陳瀟航，黃偉華，顏梅新

（1廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院甘蔗研究所/中國農業(yè)科學院甘蔗研究中心/農業(yè)部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，廣西南寧 530007；2廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣東廣州 510642；3廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院生物技術研究所，廣西南寧 530003；4百色市農業(yè)科學研究所／廣西農業(yè)科學院百色分院，廣西百色 533000）

芋〔（L）.Schott〕又名芋頭，屬天南星科，多年生草本植物。芋具有較高營養(yǎng)價值和藥用價值，是世界各地廣為栽培的特色蔬菜和糧食作物。廣西是全國芋頭主要產區(qū)之一，其中有著悠久栽培歷史的荔浦芋，以其品質優(yōu)及地域特色備受人們的喜愛，成為國家地理標志保護農產品。近幾年，由于特色作物的發(fā)展和人們對芋頭產品的青睞，芋頭種植面積大幅度提高。種植方式從零星種植轉變?yōu)檫B片規(guī)模種植，從而導致芋病蟲害嚴重發(fā)生。自2015 年，廣西荔浦多個檳榔芋種植田塊相繼出現(xiàn)一種細菌性病害。該病主要危害地下球莖，球莖染病，球莖組織變褐，向內腐爛，球莖迅速軟化、腐敗，出現(xiàn)黏液并散發(fā)惡臭味，最終全株枯萎倒伏死亡，具“細菌性軟腐病”的明顯特征，嚴重影響芋頭產量和品質。據我們調查該病一般發(fā)病率為30%～50%，嚴重的全田失收。另外，由于該病的危害使得芋作物不能連栽，從而導致土地不能充分利用，種植成本提高，影響產量及市場供需，目前該病已成為阻礙芋頭生產的重要制約因素，嚴重影響芋產業(yè)的發(fā)展。由于病因不明，病害防治困難，種植戶強烈要求相關部門對該病害進行研究與控制。為明確廣西荔浦檳榔芋“細菌性軟腐病”的病原，本研究對該病原菌進行了分離，并利用生理生化測定和分子生物學手段對該病原菌進行鑒定，為該病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離和培養(yǎng)

從廣西荔浦檳榔芋栽培區(qū)采集患芋軟腐病的發(fā)病植株樣本，選取具有典型軟腐病癥狀的芋球莖發(fā)病組織，采用常規(guī)組織分離方法，將病組織依次按如下步驟進行表面消毒：95%乙醇浸泡15 s，75%乙醇浸泡30 s，無菌水清洗3 次。鏡檢后，將觀察有噴菌現(xiàn)象的病組織浸出液，用無菌接種環(huán)接種于LB 培養(yǎng)基上，通過平板三區(qū)劃線法進行菌株分離。平板置于28℃培養(yǎng)48 h，分別挑取單個菌落進行純培養(yǎng)，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 致病性測定

將檳榔芋球莖用水清洗干凈，用干凈的水果刀將芋球莖切成長4～7 cm，寬3～6 cm，厚度1cm 左右的切片，放置于直徑15 cm 的培養(yǎng)皿中。將過夜培養(yǎng)的分離物配成10CFU·mL懸浮液，吸取5～10 μL 細菌懸浮液，滴至芋切片表面，芋切片周圍放置濕水棉團，蓋上皿蓋保濕，置于28℃培養(yǎng)16～24 h，記錄發(fā)病結果，設接種培養(yǎng)液為對照。對接種發(fā)病的芋球莖組織進行病原再分離，觀察分離物是否與接種菌株一致。

1.3 細菌的形態(tài)和鞭毛觀察

用無菌水將細菌配制成懸浮液，醋酸鈾（pH4.5）負染1～2 s 后，電鏡（JEM1200EX）觀察并拍照。

1.4 生理生化測定

對能夠導致芋球莖產生軟腐病的分離物進行生理生化特性的測定，主要包括：革蘭氏染色、接觸酶、氧化酶活性、厭氧生長、D-葡萄糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、麥芽糖發(fā)酵、山梨醇發(fā)酵、木糖發(fā)酵、棉子糖發(fā)酵、淀粉水解、明膠液化、37℃生長、甘露醇發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、D-海藻糖發(fā)酵、L-鼠李糖發(fā)酵、纖維二糖發(fā)酵等，試驗重復3 次。

1.5 PCR 擴增

將細菌分離物在LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后，采用細菌DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取細菌分離物全基因組DNA。以提取后的DNA 作為PCR 擴增模板，應用表1 所示引物進行PCR 擴增。反應體系總體積均為25 μL，包括2×Tag PCR MasterMix 12.5 μL，DNA 1.0 μL，引物各1.0μL，雙蒸水10.5μL。反應程序為：94℃5 min；94℃30 s，退火55℃30 s，72℃1 min，30 個循環(huán)；72℃10 min。PCR 擴增產物送英駿生物技術進行測序。

表1 本研究中所用引物及其序列

測序結果使用BioEdit 7.25 修剪低質量序列，然后使用DNAMAN 將序列進行拼接，最后使用Phylosuit 1.2.2進行序列對齊并構建進化樹，在ITOL上對進化樹進行編輯。

2 結果與分析

2.1 危害癥狀

該病主要為害檳榔芋球莖，引起芋球莖組織變褐腐爛、變軟，植株發(fā)黃萎蔫枯萎，后期芋球莖內部組織繼續(xù)軟化、腐敗，出現(xiàn)黏液并伴有惡臭味（圖1A），有些球莖內部組織干燥發(fā)黑，形成空洞，最終全株枯萎死亡。

2.2 病原細菌分離和致病性測定

從廣西荔浦檳榔芋栽培區(qū)采集到的芋軟腐病發(fā)病植株，對100 塊病組織進行病原菌分離，共分離純化出4 株菌株，其中一株菌株占比達到85%，將其命名為Pec1 。通過16S rDNA 通用引物進行PCR 擴增，獲得大約為1.5 kb 的特異性片段，測序所獲得序列經BLAST 分析，結果表明Pec1 與P.subsp.PC1（GenBank Accession No.CP001657.1）的相似度為99.34%。對芋球莖切片組織進行回接菌株Pec1，同時設置空白培養(yǎng)液作對照。結果表明，接種24 h 后，接種菌株Pec1 的芋球莖組織出現(xiàn)水漬狀的腐爛癥狀（圖1C），對照芋球莖組織未出現(xiàn)此癥狀（圖1B）。重新分離發(fā)病的芋球莖組織上病原菌，結果分離物與接種菌Pec1 培養(yǎng)形態(tài)完全一致。將重新分離的病原菌再次用16S rDNA 通用引物進行擴增測序，測序結果進行BLAST，結果與Pec1 的結果一致?？梢娋關ec1 是引起芋軟腐病的致病菌。

圖1 芋軟腐病癥狀及病原

2.3 菌體形態(tài)特征與生理生化特征

菌株Pec1 在NA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，菌落呈圓形或者近圓形，邊緣光滑；革蘭氏陽性，電鏡顯微下，菌體為短桿狀，無芽孢產生，具鞭毛（圖1E）。生理生化測試結果表明菌株可在37℃和厭氧條件下生長，接觸酶、氧化酶反應為陽性；不能使山梨醇發(fā)酵、木糖發(fā)酵、麥芽糖發(fā)酵，淀粉水解反應為陰性；可利用D-葡萄糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、蔗糖、D-海藻糖、L-鼠李糖、纖維素二糖，能使明膠液化。以上形態(tài)特征與生理生化特征與胡蘿卜果膠桿菌subsp.高度相似。

2.4 Pec1 菌株16S rDNA 序列測定分析結果

基于16S rDNA 的進化樹顯示，Pec1 與subsp.親緣關系最近，聚在同一簇（圖2），但自舉支持率僅有69%。通過對icdA、mdh、mtld、proA 四個管家基因進行多基因聯(lián)合建樹，得到圖3 所示進化樹，由圖可知Pec1 與subsp.PC1 仍然聚集在同一簇，并且自舉支持率達到99%。

圖2 基于16S rDNA 序列進化樹分析

圖3 基于四個管家基因的多基因序列進化樹分析

3 結論與討論

自2015 年，廣西荔浦多個檳榔芋種植區(qū)相繼出現(xiàn)一種細菌性病害。該病主要為害地下球莖，球莖染病，球莖組織變褐，向內腐爛，球莖迅速軟化、腐敗，出現(xiàn)黏液并散發(fā)惡臭味，最終全株枯萎倒伏死亡，該病嚴重影響芋頭產量和品質。為明確病原分類地位，本研究對芋細菌性軟腐病病原菌進行了分離，分離物在NA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，菌落呈圓形或者近圓形，邊緣光滑；革蘭氏陽性，電鏡顯微下，菌體為短桿狀，無芽孢產生，具鞭毛。經柯赫氏法則驗證，分離物接種芋球莖組織引起的腐爛癥狀與田間芋球莖腐爛癥狀一致，重新分離發(fā)病的芋球莖組織上的病原菌，與原接種物培養(yǎng)形態(tài)完全一致，證明了該細菌是引起芋細菌性軟腐的致病菌。

經生理生化測定，結果顯示該病原細菌可37℃和厭氧生長，可使接觸酶、氧化酶反應為陽性，不能發(fā)酵山梨醇、木糖、麥芽糖，不能水解淀粉，能使明膠液化；可利用D-葡萄糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、蔗糖、D－海藻糖、L－鼠李糖、纖維素二糖。這些生理生化特性與胡蘿卜果膠桿菌subsp.高度相似。其16S rDNA 序列分析結果顯示該病原細菌與subsp.親緣關系最近，相似度為99.34%，且進化樹顯示，它們聚在同一簇。并且icdA、mdh、mtld、proA 四個管家基因多基因聯(lián)合分析也證實Pec1 與subsp.同源性最高。這些信息進一步證明了subsp.為芋細菌性軟腐病的病原菌。本研究結果與福鼎市的檳榔芋軟腐病的病原鑒定結果一致。

據報道，subsp.（Jones）Bersey et al.稱為胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐致病型病原，也可引起檳榔芋軟腐病菌。而本研究分離獲得的芋（檳榔芋）軟腐病病原P.subsp.接種多子芋，也可引起腐爛癥狀，這證實該病原細菌對芋類作物造成潛在威脅。

由于在細菌分類上是一個大屬，本研究獲得的subsp.與原先報道的檳榔芋軟腐病病原subsp.（Jones）Bersey et al.是否為同一種細菌還需要進一步甄別。

本文通過形態(tài)特征觀察、生理生化測定和16S rDNA 以及4 個看家基因進行多位點序列分析，鑒定出一株引起芋細菌性軟腐病的病原菌subsp.菌株Pec1。研究結果旨在為芋軟腐病病原的致病機理研究提供材料以及該病害防治提供理論依據。