宋艷波 楊云浩 段鵬軍 王嘉浩 魏絲晴 張亞龍

摘要：結合番茄葉片結構特點，采用6種表皮制片技術對番茄葉片下表皮進行裝片，并對不同方法的制片過程和觀察效果進行比較研究。結果表明，番茄葉片薄，表皮為單層細胞，其上著生有豐富表皮毛，下表皮與疏松的海綿組織相鄰；表皮撕取法和透明膠帶粘取法可以真實地觀測氣孔大小、密度等靜態(tài)性狀指標和氣孔開度等動態(tài)行為；因番茄葉柔軟，刮片法對操作要求極高，而解離法不但用時長且效果不佳，都不適宜番茄葉下表皮制片；可撕拉型指甲油印跡法能獲得氣孔指數和氣孔開度的印痕，但對葉片有一定損壞，而硅膠-指甲油雙階段印跡法對葉片沒有損傷，可以多次印跡同一葉片相同部位，連續(xù)觀測氣孔運動及發(fā)育等動態(tài)行為。研究結果可為不同研究選擇適合的番茄葉表皮制片方法提供依據。

關鍵詞：番茄；表皮制片；氣孔；顯微觀察；方法比較與改良

中圖分類號：Q94-3文獻標志碼：A論文編號：cjas2021-0093

Comparison Study of 6 Kinds of Tomato Leaf Epidermis Slice Techniques SONG Yanbo， YANG Yunhao1， DUAN Pengjun2， WANG Jiahao1， WEI Siqing1， ZHANG Yalong1

（1College of Life Sciences， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， Shanxi， China；

2College of Information Science and Engineering， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， Shanxi， China）

Abstract： This paper adopted six kinds of leaf epidermis slice techniques to treat lower epidermis of tomato leaves considering their structural characteristics， and compared the preparation process and observation effect of different techniques. The results show that tomato leaves are thin， the epidermis is single-layer cell with abundant epidermal hairs， and the lower epidermis is adjacent to the loose spongy tissue. Static characteristics， such as dynamic behavior of stomatal size， density and stomatal aperture， could be observed by skin peeling method and cellophane tape sticking method. Due to the softness of tomato leaves， the scraping method is extremely demanding to operate， and dissociation method is time-consuming and has poor effect， both the techniques are not suitable for the slice production of tomato leaf epidermis. Tearable nail oil blotting method could obtain the imprint of stomatal index and stomatal aperture， while the leaves would be damaged certainly. Silica gel-nail polish two-stage blotting method has no damage to the leaves， the same part of the same leaf could be imprinted continuously without scathe， and in this way， the dynamic behavior like stomatal movement and stomatal development could be observed continuously. The results could provide a basis for selecting suitable tomato leaf epidermis preparation methods for different research purposes.

Keywords： Tomato； Leaf Epidermis Slice Techniques； Stoma； Microscopic Observation； Method Comparison and Improvement

0引言

番茄（Solanum lycopersicum）在世界各地廣泛種植[1-2]，全球年總產量位居蔬菜之首[3]。番茄果肉多汁，香氣獨特，色澤艷麗，營養(yǎng)豐富，為人體提供Vc、K和葉酸[4]等必需營養(yǎng)，以及占人體需要量達80%以上的番茄紅素[5]。番茄紅素是一種強大的天然抗氧化劑，具有免疫調節(jié)、抗炎、抗腫瘤等作用[6-8]。番茄是世界食品加工業(yè)的重要原料，2018年用于番茄濃縮物、番茄漿和番茄泥等加工的番茄就達1.8億t[6]，近年來，還被用于藥品和化妝品等的生產[2，9]。鮮食和加工市場的增長使番茄成為世界上最重要的作物之一[10-11]，培育優(yōu)質的番茄果實是科研和生產的重要任務。

氣孔是由一對保衛(wèi)細胞環(huán)繞的微孔，通常存在于植物的地上部分，多出現于葉片下表皮上[12-13]。雖然氣孔總面積可能只占植物葉表面的不到3%，卻承擔著植物約98%的CO2吸收和水分散失的功能[15]，同時在應對生物[16-17]和非生物脅迫[8，17-18]方面也發(fā)揮著重要的作用，因此，氣孔被視作植物生產力的關鍵[19]。對氣孔密度、大小、形狀和開度等氣孔特性進行觀察，研究其與植物光合、蒸騰等生理代謝及各種生長環(huán)境的相關關系，可為調控植物在不同環(huán)境下的生長、提高產量和品質奠定基礎。

目前，研究氣孔特性的主要手段還是植物葉表皮顯微制片法，這種方法不但具有操作簡單和成本低廉等優(yōu)勢，而且在長期實踐中經過不斷發(fā)展和改良形成了多種不同的操作技術。例如，王等[20]使用印跡法獲得超表達胡蘿卜DcABF3基因的擬南芥葉表皮細胞制片，經觀察和統(tǒng)計發(fā)現轉基因植株葉片氣孔密度和氣孔指數增加，導致其耐旱性下降；Haworth等[21]采用硅膠-指甲油雙階段印跡法對包括蕨類、裸子植物和被子植物在內的31種不同植物葉表皮進行制片觀察，統(tǒng)計氣孔指數和氣孔密度，結合從光穩(wěn)態(tài)到黑暗過程中氣孔導度變化的速度（PP-Systems測定），探究氣孔在植物進化過程中所起的重要作用；Tao等[22]根據雙子葉植物不同葉片組織特點采用了不同葉表皮制片技術，對表皮毛少而脆的煙草等雙子葉植物使用瓊脂糖印跡法，而對表皮毛多的大豆等雙子葉植物使用透明膠帶粘取法，獲得這些植物氣孔等表皮細胞清晰影像，滿足了對表皮細胞進行精確統(tǒng)計分析的需求。而在番茄研究中可見多種不同葉表皮制片技術的應用，Nazir等[18]采用解離方法獲得番茄葉片表皮細胞制片，觀察重金屬對氣孔保衛(wèi)細胞的破壞；Li等[23]通過直接撕取葉表皮方式進行制片，觀察了番茄葉片氣孔長和寬，并計算氣孔導度（氣孔長與寬之比）；Bian等[24]采用指甲油印跡獲得番茄葉表皮制片，通過測定氣孔寬度和長度獲得氣孔開度，發(fā)現綠光處理的番茄葉片氣孔導度下降，使其在短期干旱下提高植株的內在水分利用效率，保持了較高光合效率。Farber等[25]利用印跡技術分別觀察測定了過表達細胞分裂素（CK）降解酶的轉基因番茄植株、CK處理番茄植株與野生型番茄植株的葉片氣孔孔徑和密度，發(fā)現CK含量高時可以增加番茄葉片氣孔密度并間接促進蒸騰作用；而低水平CK通過降低氣孔密度、抑制葉片生長和促進葉片衰老來抑制蒸騰，從而提高了對長期干旱的適應性。

番茄葉具有表皮薄且表皮毛多等特點，導致不同表皮制片技術效果差異較大，目前缺少對番茄葉片制片技術的相關改進與探討研究。筆者在番茄葉片解剖基礎上，對6種制片技術方法進行改進，并對不同制片技術所用時間、制片難易度、取樣定位性、裝片清晰度和氣孔真實性等進行記錄和比較，以期為番茄氣孔等表皮細胞形態(tài)特征和動態(tài)行為等不同研究目的匹配最適合的表皮制片技術。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗材料的培養(yǎng)以上海市長征良種實驗場培育的‘合作909’番茄為試驗材料。

將番茄種子放入水中浸泡1～2 h，接著用55℃溫水攪拌5～10 min，再次放入水中3～4 h；最后用70%甲基托布津1000倍液處理5～10 min，無菌水沖洗3～5次。

于高7.5 cm、半徑8.5 cm的圓柱形營養(yǎng)缽（體積約0.43 dm3）中放入營養(yǎng)土，澆透水，在表面打3個2～3 cm深的孔，每個孔中放入2粒番茄種子，覆土。每12盆放入1個塑料托盤中，托盤內水位保持約1 cm，覆膜并置于培養(yǎng)箱中催芽和培養(yǎng)。催芽條件為28℃和40%濕度，時間5～8 h；培養(yǎng)條件為27℃（11 h光照）/17℃（13 h黑暗），40%濕度，1700μmol/（m2·s）光照強度，待苗出齊1周后揭膜，長至2～3片真葉時分苗為1株/盆，繼續(xù)培養(yǎng)2個月，在植株開花前進行取樣觀察。

1.1.2儀器與試劑試驗所用的儀器主要有正置熒光顯微鏡（DM6B，Leica，維玆拉，德國），人工氣候箱（RXZ-250，寧波，中國），硅膠（彈性體印模材料0型，美佳印？，山東，中國），載玻片，蓋玻片，透明膠帶（寬4.20 cm），30%過氧化氫-醋酸1：1液，無色透明指甲油（可撕拉型與不可撕拉型各1種）。

1.2試驗方法

以番茄頂端向下第一片成熟葉片的下表皮為制片部位，據不同制片方法使葉片離體或不離體，蒸餾水沖洗葉片，濾紙吸干水分，按下述方法進行制片，每個方法做5個裝片。

1.2.1表皮撕取法表皮撕取法參照Li等[23]的方法加以改動。將葉片背面朝上繞左手食指貼合（葉柄朝向自己），用拇指和中指壓住葉片的基部和尖部。選取葉片中部2個平行側葉脈為起始端和終端，用刀片在平行脈間與葉脈垂直輕輕劃2道，深度以劃開表皮為宜，這2條線和2個平行葉脈組成需要樣本表皮大小，右手拿鑷子于起始端側脈平行并輕輕提起表皮，緩緩向終端側脈提拉，剪去撕下的表皮邊緣沾有葉脈及葉肉細胞的部分，使制片平整。放于滴有2～3滴蒸餾水的載玻片上，待表皮展開后，用濾紙吸去多余水分僅保留1層水膜避免產生氣泡，于顯微鏡下觀察。

1.2.2透明膠帶粘取法透明膠帶粘取法在參照陳等[26]和Tao等[22]方法的基礎上，根據番茄特點適當加以改良。剪下長約10 cm的膠帶，膠面朝上平鋪在實驗臺上；將葉片正面沿葉尖至葉基貼在膠面上，鋪平葉片并剪去葉柄；將膠帶從葉尖部向上對折，使葉片背面按尖端到基部的順序緊貼膠帶的膠面；并用鑷子尾端隔著膠帶順著葉脈在葉脈間朝同一方向反復刮過，直至葉片背面由淡綠變?yōu)樯罹G色，目的是使膠帶緊貼表皮；然后，緩慢分開膠帶，葉片下表皮隨之分離并粘在膠帶上。用剪刀剪取所需部位，放在滴有蒸餾水的載玻片上，吸去膠片邊緣多余的水并帶出氣泡，然后蓋上蓋玻片壓平觀察。

1.2.3指甲油印跡法指甲油印跡法參照王萍等[20]的方法，貼合番茄葉片特征進行。將葉片背面朝上放于實驗臺上，也可直接在植株上操作。用涂指甲油的小刷子或棉簽在葉片背面順著葉脈在脈間均勻刷一層薄薄的指甲油，靜置30 min，待指甲油自然晾干后，用鑷子直接撕下油膜，僅留下印有表皮細胞形狀的油膜，用蒸餾水洗去組織殘留物并剪裁所需觀察部位，放在滴有蒸餾水的載玻片上，吸水蓋片，壓平觀察。

1.2.4硅膠-指甲油雙階段印跡法硅膠-指甲油雙階段印跡法參照Haworth等[21]的方法，使用適宜番茄葉片的最佳時長進行。

據產品說明書將2種硅膠印模材料混合后，均勻地涂在葉片下表皮上，靜置25 min，取下硅膠，在接觸葉面的一側硅膠上可見清晰的葉脈和氣孔印跡；待硅膠晾干，在留有印跡的硅膠面上再刷上一層指甲油， 15 min后取下晾干的指甲油膜，根據需要裁下所需觀察的對應部位，放于滴有蒸餾水的載玻片上，吸水蓋片，壓平觀察。

1.2.5解離法參照Nazir等[18]的方法，選出最適解離時長進行。將葉片切成邊長0.5 cm的小正方形后放入盛有30%過氧化氫-醋酸溶液的燒杯中，并于60℃恒溫水浴解離30 min，之后將葉片輕輕取出置于裝著蒸餾水的培養(yǎng)皿中，用鑷子去除解離下的破碎組織和細胞，再將葉片下表皮置于滴有蒸餾水的載玻片上，吸水蓋片觀察。

1.2.6刮片法以溫壽星等[27]的方法為基礎，改動以縮短時長、降低葉片破損概率。將葉片正面朝上放于實驗臺上，用雙面刀片沿葉脈間從一側向另一側輕輕地反復刮擦，以去除上表皮和葉肉組織，只留下透明的下表皮，裁剪所需觀察區(qū)域并放在滴有蒸餾水的載玻片上，吸去多余的水后直接觀察。

1.2.7番茄葉片的石蠟制片石蠟制片參照宋杰等[28]的方法進行。選擇發(fā)育正常、健康、有代表性的葉片，用刀片從植株上割下后用FAA固定，經脫水、透明、透蠟、包埋后切片、脫蠟、染色后封藏觀察。

1.2.8葉表皮樣本觀察與記錄制好的番茄葉表皮樣本或載有表皮印痕的油膜樣本放在正置熒光顯微鏡下觀察，用Leica Application Suite X（LAS X）軟件人工操作并拍攝?？上仍诟吡炼?、低TL-視場下定位，再進入明場界面調節(jié)光強度和焦距，并將物鏡逐級調至40×。同一裝片選取10個不同視野拍攝圖片（圖片大小為3840像素×2400像素）并存儲。

2結果與分析

2.1番茄葉組織結構特點

通過石蠟制片獲得番茄葉片橫切結構（圖1B），葉片厚度為（154.3±5.1）μm，表皮為單層細胞，表皮細胞壁??；有明顯的柵欄組織和海綿組織的分化，葉背面的下表皮與疏松海綿組織相鄰；同時從下表皮制片可見（圖1A），其表皮上附有大量的表皮毛。這些結構特點決定了不同下表皮制片技術的難易程度和制片效果的優(yōu)劣。

2.2撕取表皮和膠帶粘取法對番茄葉表皮制片效果

采用撕取表皮的方式是最簡單而直接的植物葉表皮制片法，尤其適合表皮與葉肉細胞間組織疏松的植物，如菠菜、油菜和紫鴨跖草等，容易撕取下表皮。而撕取玉米和小麥等表皮與葉肉組織結合緊密的植物下表皮，常因帶下葉肉細胞影響觀察[20]。撕取番茄表皮裝片觀察結果如圖2A，氣孔和表皮細胞輪廓清晰，色澤自然，偶爾會有少量葉肉組織殘留但不影響觀察效果，圖片上黑色的圓點是垂直于表皮生長的表皮毛。雖然番茄與葉肉組織結合不是很緊密，但是因番茄葉片柔軟，在撕取表皮時要利用巧勁，要準確快速，尤其初始提拉表皮時若提拉次數過多，就會損壞樣本，只能換取樣部位或葉片；若從制片到觀察時間過長，表皮細胞易失水皺縮變形。

用膠帶粘取表皮也是植物葉表皮制片法的首選，經濟快速，并可以固定氣孔等表皮細胞形狀，避免因細胞失水而導致變形，真實地反映氣孔開度變化，并適于大量樣品的觀察。用膠帶粘取不同植物葉下表皮的難易程度，主要取決于葉幼嫩程度和葉表面的潔凈程度[26]，此外，也與葉組織特點有關，如姜成東等[29]研究指出，由于杧果葉片質地堅硬，上下表皮、葉肉及葉脈之間結合緊密，即使使用多種透明膠帶也無法粘取到杧果葉片下表皮。用膠帶粘取番茄葉表皮前要保證葉片的潔凈，當膠帶平整的粘在表皮上后，要以合適的力度壓膠帶，使膠帶與表皮貼合，壓的力量過小則表皮粘不下來，力量過大會把葉肉細胞一起粘下來。其裝片觀察結果如圖2B，氣孔和表皮細胞清晰可見，葉肉殘留不多，不影響清晰度，定位性好，很好地呈現表皮毛形態(tài)和氣孔開度變化，裝片可在30 min內多次觀察，不會發(fā)生失水變形的現象。

2.3刮片法和解離法對番茄葉表皮制片效果

刮取表皮是指用刀片等工具除去上表皮和葉肉組織，只留下下表皮，其最大優(yōu)點是可以較好地保持葉表皮的原始狀態(tài)，但對刮制時力度和角度等操作技術要求較高[30]，過輕會殘留葉肉細胞，過重會刮破葉片[31-32]，在刮取番茄葉表片制片中也存在同樣的問題，尤其番茄葉片薄而軟，很難獲得理想的效果，如圖3A，番茄葉肉組織殘留較多，氣孔等表皮細胞結構不清晰。

解離法是利用化學試劑破壞葉片的葉肉再剝離表皮的方法，其目的是減少葉肉細胞干擾，得到較清晰的裝片，適合于葉片表面有蠟質層等發(fā)達的保護組織及表皮細胞較厚的木本植物等，不適用于海綿組織較疏松、表皮細胞較薄的草本植物[33]。對于番茄葉片而言，解離法制片用時過長，且解離時間掌控困難，時間稍短會解離不完全，殘留葉肉；稍長會腐蝕表皮細胞，使表皮破碎，難以取得需要的制片部位，這與封濤和師長海等[31，34]研究的結果一致。用該法獲得的番茄葉表皮裝片如圖3B，雖沒有明顯葉肉殘留，可以看出氣孔等表皮細胞輪廓和氣孔分布，但不適合氣孔開度觀察。

2.4印跡法對番茄葉表皮制片效果

印跡法是將指甲油和火棉膠等膠性材料涂在葉片表面，取風干后的膠膜為材料進行觀察的制片方法[31]，此方法操作簡單快速，定位性好、取樣面積大，且可以重復印跡相同葉片。分為單階段印跡法和雙階段印跡法。

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單階段印跡法是只用一種膠性材料通過一次印跡獲得氣孔等表皮細胞的印痕。最常用的是指甲油，操作簡單，薄膜易撕取，圖像不受葉綠體干擾。采用該法獲得番茄葉表皮印痕并進行觀察，如圖4A、B分別為可撕拉型和不可撕拉型指甲油印跡，可見前者清晰度明顯高于后者，滿足表皮和氣孔輪廓及氣孔開度觀察；但是由于番茄表皮毛過多，制得的薄膜欠平整，需要調整焦面才能對整個視野進行觀察，這類問題也常出現于牛皮膠印跡法[35]和火棉膠印跡法[36]中；制作過程發(fā)現涂布指甲油，尤其是不可撕拉型指甲油后會出現葉片皺縮損壞現象，這與番茄葉片過軟有關。樓柏丹等[33]在生菜上也觀察到同樣的現象，于是認為指甲油印跡法更適用于表皮毛少的硅質化和栓質化葉片。

硅膠-指甲油屬于雙階段印跡法。先用對葉片無害的硅膠材料獲得葉表皮細胞印痕，再用指甲油對硅膠上的印痕二次復印，這種方法可以多次印跡相同葉片，獲得氣孔密度和分布等數據，并可以粗略獲得氣孔開度等信息。采用該法獲得番茄表皮印痕（圖5），表皮細胞輪廓分明，氣孔形狀清晰，開度可辨，其明顯的優(yōu)勢是對葉片沒有損壞，并且可多次印跡，是跟蹤氣孔發(fā)育和氣孔運動行為的最佳方式，這與Wu等[37]在擬南芥上研究的結果一致。

2.5 6種表皮制片方法對番茄葉表皮制片效果比較

由表1可知，撕取法和透明膠帶法都可以得到清晰度與真實性俱佳的表皮裝片，其中撕取法用時短但取樣面積小，適用于快速小面積的觀察；透明膠帶法用時長但取樣面積大，適用于對定位性有要求的大面積表皮觀察。指甲油印跡法和硅膠-指甲油印跡法都有較大的取樣面積和足夠的清晰度且操作簡單、無葉肉干擾，尤其硅膠-指甲油印跡法可以多次印跡同一葉片，適宜觀察氣孔的開度和發(fā)育等動態(tài)變化。解離法和刮片法都會對番茄葉片造成極大的損傷，解離法將葉肉解離下來，可以獲得較清晰的圖片，但定位性不好，用時過長；相對而言，刮片法的定位性和真實性更好，但有大量葉肉殘留，致使其清晰度不佳。

3結論與討論

氣孔是提供氣體交換和調節(jié)蒸騰及應對逆境與非逆境脅迫的重要組織器官。對于成熟的葉片，氣孔的物理和外形特征（如氣孔密度、氣孔大小和形狀）是相對穩(wěn)定的，這些特征限制了氣體交換速率[38]和光合性能，如氣孔少而大的植物光合速率往往低于氣孔多而小的植物[39]，相對于氣孔的開閉運動，這些氣孔性狀屬于靜態(tài)的行為指標。氣孔因2個保衛(wèi)細胞水勢的變化而張開或關閉，這種動態(tài)氣孔行為控制著植物與大氣間的水分和CO2的交換，對水分的虧缺和代謝的變化做出快速反應[40]，如在短期干旱脅迫下，植物可以通過減少氣孔開度調節(jié)蒸騰速率的途徑來提高水分利用效率（WUE），從而最大限度地減少水分虧缺下的潛在產量損失[41]；在短期鹽脅迫下，植物通過優(yōu)化氣孔孔徑來控制CO2同化和水分流失之間的平衡[42]。而在長時間的脅迫下，植物需要改變氣孔的大小和密度等[43]實現高度的適應。然而，在一些作物品種中，較低的產量通常與嚴重或長期干旱脅迫導致的氣孔關閉使光合作用下降有關[44]。Lawson等[45]研究認為光合作用與氣孔導度呈正相關。Kinoshita等[20]在保衛(wèi)細胞中過表達質子ATP酶，使氣孔開度增加，使生物量增加到63%?？傊?，氣孔的靜態(tài)性狀體現了氣孔的基本性能，而動態(tài)性狀是氣孔功能的直接執(zhí)行者。

在氣孔的顯微制片觀察中，對氣孔的動態(tài)行為和靜態(tài)性狀要區(qū)別對待，因為氣孔的動態(tài)行為不僅要求氣孔的輪廓清晰，還要保證氣孔開度和導度的真實性，而氣孔保衛(wèi)細胞水勢很容易發(fā)生變化，進而改變了氣孔的開度；另外，氣孔開度觀察也有時效需求?；诖?，筆者首次比較了6種常用表皮制片技術對番茄葉表皮裝片效果，其中撕片法、膠帶粘取法和刮片法都可以滿足氣孔靜態(tài)性狀和動態(tài)行為觀察，但由于番茄葉片和表皮都薄，刮片法很難掌握力度和角度，葉肉殘留影響制片效果；在取樣面積和樣本量不大時，撕片法可以觀察氣孔的真實行為和天然色澤；但若取樣面積大和樣本較多時，膠帶粘取法可以保證不同樣本間取樣時間的一致性，因其可以對氣孔等表皮細胞進行固定，為觀察爭取了時間。

相對于印跡法，膠帶粘取和撕片法都對葉片有破壞，若想連續(xù)觀察氣孔的運動或氣孔的發(fā)育，每個取樣時間需要換取葉片，而葉片間差異是很大的，為了減小誤差就需要增加取樣量，而印跡法可以對同一葉片同一取樣部位進行多次印跡，可以連續(xù)觀察氣孔運動行為和發(fā)育過程。曾斌等[46]用指甲油印跡法觀察番茄同一葉片上不同時間表皮制片，取得了很好的效果。本研究發(fā)現，可撕拉指甲油印跡效果好于不可撕拉的指甲油；而雙階段印跡法更適合于番茄葉表皮制片的氣孔靜態(tài)指標及動態(tài)行為觀察，尤其是對氣孔發(fā)育動態(tài)研究方面是其他方法無法替代的，同時所用的硅膠對番茄葉片沒有傷害，不會出現指甲油直接涂布時葉片皺縮等問題。

氣孔是植物與外界聯(lián)系的窗口，對氣孔性狀的觀察和研究是了解氣孔功能和調控植物生長發(fā)育的重要手段。筆者系統(tǒng)討論了6種番茄功能葉表皮制片技術，為氣孔靜態(tài)性狀、動態(tài)行為和發(fā)育等不同研究目的匹配適宜的方法提供了有力參考。但如何縮短雙階段印跡法制片時間，提升其觀察效果仍然是未來值得關注的方向；另外適合水分含量高、葉片薄的幼葉和含水量少、葉片脆的老葉表皮裝片技術也應該列入隨后研究的重要內容，為植物葉片的功能研究和植物對環(huán)境的適應機理分析提供全面的信息。

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