譚麗杰，孫四海，鞠建峰

（山東省聊城市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科,聊城 252000）

糖尿病性心肌病是糖尿病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，會(huì)增加患者的死亡率[1]。糖尿病性心肌病被定義為獨(dú)立于高血壓和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化而發(fā)生的左心功能不全，并且是糖尿病患者心力衰竭的原因[2]。因此，降低重大心血管事件風(fēng)險(xiǎn)的降糖藥十分重要[3]。氧化應(yīng)激的增加和心肌細(xì)胞的凋亡與糖尿病性心肌病的發(fā)展有關(guān)[4]。研究表明，蒲公英總黃酮能夠減少β淀粉樣蛋白25-35（amyloidβ-protein 25-35，Aβ25-35）誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，這可能與拮抗其氧化損傷有關(guān)[5]。蒲公英總黃酮可減輕腦缺血再灌注模型小鼠的腦組織損傷,其作用機(jī)制與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)[6]。微小RNA（microRNA，miRNA/miR）是非編碼RNA的一個(gè)亞組，長(zhǎng)度約為22 bp，通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)發(fā)揮功能。miR-129-5p參與心臟疾病發(fā)生、發(fā)展，在心肌缺血再灌注損傷小鼠模型中表達(dá)顯著下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-129-5p可減輕心肌缺血再灌注損傷[7]。miR-129-5p在急性肺損傷小鼠模型和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的肺損傷細(xì)胞模型中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-129-5p可抑制炎癥因子的表達(dá)和細(xì)胞凋亡[8]。但蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制尚未清楚。本研究利用高糖損傷心肌細(xì)胞，考察蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響，及其對(duì)miR-129-5p的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 H9C2細(xì)胞購(gòu)自上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；葡萄糖（貨號(hào)：G7021，美國(guó)Sigma）；MiScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：218161）、MiScript SYBR-Green PCR試劑盒（貨號(hào)：218073）（德國(guó)Qiagen）；試劑盒CCK-8（貨號(hào)C0037）、丙二醛（MDA）（貨號(hào)：S0131）、超氧化物歧化酶（SOD）（貨號(hào)：S0109）、過(guò)氧化氫酶（CAT）（貨號(hào)：S0051）、乳酸脫氫酶（LDH）（貨號(hào)：C0016）、活性氧（ROS）（貨號(hào)：S0033）、膜聯(lián)蛋白V（annexinV）-FITC（貨號(hào)：C1062）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)二抗（貨號(hào)：A0208）（上海碧云天）；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）（貨號(hào)：ab196495）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated x protein，Bax）（貨號(hào)：ab182733）、GAPDH（貨號(hào)：ab181603）（上海艾博抗）；PVDF膜（貨號(hào)：10600023）（美國(guó)GEHealthcare）；miR-NC、miR-129-5p、anti-miR-NC、anti-miR-129-5p（廣州Ribobio）。蒲公英總黃酮（含量為61.02%）由河南中醫(yī)學(xué)院分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，用時(shí)以培養(yǎng)基稀釋成不同濃度：25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與高糖損傷 心肌細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清）、37℃、5%CO2飽和濕氣中生長(zhǎng)。待心肌細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用50 mmol/L葡萄糖損傷心肌細(xì)胞48 h[9]，并以5.6 mmol/L葡萄糖為對(duì)照。

1.3 細(xì)胞處理與實(shí)驗(yàn)分組 心肌細(xì)胞以2×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，24 h后以25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL蒲公英總黃酮[5]干預(yù)，同時(shí)以50 mmol/L葡萄糖損傷心肌細(xì)胞48 h。心肌細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，然后利用Lipofectamine 2000與miR-129-5p、miR-NC、anti-miR-129-5p、anti-miR-NC共轉(zhuǎn)染。待轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行高糖損傷或蒲公英總黃酮干預(yù)48 h。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（5.6 mmol/L葡萄糖）、高糖組（50 mmol/L葡萄糖）、高糖+蒲公英總黃酮低濃度組（50 mmol/L葡萄糖+25μg/mL蒲公英總黃酮）、高糖+蒲公英總黃酮中濃度組（50 mmol/L葡萄糖+50μg/mL蒲公英總黃酮）、高糖+蒲公英總黃酮高濃度組（50 mmol/L葡萄糖+100μg/mL蒲公英總黃酮）、高糖+miR-NC組（50 mmol/L葡萄糖+轉(zhuǎn)染miR-NC）、高糖+miR-129-5p組（50 mmol/L葡萄糖+轉(zhuǎn)染miR-129-5p）、高糖+蒲公英總黃酮+anti-miR-NC組（50 mmol/L葡萄糖+100μg/mL蒲公英總黃酮+轉(zhuǎn)染anti-miR-NC）、高糖+蒲公英總黃酮+anti-miR-129-5p組（50 mmol/L葡萄糖+100μg/mL蒲公英總黃酮+轉(zhuǎn)染anti-miR-129-5p）。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集上述實(shí)驗(yàn)分組的心肌細(xì)胞，并設(shè)置未添加細(xì)胞的空白組，根據(jù)CCK-8試劑盒的操作指導(dǎo)，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（OD）值，以（實(shí)驗(yàn)組－空白組）/（對(duì)照組－空白組）×100%計(jì)算細(xì)胞活性。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并重復(fù)3次。

1.5 試劑盒測(cè)定MDA、ROS含量和SOD、CAT、LDH活性 收集上述實(shí)驗(yàn)分組的心肌細(xì)胞上清，按照MDA、SOD、CAT、LDH、ROS檢測(cè)試劑盒的操作指導(dǎo)，分別檢測(cè)MDA、ROS含量和SOD、CAT、LDH活性。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估凋亡率 收集上述實(shí)驗(yàn)分組的心肌細(xì)胞，在冰PBS中洗滌，后根據(jù)AnnexinVFITC試劑盒的操作步驟，用AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀和FlowJo軟件評(píng)估凋亡率。

1.7 Western blotting檢測(cè)凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達(dá) 經(jīng)過(guò)不同分組的處理后，在冰PBS（pH=7.4）中洗滌2次，并用100μL蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液提取蛋白。取等量的蛋白（30μg），通過(guò)10%SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜（0.45μm）上。加入anti-Bcl-2（1∶1 000）、anti-Bax（1∶1 000）、anti-GAPDH（1∶1 000）抗體4℃孵育過(guò)夜。清洗3次后，將膜與HRP偶聯(lián)二抗（1∶3 000）孵育3 h，然后通過(guò)化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)免疫復(fù)合物，以GAPDH作為內(nèi)參，Image J軟件分析Bcl-2、Bax表達(dá)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)miR-129-5p表達(dá) TRIzol試劑充分提取心肌細(xì)胞RNA，使用MiScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，MiScript SYBR-Green PCR試劑盒在ABI 7500系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，以U6為對(duì)照，采用2-ΔΔCT方法確定miR-129-5p表達(dá)。引物由Takara設(shè)計(jì)和合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對(duì)照組比較，高糖組心肌細(xì)胞活性降低，LDH活性、MDA和ROS含量增加，SOD、CAT活性降低（均P＜0.05）。與高糖組比較，高糖+蒲公英總黃酮低、中、高濃度組心肌細(xì)胞活性升高，LDH活性、MDA和ROS含量降低，SOD、CAT活性逐漸升高，呈濃度依賴性（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 ，n=9

表2 蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 ，n=9

與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與高糖組比較，b P＜0.05；與高糖+蒲公英總黃酮低濃度組比較，c P＜0.05；與高糖+蒲公英總黃酮中濃度組比較，d P＜0.05。

2.2 蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，高糖組心肌細(xì)胞的凋亡率升高，Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高（P＜0.05）。與高糖組比較，高糖+蒲公英總黃酮低、中、高濃度組心肌細(xì)胞的凋亡率降低，Bcl-2蛋白水平升高，而B(niǎo)ax蛋白水平降低，呈濃度依賴性（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖1。

表3 蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響 ，n=9

表3 蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響 ，n=9

與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與高糖組比較，b P＜0.05；與高糖+蒲公英總黃酮低濃度組比較，c P＜0.05；與高糖+蒲公英總黃酮中濃度組比較，d P＜0.05。

圖1 蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.3 蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，高糖組心肌細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與高糖組比較，高糖+蒲公英總黃酮低、中、高濃度組心肌細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)水平升高，呈濃度依賴性（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)的影響 ，n=9

表4 蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)的影響 ，n=9

與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與高糖組比較，b P＜0.05；高糖+蒲公英總黃酮低、中、高濃度組與高糖組比較，F(xiàn)=300.014，P＜0.001；與高糖+蒲公英總黃酮低濃度組比較，c P＜0.05；與高糖+蒲公英總黃酮中濃度組比較，d P＜0.05。

2.4 miR-129-5p過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 高糖+miR-129-5p組較高糖+miR-NC組提高心肌細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)水平、細(xì)胞活性，降低LDH水平、MDA和ROS含量，增強(qiáng)SOD、CAT活性，降低凋亡率，提高Bcl-2蛋白水平且降低Bax蛋白水平（P＜0.05），見(jiàn)表5、圖2。

圖2 miR-129-5p過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

表5 miR-129-5p過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 ，n=9

表5 miR-129-5p過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 ，n=9

2.5 抑制miR-129-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用 與高糖+蒲公英總黃酮+anti-miR-NC組相比，高糖+蒲公英總黃酮+anti-miR-129-5p組降低心肌細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)水平、細(xì)胞活性，增加LDH水平、MDA和ROS含量，減弱SOD、CAT活性，提高凋亡率，降低Bcl-2蛋白水平，并提高Bax蛋白水平（P＜0.05），見(jiàn)表6、圖3。

圖3 抑制miR-129-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用

表6 miR-129-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用 ，n=9

表6 miR-129-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蒲公英總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用 ，n=9

3 討論

高血糖引起的心臟損害的細(xì)胞和分子機(jī)制是復(fù)雜和多因素的，其引起的活性氧升高，炎癥和細(xì)胞凋亡是糖尿病性心肌病發(fā)展的主要前體和促成因素[10]。心肌細(xì)胞的凋亡是高血糖引起的炎癥和心臟氧化應(yīng)激的重要結(jié)果之一[11]。因此，抑制心肌細(xì)胞的凋亡是預(yù)防糖尿病性心肌病的關(guān)鍵步驟。在Bcl-2家族中，Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用，而B(niǎo)ax發(fā)揮促凋亡作用[12]。此外，氧化應(yīng)激在糖尿病性心肌病的致病性發(fā)展中具有重要作用[13]。MDA、SOD、CAT、LDH、ROS是氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖可提高心肌細(xì)胞的凋亡率和促凋亡蛋白Bax水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2水平，并提高M(jìn)DA、ROS含量、LDH活性，降低細(xì)胞活性、SOD、CAT活性（P＜0.05），與王蕊等[14]報(bào)道的結(jié)果相符。

蒲公英在中國(guó)被用作傳統(tǒng)藥物和食品補(bǔ)充劑已有數(shù)百年的歷史[15]，具有抗菌、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等活性，是臨床常用的清熱解毒藥[16]。此外，其抗氧化作用已被廣泛報(bào)道，例如在Nω-硝基-1-精氨酸甲基酯誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型中，蒲公英提取物降低了MDA水平，可抵抗自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激[17]。在輻射誘發(fā)的大鼠肝組織損傷中，蒲公英根提取物給藥減輕了肝臟的氧化應(yīng)激，能夠降低MDA含量和肝細(xì)胞壞死，升高SOD、CAT的活性[18]。在香煙煙霧所致慢性阻塞性肺小鼠模型中，蒲公英總黃酮降低MDA含量并升高SOD水平，產(chǎn)生抗氧化效果[19]。然而，蒲公英總黃酮在糖尿病性心肌病中的功能仍不清楚。本研究觀察到，25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL蒲公英總黃酮以濃度依賴方式顯著降低了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中MDA、ROS含量、LDH活性、凋亡率和促凋亡蛋白Bax水平，并提高細(xì)胞活性、SOD、CAT活性、抗凋亡蛋白Bcl-2水平（P＜0.05），說(shuō)明蒲公英總黃酮通過(guò)調(diào)控Bax、Bcl-2蛋白和MDA、SDO、CAT水平減少細(xì)胞凋亡，改善氧化應(yīng)激，從而保護(hù)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

miR-129-5p被證明參與了各種人類癌癥的發(fā)展[20-21]。Majumdar等[22]首先發(fā)現(xiàn)miR-129-5p通過(guò)靶向細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的增殖。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-129-5p在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中抑制內(nèi)皮細(xì)胞自噬，暗示其在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中的潛在作用[23]。Zhang等[24]闡明了miR-129-5p抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬和凋亡的作用。miR-129-5p可抑制心肌缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞中LDH活性并降低MDA的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞活力，并抑制凋亡[7]。然而，miR-129-5p在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中所起的作用仍然不清楚。本研究檢測(cè)到高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-129-5p表達(dá)下調(diào)，而25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL蒲公英總黃酮干預(yù)后，miR-129-5p表達(dá)上調(diào)。miR-129-5p過(guò)表達(dá)后，高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性、SOD、CAT活性、Bcl-2蛋白水平升高，MDA、ROS含量、LDH活性、凋亡率、Bax蛋白水平降低（P＜0.05），提示miR-129-5p可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激，從而改善高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-129-5p后，蒲公英總黃酮抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的活性、凋亡和氧化應(yīng)激的作用被逆轉(zhuǎn)，提示miR-129-5p是介導(dǎo)蒲公英總黃酮保護(hù)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的重要因子。另有研究報(bào)道，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2[7]、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6[22]、ATG14[24]是miR-129-5p的下游靶基因，推測(cè)miR-129-5p在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的重要功能可能與這幾個(gè)靶基因有關(guān)，這將是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

綜上，蒲公英總黃酮可以提高高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性，減少細(xì)胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激損傷其機(jī)制與上調(diào)miR-129-5p有關(guān)，可為蒲公英總黃酮在糖尿病性心肌病患者中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。