處理濃度的增加，10 個黑楊派無性系的葉綠素含量變化如表5 所示， 各供試無性系葉片的葉綠素含量隨鹽脅迫程度的加深呈現(xiàn)出下降趨勢。在T1 處理下，與CK 相比無性系1733 的葉綠素含量的下降幅度最小，降幅為6.3%，1723 的下降幅度最大，降幅為28.4%22.30%；在T3 和T4 處理下，無性系2025、1725的葉綠素含量較高，均在1.51 mg·g-1以上， 1722 的葉綠素含量最小，小于1 mg·g-1，表明鹽分脅迫對1722的光合作用抑制明顯，對2025 和1725 的抑制作用小。試驗結(jié)果說明，NaCl 處理導(dǎo)致植物葉綠素含量顯著降低，鹽分脅迫對葉綠素有明顯的破壞作用。

表5 鹽脅迫對各無性系葉綠素含量（mg·g-1）的影響Table 5 Effect of salt stress on chlorophyll content of each clones

2.5 鹽脅迫對黑楊派無性系細(xì)胞膜透性的影響

在鹽處理環(huán)境下，10 個黑楊派無性系的細(xì)胞膜透性隨NaCl 濃度的升高而增大(見表6)， 說明鹽分脅迫對細(xì)胞膜的傷害程度也隨之增大。 在T1 和T2 處理時，無性系1733 和1725 細(xì)胞膜透性較低，與對照無性系2025 差異顯著， 表現(xiàn)出較好的耐鹽能力。 在T3 處理時，細(xì)胞膜通透性增加幅度最大的是1716 和1641 ，分別達(dá)到173.1%和156.2% ， 增加幅度最小的是1725 和I-107，分別為88.7%和89.6%。 說明無性系1641 和1716 的細(xì)胞膜容易受到鹽脅迫傷害，無性系I-107 和1725 受到鹽脅迫的影響較小。

表6 鹽脅迫對各無性系細(xì)胞膜透性的影響（單位:%）Table 6 Effect of salt stress on diameter of membrane permeability of each clones

2.6 鹽脅迫對黑楊派無性系丙二醛含量的影響

從表7 可以看出，鹽脅迫處理下的各供試無性系葉片中的丙二醛含量均較CK明顯升高， 在T4 處理下增至最大。 在T1處理時， 與CK 相比，10 個無性系的葉片丙二醛含量升高幅度在38.1% ～77.7 %之間；在T2 處理時，升高幅度較小的無性系有1733、1725、2025， 增幅在87.8%以下，升高幅度較大的有1722、1716， 增幅在118.8%以上； 在T3 處理時， 無性系1725和1733 的MDA 含量和升高幅度均最小，均低于對照I-107、2025 及其他參試無性系，說明其受到鹽脅迫的影響較?。辉赥4高鹽濃度處理下，所有無性系的丙二醛含量都達(dá)到較高水平，鹽脅迫對植物細(xì)胞膜產(chǎn)生的破壞加重，無性系的受到的鹽害作用增大。

表7 鹽脅迫對各無性系MDA 含量的影響Table 6 Effect of salt stress on MDA content of each clones

2.7 鹽脅迫對黑楊派無性系SOD 活性的影響

各黑楊派無性系的SOD 活性變化規(guī)律如表8 所示， 隨著NaCl 濃度增加SOD活性表現(xiàn)為先升后降。 在T1 處理濃度時，各供試無性系的SOD 活性處于最高水平，其中，升高幅度最大的無性系是1723(53.0%)、I-107(44.6%)，升高幅度最小的是1641(21.2%)、1716(22.3%)；但在T2 至T4 處理下，無性系的SOD 活性開始下降，這表明，在低濃度鹽脅迫下10 個無性系能夠通過增強(qiáng)SOD 的活性抵抗鹽分傷害，當(dāng)脅迫加重，抗氧化酶活性降低，植物會受到鹽害作用。T2-T4 濃度處理下，無性系1725 的SOD 活性始終較高，居于前兩位，說明其在高濃度的鹽分脅迫下受影響較小。

表8 鹽脅迫對各無性系SOD 活性的影響Table 8 Effect of salt stress on SOD activity of each clones

2.8 鹽脅迫對黑楊派無性系POD 活性的影響

各供試無性系葉片POD 活性的變化規(guī)律與SOD 大體一致(見表9)，所有無性系的POD 活性在T1 處理下與CK 相比顯著升高，POD 活性達(dá)到最高值， 其中無性系1733、I-107 的POD 活性和升高幅度最大， 增幅為202.3%和201.3%。 隨后隨著NaCl 處理濃度增加， 各無性系POD 活性降低， 在T4 處理時降至最低， 此時POD活性最高的無性系為1733 和1725， 與對照2025 達(dá)到顯著性差異水平。 試驗結(jié)果表明， 不同濃度的NaCl 處理對于黑楊派無性系POD 活性產(chǎn)生的影響明顯不同。

表9 鹽脅迫對各無性系POD 活性的影響Table 8 Effect of salt stress on POD activity of each clones

2.9 鹽脅迫對黑楊派無性系游離脯氨酸含量的影響

如表10 所示， 各供試無性系葉片的游離脯氨酸含量各有差異，除無性系1640的葉片脯氨酸含量呈先下降后上升外，其余無性系的脯氨酸含量隨著NaCl 濃度的增加表現(xiàn)為不斷上升趨勢， 并在T4 處理時達(dá)到最高值。 在T2 處理時， 無性系1641、1733 和1725 的脯氨酸含量增加幅度最大，均在97.1%以上，明顯高于對照2025、I-107 及其他無性系；在T4 處理時，相比于其他無性系， 1733、1725 的游離脯氨酸含量處于較高水平，在60.8mg·g-1以上，說明在鹽脅迫條件下，其參與滲透調(diào)節(jié)的能力較強(qiáng)。

表10 鹽脅迫對各無性系游離脯氨酸含量的影響Tab.10 Effect of salt stress on Proline content of each clones

2.10 主成分分析

對T2、T3 和T4 處理下10 個無性系的各項指標(biāo)進(jìn)主成分分析，見表11。在T2處理下， 第1 主成分貢獻(xiàn)率為65.6%，第2 主成分貢獻(xiàn)率為21.7%， 累計貢獻(xiàn)率達(dá)87.3%， 表明這2 個主成分可以把原來9項指標(biāo)87.3%的信息表達(dá)出來。 第1 主成分中苗高增量、生物量、細(xì)胞膜透性、POD活性、丙二醛含量、脯氨酸含量的特征向量絕對值較大，這表明如果無性系的第1 主成分值大，其苗高增量、生物量、POD 活性、脯氨酸含量值也大，而細(xì)胞膜透性、丙二醛含量值小，說明該無性系耐鹽性強(qiáng)。第2 主成分中地徑增量、葉綠素含量、SOD 活性的特征向量絕對值較大。

表11 NaCl 脅迫下各指標(biāo)的主成分特征向量、特征值及累計貢獻(xiàn)率Tab.11 Principal component characteristic vector, characteristic value and cumulative contribution rate of each index under NaCl stress

在T3 處理下， 第1 主成分貢獻(xiàn)率為64.6%，第2 主成分貢獻(xiàn)率為22.0%， 累計貢獻(xiàn)率達(dá)86.7%， 可以反映原來86.7%的信息。 第1 主成分中苗高增量、地徑增量、生物量、細(xì)胞膜透性、丙二醛含量、POD 活性、脯氨酸含量的特征向量絕對值較大，其中除細(xì)胞膜透性和丙二醛含量的向量為負(fù)值外， 其余均為正值；這表明如果無性系的第1 主成分值大，其苗高增量、地徑增量、生物量、POD 活性、脯氨酸含量值也大，而細(xì)胞膜透性、丙二醛含量值小，說明該無性系耐鹽性強(qiáng)。 第2 主成分中葉綠素含量、SOD 活性的特征向量較大。

在T4 處理下，第1 主成分貢獻(xiàn)率為68.7%，第2 主成分貢獻(xiàn)率為16.8%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)85.5%，可以反映原來9 項指標(biāo)85.5%的信息。 在T4 處理下，第1 主成分中苗高增量、地徑增量、生物量、細(xì)胞膜透性、SOD活性、POD 活性、脯氨酸含量的特征向量絕對值較大，其中除細(xì)胞膜透性的向量為負(fù)值外，其余均為正值；這表明如果無性系的第一主成分值大，其苗高增量、地徑增量、生物量、SOD 活性、POD 活性、脯氨酸含量值也大，而細(xì)胞膜透性值小，說明該無性系耐鹽性強(qiáng)。 第2 主成分中葉綠素含量、SOD 活性、丙二醛含量的特征向量較大。

計算T2、T3 和T4 處理下10 個無性系的前2 個主成分的綜合值(表12)，并計算每個無性系這3 個處理的綜合主成分值的均值，根據(jù)均值大小對各個無性系的耐鹽性進(jìn)行排序，各供試無性系的耐鹽能力強(qiáng)弱依次為： 1733、1725、I-107、1641、1627、2025、1640、1723、1716、1722。

表12 NaCl 脅迫下10 個無性系的綜合主成分值Tab.12 Intergrated principal component values of 10 clones under NaCl stress

3 討論與結(jié)論

植物處于鹽漬環(huán)境下，其形態(tài)發(fā)育、光合作用、滲透調(diào)節(jié)等都會受到影響，其中最直觀的就是抑制植株的生長，植物的生長量變化是判斷其受到鹽害程度的重要測量標(biāo)準(zhǔn)[18]。在本試驗中，隨著鹽脅迫程度的加深，10 個無性系的苗高增量、地徑增量和生物量均呈下降趨勢。說明過量的鹽進(jìn)入植物體內(nèi)對其造成損傷，影響植株生長發(fā)育。 這與楊傳寶等[15-16]對白楊派(Leuce)無性系、羅永亞[14]對胡楊(P.euphratica)的研究結(jié)果一致。

葉綠素在植物的光合作用過程發(fā)揮著重要的作用，在正常情況下，植物通過光合作用制造有機(jī)物，維持植株正常生長[19]。而鹽脅迫會嚴(yán)重影響植物葉片中葉綠素的含量，降低植物的光合效率，抑制植物正常生長。孫偉博等[20]以楊樹為試驗材料，對其進(jìn)行NaCl 脅迫，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，楊樹植株葉綠素含量隨鹽濃度的升高呈下降趨勢。 這與本試驗結(jié)果一致，隨著鹽脅迫的加深，各供試無性系的葉片綠素含量與對照比較均逐漸降低。

植物在逆境脅迫下細(xì)胞膜是重要的生理結(jié)構(gòu)，可以控制細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)進(jìn)出，維持細(xì)胞代謝穩(wěn)定，維持正常生理活動[21]。鹽分脅迫會破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起丙二醛含量增加，對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能受損[22-23]。 在本試驗中，10 個無性系的細(xì)胞膜透性和MDA 含量呈逐漸上升的趨勢，這與對金銀花(Lonicerae japonicae )[24]、獼猴桃(Actinidia deliciosa)[25]等植物的研究結(jié)論相似。 說明較高的鹽濃度會導(dǎo)致植物細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用加強(qiáng)，細(xì)胞膜受害加深。

超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)是植物抗氧化防御體系中重要的保護(hù)酶，二者在逆境環(huán)境下能夠?qū)⒅参矬w內(nèi)過多的活性氧清除，起到減輕細(xì)胞膜氧化損傷的作用。 在本試驗中，在T1 處理下，各無性系SOD 活性與對照比較明顯增加，在T2 處理時SOD 活性出現(xiàn)降低，這可能是由于植物在低鹽濃度下通過提高酶活性來抵御鹽脅迫，減輕活性氧帶來的氧化傷害，當(dāng)脅迫程度加深，達(dá)到植物自身所承受的最大限度，細(xì)胞膜系統(tǒng)受到傷害，保護(hù)酶活性就會降低。 這與李翀等[26]對‘南林895’雜交楊(P.× euramericana‘Nanlin895’)研究結(jié)果一致，

游離脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)組織細(xì)胞的滲透壓，維護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。 本試驗中， 隨著處理鹽脅迫程度加重，10 個黑楊派無性系的脯氨酸含量不斷增加， 這說明在遇到高濃度鹽脅迫時，為了維持自身生命活動的正常進(jìn)行，植物會通過增加脯氨酸的含量來緩解鹽分傷害，抵抗鹽害導(dǎo)致的滲透脅迫。 這與史軍輝等[27]對胡楊的研究結(jié)果相同。

本研究對10 個黑楊派無性系進(jìn)行不同濃度的NaCl 處理， 通過分析各無性系苗期的各項指標(biāo)變化，探究鹽脅迫對各供試無性系生長和生理生化特性的影響。 根據(jù)主成分分析，得到各無性系的耐鹽性由強(qiáng)到弱依次為1733、1725、I-107、1641、1627、2025、1640、1723、1716、1722。 初步篩選出1733 和1725 兩個耐鹽能力較強(qiáng)的無性系，可以作為耐鹽試驗材料進(jìn)一步在鹽堿地開展田間試驗研究。