李天昊，李學(xué)暖，樊靜靜，唐林麗，覃丹鳳，2，程昊，3

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院 廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，廣西 柳州 545005；3.蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530004)

木犀草素(LUT)廣泛存在于植物中。研究表明，木犀草素具有較高醫(yī)用價值[1]。此外，木犀草素攝入量與心血管疾病及腫瘤風(fēng)險呈相關(guān)性[2-3]。目前，木犀草素檢測法有分光光度法[4]、高效液相色譜法[5-6]和毛細(xì)管電泳法[7]等。上述方法雖檢測效果良好，但是耗時且前處理麻煩。而電化學(xué)分析法具有靈敏度高、設(shè)備成本低、檢測方法簡單等優(yōu)點。

金屬摻雜沸石咪唑酯骨架結(jié)構(gòu)材料(MOFs)具備高孔隙率、高比表面積和易功能化等特點[8]，因此廣泛應(yīng)用于電化學(xué)領(lǐng)域[9-11]。本研究以MOF-5為硬模板，制備了立方體形貌的ZnO/ZnS納米材料，且應(yīng)用于木犀草素的電化學(xué)檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

Zn(NO3)2·6H2O(純度≥99.0%)、木犀草素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，平均分子量為58 000)、三乙胺、對苯二甲酸(BDC)、硫代乙酰胺(TAA)、無水乙醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鉀、磷酸均為分析純；實驗用水均為超純水。

ProX型掃描電子顯微鏡(SEM)；D8 Advance型X射線衍射儀(XRD)；CHI660E系列電化學(xué)工作站；玻璃碳電極(GCE)、Ag/AgCl電極、鉑絲電極均購于天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ZnO/ZnS納米材料的制備

1.2.1.1 MOF-5的制備 將 0.859 0 g 的 Zn(NO3)2·6H2O 溶于7 mL的DMF中，制備出A溶液。將0.215 3 g的BDC溶于7 mL的DMF中，制備出B溶液。向三口燒瓶依次加入7.669 g的PVP、126 mL乙醇、280 mL的DMF和75 μL三乙胺，超聲至PVP完全溶解后，再加入7 mL的B溶液。在120 ℃條件下回流15 min，再向三口燒瓶加入7 mL的A溶液，待溶液出現(xiàn)白色渾濁，停止加熱，并用冰水浴迅速降溫，待溫度降低至室溫后，離心處理，用DMF洗滌3遍，將產(chǎn)物置于60 ℃烘箱中干燥，即可制備MOF-5材料。

1.2.1.2 TAA@MOF-5的制備 在三口燒瓶中加入30 mg的MOF-5和30 mL的乙醇并超聲分散均勻，隨后加入0.135 g的TAA，在90 ℃條件下回流30 min。冷卻、離心、清洗后，將產(chǎn)物置于60 ℃烘箱中干燥，即可得到TAA@MOF-5材料。

1.2.1.3 ZnO/ZnS納米材料的制備 將TAA@MOF-5置于管式爐中，在N2氛圍下，以1 ℃/min的速度升溫至600 ℃并保溫2 h，冷卻后即可得到ZnO/ZnS納米材料。

1.2.2 GCE的預(yù)處理 GCE用0.5 μm的氧化鋁粉末在麂皮上打磨至光滑，將拋光好的電極依次在超純水和乙醇中超聲清洗，最后用N2氣流將玻碳電極表面吹干。

1.2.3 ZnO/ZnS/GCE修飾電極的制備 將適量ZnO/ZnS納米材料超聲分散于DMF中，制備 1 mg/mL 的ZnO/ZnS均勻修飾液。用移液槍準(zhǔn)確移取5 μL的上述分散液至預(yù)處理好的玻碳電極表面，室溫條件下待分散液完全蒸發(fā)時，則ZnO/ZnS/GCE修飾電極制備完成。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 無水乙醇作為溶劑，溶解木犀草素。經(jīng)逐級稀釋處理后，即可制得 0.001 mol/L 和0.01 mol/L木犀草素標(biāo)準(zhǔn)儲備液用于后續(xù)的分析測試。

1.2.5 電化學(xué)方法 本實驗采用三電極系統(tǒng)，參比電極為飽和Ag/AgCl電極，對電極為鉑絲電極，工作電極為ZnO/ZnS修飾的GCE(ZnO/ZnS/GCE)。

在三電極系統(tǒng)中，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)作為木犀草素檢測的電解質(zhì)溶液。檢測方法為差示脈沖溶出伏安法(DPV)，電位增量 0.004 V，脈沖幅度0.05 V，脈沖周期0.1 s，脈沖寬度 0.04 s，采樣寬度0.01 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 表征部分

通過SEM對MOF-5、TAA@MOF-5和ZnO/ZnS納米材料的形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。圖1 a為MOF-5的SEM圖，所合成的MOF-5材料具有明顯的立方體形貌，材料顆粒大小相對均勻。MOF-5經(jīng)TAA回流處理后，所得到的TAA@MOF-5材料依然繼承了MOF-5的立方體形貌，TAA@MOF-5表面相對粗糙(圖1b)。當(dāng)TAA@MOF-5經(jīng)高溫碳化后制備的ZnO/ZnS仍然能夠保持MOF-5的立方體形貌，但部分ZnO/ZnS顆粒的立方體結(jié)構(gòu)因為高溫的原因而發(fā)生了一定數(shù)量的坍塌(圖1c)。

圖1 MOF-5材料(a)、TAA@MOF-5材料(b)和 ZnO/ZnS納米材料(c)的SEMFig.1 SEM image of the MOF-5 sample(a)，TAA@MOF-5 sample(b) and ZnO/ZnS nanomaterials(c)

用XRD對所制備的材料進(jìn)行物相分析，所獲得的XRD圖譜見圖2。

由圖2可知，所制得的材料在2θ為28.7，47.7，56.3°附近分別出現(xiàn)了ZnS(111)、(220)、(311)晶面的特征衍射峰，ZnS的標(biāo)準(zhǔn)卡片號為JCPDS 65-0309。在2θ為31.5，36.3，56.6，62.7，67.4°附近出現(xiàn)了ZnO(100)、(101)、(110)、(103)、(112)晶面的特征衍射峰，ZnO的標(biāo)準(zhǔn)卡片號為JCPDS 36-1451。

圖2 ZnO/ZnS納米材料的XRD衍射圖Fig.2 XRD patterns of ZnO/ZnS

采用Mapping對ZnO/ZnS納米材料中的S、Zn、C、O和N元素分布情況進(jìn)行了分析。Mapping實驗結(jié)果表明(圖3b～3f)，所制備的材料含有S、Zn、C、O和N元素，這一結(jié)果與XRD分析結(jié)果保持一致。并且S、Zn、C、O和N元素在材料中分布均勻。

圖3 ZnO/ZnS材料中S、Zn、C、O和 N元素相應(yīng)Mapping圖Fig.3 Mapping of S，Zn，C，O and N elements in ZnO/ZnS material

2.2 木犀草素在不同電極上的電化學(xué)響應(yīng)

為了比較不同電極的DPV響應(yīng)性能，在相同條件下分別用GCE和ZnO/ZnS/GCE檢測5 μmol/L木犀草素，實驗結(jié)果見圖4。

圖4 GCE和ZnO/ZnS/GCE在相同條件下 對木犀草素檢測的DPV曲線圖Fig.4 DPV curves of 5 μmol/L luteolin determined by GCE and ZnO/ZnS/GCE under the same conditions

由圖4可知，與ZnO/ZnS/GCE相比，裸GCE的峰電流信號遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于ZnO/ZnS/GCE，兩者峰電流信號相差16倍。這主要歸因于ZnO/ZnS納米材料大的比表面積、豐富的孔結(jié)構(gòu)和獨特的3D立方體形貌。

2.3 實驗條件的影響

2.3.1 ZnO/ZnS納米材料修飾量的選擇 材料修飾量是影響電化學(xué)響應(yīng)信號的一個重要參數(shù)。圖5a 展示的是ZnO/ZnS的修飾量為5 μL，濃度為0.5～2.5 mg/mL范圍時，所對應(yīng)的峰電流信號。

由圖5a可知，當(dāng)材料濃度由0.5 mg/mL增加到1.0 mg/mL時，峰電流值也逐漸增大。當(dāng)材料修飾量濃度為1 mg/mL時，ZnO/ZnS/GCE對木犀草素檢測響應(yīng)信號達(dá)到最大。隨著修飾濃度的繼續(xù)增加，電化學(xué)響應(yīng)信號開始減小。這是因為修飾量的增加使覆蓋層變厚繼而導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移受阻。因此，實驗選擇修飾量1 mg/mL為材料的最佳修飾濃度。

圖5 5 μmol/L木犀草素在0.1 mol/L PBS 溶液中的DPV參數(shù)優(yōu)化Fig.5 Optimization of parameters for DPV of 5 μmol/L luteolin in 0.1 mol/L PBS solutiona.ZnO/ZnS濃度；b.富集電壓；c.富集時間；d.緩沖溶液的pH值

2.3.2 富集電位的影響 在0.2～0.6 V的范圍內(nèi)探討了峰電流信號與富集電位之間的關(guān)系，見圖5b。

由圖5b可知，木犀草素的峰電流從0.2～0.4 V 遞增，最大峰電流出現(xiàn)在0.4 V，說明在 0.4 V 時修飾電極對木犀草素的吸附效果最好。當(dāng)富集電位>0.4 V時，電流響應(yīng)值開始降低。因此，最佳的富集電位選擇0.4 V。

2.3.3 富集時間的影響 本實驗優(yōu)化了ZnO/ZnS/GCE對木犀草素吸附的富集時間，從60～180 s，以30 s為梯度設(shè)置了富集時間，結(jié)果見圖5c。

由圖5c可知，隨著富集時間的延長，木犀草素的氧化峰電流逐漸增大。當(dāng)沉積時間延長到120 s時，峰值電流達(dá)到一個穩(wěn)定值。結(jié)果表明，ZnO/ZnS/GCE對木犀草素的吸附在120 s時穩(wěn)定且達(dá)到飽和。所以，富集時間為120 s是電化學(xué)測定木犀草素的最佳富集時間。

2.3.4 pH的優(yōu)化 實驗探討了緩沖溶液PBS的pH值對峰電流信號的影響。圖5d 表示了PBS緩沖溶液在pH為1.0，1.5，2.0，2.5和3.0時的氧化峰電流的變化。

由圖5d可知，木犀草素的氧化峰電流隨pH值從1.0升高到2.0而增大。pH為2.0時出現(xiàn)了最大峰值電流。隨著pH值的增加，木犀草素響應(yīng)峰電流減小。實驗采用pH=2.0作為電化學(xué)測定的最佳pH值。

此外，溶液pH值也與電極和電解質(zhì)界面間的質(zhì)量傳遞過程有關(guān)。由圖6A可知，氧化峰電位隨著pH值從1.0增加到3.0呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。氧化峰電位(Epa)與pH值呈線性關(guān)系。線性回歸方程為：Epa=-0.056 pH+0.692，R2=1.00(圖6B)。線性方程的斜率經(jīng)計算為 0.056 mV/pH，接近于 0.059 mV/pH 的理論能量值[12]。這表明木犀草素電化學(xué)氧化過程中的質(zhì)子和電子轉(zhuǎn)移數(shù)量是相等的[13]。

圖6 在不同pH下ZnO/ZnS/GCE對木犀草素檢測的 DPV曲線圖(A)和氧化峰電位與pH值的線性關(guān)系(B)Fig.6 DPV response curves of luteolin on ZnO/ZnS/GCE with different pH values(A) and the linear relationship of the oxidation peak potential versus pH(B)

2.4 線性回歸方程的建立

在本文所建立的最佳條件下，在0.1～0.7 V電壓范圍內(nèi)，用DPV法測定了不同濃度木犀草素在ZnO/ZnS/GCE上的DPV響應(yīng)曲線。由圖7可知，隨著木犀草素濃度的不斷增加，ZnO/ZnS/GCE對木犀草素的峰值電流反應(yīng)也逐漸增大。結(jié)果表明，在0.1～10 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，木犀草素的平均峰電流與木犀草素的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。對應(yīng)線性圖的線性方程為Ip(μA)=15.602c-0.266，R2=0.999(Ip：峰值電流強度，c：木犀草素濃度)，檢測限約為0.012 μmol/L(S/N=3)。

圖7 ZnO/ZnS/GCE檢測不同木犀草素的 濃度的DPV曲線圖Fig.7 The DPV curves recorded using ZnO/ZnS/GCE for varying luteolin concentration

2.5 ZnO/ZnS/GCE的重復(fù)性和重現(xiàn)性

在最優(yōu)的條件下探討了ZnO/ZnS/GCE對木犀草素檢測的重復(fù)性，使用同一根修飾電極對 5 μmol/L 的木犀草素進(jìn)行了5次檢測，由此5次峰電流計算的RSD為0.73%，說明ZnO/ZnS/GCE對木犀草素檢測的重復(fù)性良好。在相同的條件下制備了5根ZnO/ZnS/GCE，并且在最優(yōu)條件下檢測 5 μmol/L 的木犀草素，由5根電極得出的峰電流數(shù)據(jù)計算得出RSD為0.64%，說明ZnO/ZnS/GCE對木犀草素檢測的重現(xiàn)性良好。

2.6 抗干擾能力的檢測

為了探究ZnO/ZnS/GCE在復(fù)雜樣品中的抗干擾能力和對木犀草素的特異性檢測能力，選擇一些常見的共存物質(zhì)來研究共存物質(zhì)對電化學(xué)響應(yīng)的干擾。在5 μmol/L木犀草素溶液中，分別加入濃度為木犀草素100倍的Ca2+、Mg2+、Na+和Cl-，分別加入濃度為木犀草素20倍的水溶性淀粉、多巴胺、尿酸、抗壞血酸和葡萄糖。由圖8可知，共存化合物對木犀草素的測定沒有顯著影響(響應(yīng)峰電流變化<5%)。

圖8 最優(yōu)條件下干擾物對木犀草素峰電流的影響Fig.8 Interferences of some distractors on the peak currents of luteolin detection under the optimized conditions

2.7 實際樣品的檢測和加標(biāo)回收率的檢測

為驗證所研制的電極的實際應(yīng)用效果，用ZnO/ZnS/GCE對獨一味軟膠囊中木犀草素的含量進(jìn)行了測定。對樣品進(jìn)行預(yù)處理：先用超聲波破碎8粒獨一味軟膠囊，用30 mL乙醇超聲提取1 h，然后抽濾收集上清液。最后用乙醇定容至100 mL容量瓶，備用。用DPV法測定木犀草素對ZnO/ZnS/GCE的電化學(xué)響應(yīng)，用標(biāo)準(zhǔn)加入法計算測定回收率。測定結(jié)果見表1。

表1 對獨一味膠囊中的木犀草素的檢測和回收率檢測Table 1 Determination of luteolin in Duyiwei soft capsule and determination recovery rate

由表1可知，獨一味軟膠囊中木犀草素的回收率在101%～103%之間，RSD<5%。表明了這種新型的修飾電極在復(fù)雜樣品中的有效檢測和準(zhǔn)確定量。

3 結(jié)論

本文采用MOFs衍生方法合成了ZnO/ZnS納米顆粒材料，將所得的納米材料以滴涂法固定在GCE表面上，研究其對木犀草素的特異性電化學(xué)行為。由于材料獨特的結(jié)構(gòu)優(yōu)點，ZnO/ZnS/GCE對木犀草素氧化具有優(yōu)異的敏感性和穩(wěn)定性。這種新型的納米材料所制備的特殊修飾電極，具有對木犀草素較低的檢測限和較寬的線性范圍。最后，在實際應(yīng)用中成功地測定了獨一味軟膠囊中木犀草素的含量。