容世清，羅建華，李天卓，曾少玲，薛晶晶，全吉文

湛江市林業(yè)科學研究所，廣東湛江 524037

黑木相思（Acacia melanoxylon R.Br）是含羞草科金合歡屬的常綠喬木，原產澳大利亞，中國閩、粵、桂、瓊四省區(qū)有種植栽培，具有強陽性、耐干旱、耐瘠薄等特性，且能耐-6℃的低溫。黑木相思有根瘤固N 功能，凋落物豐富，改土性能好，是四旁綠化和荒山造林的良好樹種[1]。因其木材耐腐、木紋美麗，且聲學性能優(yōu)異，目前有加大栽培種植的趨勢。有關黑木相思的組培試驗研究，黃烈健、王鴻等以無菌苗之葉片、葉柄、莖段為材料，在脫分化產生愈傷組織的基礎上，再分化產生不定芽[2]；裘珍飛、曾炳山等人研究了不同激素組合的黑木相思的增殖效應，以不定根發(fā)生效應的比較，認為6BA 的濃度在0.5mgL-1，增殖效應最佳[3]，而孫雪陽、呂華麗等的研究認為IBA 為理想的生根誘導劑，最佳作用濃度為0.5mgL-1[4]，該文為黑木相思組培工作的總結。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

2020 年在湛江市林業(yè)科學研究所引種栽培的黑木相思群體中選取正常生長的表形良好的健壯植株，取其半木質化萌芽條。

1.2 試驗方法

在晴好天氣條件下，選取生長旺盛的植株，用小剪刀剪取其帶灰白色的小枝條，帶回實驗室，先用經(jīng)消毒后的無菌清水漂洗其表面附著的灰尖，然后在超凈臺上用75%的酒精快速處理3s，再用0.1%的升汞處理5min～10min，最后分別用4 瓶無菌水漂洗，去掉其表面的殘留升汞藥液，接著用23#刀片分段切開，每段留2 個腋芽，每瓶培養(yǎng)基單獨接種一段，兩周后檢查統(tǒng)計外植體的污染情況和生理反應狀況。把污染帶菌的清理，留下成功脫菌的部分繼續(xù)進行培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時間延長，培養(yǎng)繼代次數(shù)增加，潛伏的腋芽逐漸萌發(fā)，初始時為單個芽，逐漸形成多個芽集成的叢生結構，并伴有相思類特有的羽狀復葉的發(fā)生。待有一定數(shù)量時，把繼代增殖培養(yǎng)階段的不定芽單個分切，接入不定根誘導培養(yǎng)基，促進其根系的發(fā)生與形成，構建一個根基葉全部齊全的完整小植株，最后煉苗移栽。

1.3 培養(yǎng)基

以MS 為基本培養(yǎng)基，根據(jù)需要適當調整其大量元素的配比，稱為改良MS 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加相應的生長調節(jié)物質，蔗糖30gL-1、卡拉膠5.5gL-1固化，pH5.8，經(jīng)蒸汽121℃滅菌20min 后備用。

1.4 培養(yǎng)環(huán)境

所有無菌材料在培養(yǎng)室內培養(yǎng)，以自然陽光的光源，可根據(jù)光照強度變化而調節(jié)其直射光與散射光，光照強度在2000Lux～4000Lux，氣溫26℃。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

有效率=正常不帶菌的外植體/接種數(shù)×100%

褐化率=褐化的外植體/接種數(shù)×100%

生根率=生根數(shù)/接種數(shù)×100%

移栽成活率=成活株數(shù)/移栽總數(shù)×100%

2 試驗結果與分析

2.1 不同升汞處理時間對外植體有效率的影響

外植體的成功植入是培養(yǎng)工作的起點。試驗中，使用升汞藥液消毒為主要技術措施，該實驗設置了5min、10min、15min 3 個處理時間。

從表1 可以看出，升汞處理時間低于5min，有效率偏低，10min 時有效率接近一半，但同時伴帶藥害，而15min 時莖段受害嚴重。適宜的處理時間應是5min～10min 范圍內。另外，木質化程度不同的小枝莖段對升汞藥液的反應差異明顯，幼嫩沒有充分木質化的莖段不耐藥，緩沖耐受能力差，極容易失活，而偏老的小莖段枝，雖然耐受能力強但再生能力差，難以誘發(fā)新的腋芽長出，半木質化的小莖段是理想的外體植材料。

表1 不同升汞（0.1%）處理時間的有效性比較Tab.1 Compare the Processing Time to the Efficiency of Different Mercury Bichloride

2.2 單芽的萌發(fā)與叢生芽的形成

莖段外植體在初代培養(yǎng)基上經(jīng)20d～30d 的培養(yǎng)，其潛伏腋芽逐漸萌發(fā)形成單芽（見圖1-a），誘導萌芽比例見表2。

表2 莖段初代培養(yǎng)的誘導率Tab.2 The Inductivity of Primary Culture of Stem

從表2 看出，有效的外植體萌發(fā)率相當高，平均為94.4%，幾乎全部誘導萌發(fā)。說明黑木相思的莖段的初代誘導在培養(yǎng)基適合的條件下，難度已大大下降。隨著培養(yǎng)時間延長，繼代次數(shù)的增加，其葉狀柄的頂端逐漸有羽狀復葉的形成，并逐漸增多，原來明顯的葉狀柄完全消失。為了尋找最適合的6BA 增殖效應，設立了0.2mgL-1、0.4mgL-1、0.6mgL-13 個濃度范圍的對比試驗，見表3。

表3 不同6BA 濃度對叢生芽增殖的影響差異Tab.3 The Difference of Effects of Cluster Bud Proliferation with Different 6BA Concentration

從表3 看出，在6BA 在0.2mgL-1～0.6mgL-1的范圍內，隨著濃度的增加，增殖效應也逐漸增加，適宜的濃度應在0.4mgL-1左右。過低或過高的濃度均不利于叢芽的增殖和形態(tài)的恢復。這一結果與他人的0.1mgL-1～0.7mgL-1的6BA 濃度，較為相符。

從表4 看出，在6BA 0.3mgL-1的水平時，隨著NAA 濃度的增加，生長速度開始減緩，說明NAA 在增殖階段上有延緩生長的作用，有利于細胞液濃度的增加，細胞壁的增厚，硬度增強，進一步木質化，從生長速度看，濃度以不超過0.1 mgL-1為宜。這與裘珍飛等的研究結果相似，過高濃度的生長素對增殖效應有抑制作用。

表4 6BA 與NAA 組合配比對叢生芽增殖的影響差異Tab.4 The Difference of Effects of Cluster Bud Proliferation with the Combination Ratio of 6BA and NAA

2.3 繼代培養(yǎng)過程中形態(tài)特征的變化

黑木相思在不斷地繼代培養(yǎng)過程中，在自然環(huán)境下極少見的羽狀復葉逐漸恢復并且數(shù)量增加，到葉狀柄完全消失，代之而起的是羽狀復葉完全恢復，這一特征，可作為組織恢復幼態(tài)化的典型形態(tài)特征(見圖1-b)。

圖1 (1-a：外植體誘導萌發(fā)；1-b：叢生芽繼代培養(yǎng)；1-c：不定根誘導植株；1-d：移栽后植株)Fig.1 (1-a：Explants Induced Germination；1-b：Subculture of Clustered Buds；1-c：Plant Induction by Adventitious Roots；1-d：Plant after Transplanting)

2.4 不同IBA 濃度對生根率的影響

將在繼代增殖培養(yǎng)過程中的粗壯有效的單芽切下，轉接入生根培養(yǎng)基，促使不定根的發(fā)生，從而形成完整的小植株。該研究試驗了不同濃度范圍的IBA 對不定根發(fā)生的影響（見圖1-c）。

從表5 看出，在試驗的濃度范圍內，IBA 能有效地誘導不定根的發(fā)生，濃度范圍應在0.6mgL-1～1.2 mgL-1之間，根系發(fā)達，每株有2 條～5 條根，色白，活力足。

表5 不同IBA 濃度對生根率的影響Tab.5 The Impact of Rooting Percentage of Different IBA Concentration

2.5 煉苗與移栽

將剛出根的瓶苗從培養(yǎng)室移出煉苗棚里，曬煉15d～20d，瓶苗植株逐漸老熟，充分木質化后再用清水小心洗出直接移栽入純黃心土或谷殼+泥炭的輕基質段中，成活率90%以上，而且穩(wěn)定（見圖1-d）。

3 結論與討論

（1）該試驗結果表明黑木相思的繼代增殖培養(yǎng)，其適宜培養(yǎng)基為MS+6BA0.3+NAA0.05 ～0.1+ 糖30gL-1+卡拉膠5.5gL-1；適宜的生根培養(yǎng)基為0.5MS+IBA0.6～1.2mgL-1+糖15gL-1+卡拉膠7gL-1。經(jīng)多批次實踐，穩(wěn)定性良好。這個結果與裘珍飛、曾炳山等人的研究結論基本相符。小幅度偏差可能是與試驗材料（品種、無性系）不同有關。

（2）黑木相思在不斷重復的繼代培養(yǎng)過程中，羽狀復葉的完全恢復，可視為材料已得到充分的幻態(tài)化的標志。這一特征與其種子萌發(fā)初期的形態(tài)特征完全一致，區(qū)別只在于種子萌發(fā)的是胚根，而組培誘導產生的是不定根，莖、葉完全一致。

（3）該試驗由腋芽起源到叢生芽的分化，避免經(jīng)過脫分化產生中間環(huán)節(jié)的愈傷組織，其再生植株的遺傳穩(wěn)定性是可靠的、安全的。

（4）黑木相思在冬季月平均最低溫的1～2 月份的極端天氣條件下，往往不定根發(fā)生效果比較差，煉苗效果差，植株弱。在具體生產中注意避開這個時段，靈活安排調整計劃。