周孝康 李 昊 張立陽 高騰云

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南省家畜營養(yǎng)調(diào)控與生態(tài)養(yǎng)殖國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

甲烷(CH4)是一種全球氣候變暖潛力巨大的溫室氣體，在100年內(nèi),其全球變暖潛力是二氧化碳(CO2)的28～34倍[1],但在釋放后的10～20年內(nèi)，其溫室效應(yīng)是CO2的80倍[2]。從全球來看，反芻動(dòng)物胃腸道CH4排放量占溫室氣體排放總量的3%～5%[3]。人們認(rèn)為CH4排放量的減少是實(shí)現(xiàn)《巴黎協(xié)定》目標(biāo)的一種手段，目的是將全球氣候穩(wěn)定在工業(yè)化前水平之上(減少1.5 ℃)[4]。胃腸道CH4排放量也占反芻動(dòng)物總能量攝入的2%～12%[5]。據(jù)聯(lián)合國預(yù)測：到我國建國100周年時(shí)，世界總?cè)丝诩s達(dá)98億[6]。同時(shí)隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，人們生活水平的提高，對(duì)于奶和肉的需求也會(huì)極大的提升。毋庸置疑，全球畜牧業(yè)都將會(huì)面臨著反芻動(dòng)物胃腸道CH4排放的極大挑戰(zhàn)。因此，當(dāng)務(wù)之急是需要通過飼糧的管理策略來減少CH4的排放量，逐步實(shí)現(xiàn)從碳達(dá)峰到碳中和的目標(biāo)。

1 減少反芻動(dòng)物瘤胃CH4排放量的措施

目前國內(nèi)降低反芻動(dòng)物瘤胃CH4烷排放量的措施有：一是通過飼養(yǎng)措施，控制CH4排放，如改變反芻動(dòng)物飼糧的營養(yǎng)成分組成、控制乙酸和丙酸的比例、增加飼喂的次數(shù)(如1次少量飼喂，多次添加)、飼料進(jìn)行粉碎或制粒[7]；二是通過驅(qū)原蟲技術(shù)，降低CH4排放，如在飼糧中添加硫辛酸或含飽和脂肪酸的過瘤胃保護(hù)性脂肪來驅(qū)除原蟲或降低原蟲數(shù)量、提供電子接受體(如三羧酸循環(huán)中的琥珀酸、延胡索酸等中間代謝產(chǎn)物)、添加植物提取物(如單寧、皂素和植物精油)來促進(jìn)丙酸生成進(jìn)而降低CH4生成、添加鹵族化合物和衍生物(如溴氯甲烷、溴乙烷磺酸、氯化脂肪酸、亞硝酸鹽等)以及添加離子載體(如莫能菌素、拉沙里菌素等)[8]；三是通過免疫法和噬菌體或細(xì)菌素等微生物手段來調(diào)控CH4的生成[8]。而上述這些調(diào)控CH4生成的方法存在著持續(xù)時(shí)間短、微生物的適應(yīng)性和耐受性、宿主的高度特異性、纖維消化率的降低以及毒性等問題，因此在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用有所局限性。最近幾年，國外的一些學(xué)者把注意力轉(zhuǎn)向了CH4的競爭性抑制上并且進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)驗(yàn)證，他們認(rèn)為用CH4抑制劑補(bǔ)充到飼糧中顯示了巨大的CH4緩解潛力，此抑制劑為3-硝基氧基丙醇(3-NOP)，這是一種結(jié)構(gòu)類似于甲基輔酶M的化合物[9]。研究表明，飼糧中添加3-NOP可持續(xù)降低肉牛和奶牛CH4排放量的20%～80%[10]，對(duì)動(dòng)物并沒有毒性跡象或飼料消化率下降的現(xiàn)象[11-12]。

2 3-NOP的化學(xué)結(jié)構(gòu)和代謝特性

3-NOP是由瑞士DSM營養(yǎng)產(chǎn)品有限公司開發(fā)的一種小分子有機(jī)化合物[13]。3-NOP具有水溶性[14]，分子式為C3H7NO4[15]。此物質(zhì)是一種獨(dú)特的化合物：它有2個(gè)官能團(tuán)，分別是伯醇和有機(jī)硝酸酯基團(tuán)，并代謝為內(nèi)源性化合物，即2個(gè)主要的代謝步驟是先將伯醇氧化成相應(yīng)的羧酸，生成3-硝基氧基丙酸(NOPA)，然后進(jìn)行硝酸酯裂解并生成3-羥基丙酸(HPA)參與機(jī)體內(nèi)的代謝[16]。其結(jié)構(gòu)式以及血漿代謝產(chǎn)物見圖1[16]。Thiel等[11,16]在細(xì)菌反向突變?cè)囼?yàn)和大鼠骨髓口服活體微核試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，3-NOP及其代謝產(chǎn)物并無致突變性和遺傳毒性；Zhang等[17]在安格斯雜交肉牛的試驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加3-NOP除了極大地增加了肉牛對(duì)氫氣(H2)的排放之外，對(duì)動(dòng)物并沒有毒性跡象。

圖1 3-NOP及其血漿代謝物NOPA和HPA的化學(xué)結(jié)構(gòu)

3 CH4生成的機(jī)制以及3-NOP抑制CH4生成的作用機(jī)理

瘤胃內(nèi)CH4的生成過程十分復(fù)雜。簡單來說，主要是由數(shù)種產(chǎn)甲烷菌通過H2還原CO2所產(chǎn)生[18]。產(chǎn)甲烷菌是嚴(yán)格的厭氧古菌，在形態(tài)學(xué)上，產(chǎn)甲烷菌呈現(xiàn)出多種多樣的形狀和大小，包括棒狀桿菌、規(guī)則和不規(guī)則球菌、長鏈棒狀桿菌、螺旋菌屬和八聯(lián)球菌屬以及不規(guī)則、異常扁平板菌屬[19-20]。該菌對(duì)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抗生素，如青霉素、環(huán)絲氨酸和纈氨酸霉素等不敏感[21]。瘤胃微生物是反芻動(dòng)物瘤胃中的主要產(chǎn)甲烷菌，盡管有些產(chǎn)甲烷菌是通過ATP獲得能量，供產(chǎn)甲烷菌生長，但實(shí)際上所有產(chǎn)甲烷菌的生長都是由乙酸鹽刺激的，所有產(chǎn)甲烷菌都需要微量金屬，如鎳、某些酶和輔酶的化合物、鐵和鈷[22]。比如在產(chǎn)甲烷菌中發(fā)現(xiàn)了許多獨(dú)特的輔酶，其中大多數(shù)參與CH4生成，包括甲基呋喃、四氫甲氨蝶呤、去雜黃素F420、輔酶M和HS-輔酶B[23]。此外，反芻動(dòng)物瘤胃中一些產(chǎn)甲烷菌還需要支鏈脂肪酸的混合物[24]。目前經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)產(chǎn)甲烷菌生成CH4的營養(yǎng)途徑類別的不同，可以將其分為3類[25-26]：一是氫營養(yǎng)菌氧化H2和還原CO2生成CH4途徑；二是甲基營養(yǎng)型生成CH4途徑，即有些產(chǎn)甲烷菌可以利用大量的甲基化合物(甲醇、甲酸鹽、甲胺或二甲基硫醚等)生長；三是乙酸營養(yǎng)型途徑生成CH4，即產(chǎn)甲烷菌利用乙酸產(chǎn)生CH4。然而，正如Garcia等[27]報(bào)道的反芻動(dòng)物瘤胃中約82%的CH4來自CO2的H2還原，而約18%的CH4來自甲酸鹽。經(jīng)Rouvière等[28]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)甲烷古菌從CO2和H2到形成CH4可能是一個(gè)循環(huán)過程并且這種產(chǎn)CH4循環(huán)現(xiàn)在被稱為沃爾夫循環(huán)(Wolfe cycle)，見圖2[28]。這種生成CH4的生化機(jī)制可以描述為：1)CO2接受2個(gè)電子與甲烷呋喃在甲酰甲烷呋喃脫氫酶下轉(zhuǎn)變?yōu)榧柞＜淄檫秽?)甲酰甲烷呋喃與四氫甲烷蝶呤(H4MPT)在H4MPT甲酰轉(zhuǎn)移酶的催化下生成5-甲酰四氫甲烷蝶呤；3)5-甲酰四氫甲烷蝶呤在亞甲基-H4MPT環(huán)水解酶的作用下脫水生成甲叉亞甲基四氫甲烷蝶呤；4)甲叉亞甲基四氫甲烷蝶呤在亞甲基-H4MPT脫氫酶和F420還原酶的作用下生成甲叉四氫甲烷蝶呤；5)甲叉四氫甲烷蝶呤在亞甲基-H4MPT還原酶的作用下得到2個(gè)電子成為甲基四氫甲烷蝶呤；6)甲基四氫甲烷蝶呤與輔酶M(CoM-SH)在CoM-SH甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下生成甲基輔酶M；7)甲基輔酶M(CH3-S-CoM)與7-巰基庚基蘇糖磷酸酯(HS-HTP)在甲基輔酶M還原酶的作用下，由F430作為輔酶進(jìn)而生成CH4。該循環(huán)反應(yīng)構(gòu)成了由CO2、乙酸鹽、甲醇或甲胺生成CH4的最后一步，故而這一循環(huán)反應(yīng)催化生成CH4的關(guān)鍵酶為甲基輔酶M還原酶(MCR)[29]。MCR是一種表觀分子質(zhì)量為300 kD的蛋白質(zhì)，由3個(gè)不同的亞基以α2、β2、γ2構(gòu)型排列組成，并含有2摩爾緊密但非共價(jià)結(jié)合的鎳卟啉(輔酶F430)，作為輔基[30]。Goubeaud等[31]在一項(xiàng)檸檬酸鈦還原輔酶F430中的鎳離子的試驗(yàn)中認(rèn)為，輔基F430中的鎳必須處于+1價(jià)氧化態(tài)時(shí)，酶才能具有活性，MCR才被激活發(fā)揮其作用。MCR可以催化甲基-輔酶M(CH3-S-CoM)和輔酶B(HS-CoB)反應(yīng)生成CH4和相應(yīng)的異二硫化物CoM-S-S-COB[32-33]。這種獨(dú)特的反應(yīng)是在輔酶F430(鎳卟啉)存在的嚴(yán)格厭氧條件下進(jìn)行的，其反應(yīng)過程見圖3[34-35]。然而，Duina等[36]在一篇文獻(xiàn)中報(bào)道，3-NOP中的硝基酯基團(tuán)可以選擇性地與MCR結(jié)合，并通過在活性位點(diǎn)將鎳離子從氧化態(tài)+1價(jià)暫時(shí)氧化為+2價(jià)來滅活其酶[由于F430(Ni2+)/F430(Ni1+)電對(duì)的氧化還原電位EΘ′為-600 mV，因此該酶很容易被氧化劑氧化并滅活]，從而抑制CH4的生成。

圖2 氫氧化產(chǎn)甲烷菌中CO2還原成CH4的Wolfe循環(huán)

圖3 甲基輔酶M還原酶催化甲基-輔酶M為CH4的反應(yīng)過程

4 3-NOP在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用研究

4.1 對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃CH4生成的抑制效應(yīng)及其影響因素

為了驗(yàn)證具有硝基酯基團(tuán)化合物的3-NOP在反芻動(dòng)物生產(chǎn)上降低CH4排放量的有效性， Melgar等[37]使用3-NOP在荷斯坦奶牛上以60 mg/kg加入全混合日糧(TMR)干物質(zhì)(DM)中,連續(xù)飼喂15周，發(fā)現(xiàn)3-NOP降低CH4排放量和排放強(qiáng)度達(dá)到27%～29%，而且緩解作用持續(xù)了15周以上,同時(shí)對(duì)產(chǎn)奶量、飼料的消化率以及干物質(zhì)采食量(DMI)無不利影響,更值得讓人們關(guān)注的是這種帶有硝基酯基團(tuán)的3-NOP能以較低的劑量發(fā)揮出較大的效用。此外，3-NOP抑制反芻動(dòng)物瘤胃CH4生成的效應(yīng)可能是受其添加量的多少所決定的。Romero-Perez等[38]給4頭小母牛分別添加0、0.5、1.4和2.8 g/d的帶有硝基酯基團(tuán)化合物的3-NOP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增加，每頭牛的CH4排放總量分別線性減少了3%、13%和38%；Hristov等[10]在荷斯坦奶牛飼糧中分別添加40、60、80 mg/kg帶有硝基酯基團(tuán)化合物的3-NOP，發(fā)現(xiàn)CH4的生成量分別減少了20%、25%和29%；Vyas等[39]在生長肥育肉牛飼糧中分別添加0、100和200 mg/kg的帶有硝基酯基團(tuán)化合物的3-NOP，發(fā)現(xiàn)添加200 mg/kg 3-NOP，CH4減排的持續(xù)性會(huì)更久。對(duì)于CH4生成量而言，Dijkstra等[40]認(rèn)為3-NOP對(duì)奶牛抑制CH4生成的作用強(qiáng)于肉牛，在肉牛的飼糧中添加3-NOP(144 mg/kg DM)才能達(dá)到與奶牛(81 mg/kg DM)CH4減排相同的效果，這可能是與奶牛的更高飼糧攝入水平有關(guān)。較高的飼糧攝入水平會(huì)增加瘤胃發(fā)酵產(chǎn)物的濃度，包括揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和H2。盡管H2不能從熱力學(xué)上控制產(chǎn)甲烷古菌的CH4生成，但瘤胃微生物中還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH+)的氧化，以及由此形成的VFA的類型會(huì)受到H2分壓的調(diào)控，從而影響H2在瘤胃中的利用[40]。因此，奶牛比肉牛更高的飼糧攝入水平可能與瘤胃CH4生成的相對(duì)更多的H2有關(guān)，導(dǎo)致甲基輔酶M的濃度相對(duì)較低，從而提高了3-NOP抑制CH4生成的潛力。此外，飼糧纖維含量的增加降低了帶有硝基酯基團(tuán)化合物3-NOP對(duì)CH4的抑制效應(yīng)，Dijkstra等[40]得出，飼糧中中性洗滌纖維(NDF)含量的增加降低了3-NOP減少CH4排放的功效，這可能是由于飼喂低纖維飼糧的牛瘤胃中甲基輔酶M的活性低于飼喂高纖維飼糧的牛。因此，在低纖維飼糧中添加3-NOP可能會(huì)更有效地抑制MCR[41]。這就解釋了為什么3-NOP在低纖維飼糧中有更大的抑制CH4生成的潛力。

由于3-NOP具有水溶性，其抑制CH4生成的作用可能是短暫的。Reynolds等[42]每天向奶牛瘤胃中直接添加2.5 g/d的3-NOP，奶牛體內(nèi)的CH4濃度僅下降9%。這可能是因?yàn)轱暭Z消化和3-NOP代謝之間缺乏同步性，導(dǎo)致大量的3-NOP在瘤胃隨著瘤胃液外流而流出瘤胃。此外，也很有可能已被瘤胃吸收或被瘤胃微生物代謝[42]。所以將3-NOP混入TMR中，或許是用來飼喂奶牛讓3-NOP發(fā)揮最大效用的較好辦法。

4.2 對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的影響

楊卓等[43]提到瘤胃液的pH、氨態(tài)氮(NH3-N)、VFA以及總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)的濃度是用來評(píng)估反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)發(fā)酵程度的指標(biāo)。Haisan等[44]向奶牛補(bǔ)充2.5 g/d的3-NOP時(shí)，瘤胃內(nèi)的pH在最低水平上有小幅度的增長，NH3-N濃度不受影響，降低了乙酸的摩爾比例，并傾向于增加丙酸的比例，導(dǎo)致乙酸與丙酸的比率降低，然而不影響TVFA的濃度、細(xì)菌和原蟲的數(shù)量，但減少產(chǎn)甲烷菌數(shù)量。Romero-Perez等[38]當(dāng)給小母牛補(bǔ)充2.25和4.50 mg/kg BW的3-NOP時(shí)，其瘤胃液的pH始終高于對(duì)照組，NH3-N濃度不受影響；當(dāng)3-NOP添加水平增加至4.50 mg/kg BW時(shí)，TVFA濃度呈線性下降。隨著3-NOP添加水平的增加，乙酸的摩爾比例降低，丙酸的摩爾比例增加。Jayanegaraa等[45]在一項(xiàng)Meta分析中發(fā)現(xiàn)，3-NOP可以降低反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)乙酸的濃度，增加丙酸的比例，減少產(chǎn)甲烷古生菌的數(shù)量，而不會(huì)影響細(xì)菌和原生動(dòng)物的數(shù)量，但TVFA的濃度會(huì)隨著3-NOP添加量的增加呈顯著下降，他認(rèn)為因?yàn)閂FA可以轉(zhuǎn)化為能量，并且可能為反芻動(dòng)物提供70%的能量需求。此外，由于3-NOP是CH4的抑制劑，在抑止MCR還原CH3-S-CoM生成CH4的同時(shí)必定會(huì)有氫離子(H+)的積累，一部分H+會(huì)通過無氧酵解、生物氧化、有氧氧化以及磷酸戊糖等途徑加強(qiáng)VFA的消耗，可能這就是3-NOP降低TVFA濃度的最好解釋了。

4.3 對(duì)反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響

大量的試驗(yàn)表明，帶有硝基酯基團(tuán)的化合物3-NOP不會(huì)影響奶牛的采食量和產(chǎn)奶量，但會(huì)增加乳脂濃度和產(chǎn)量。Melgar等[37]在奶牛飼糧中添加60 mg/kg DM的3-NOP，發(fā)現(xiàn)3-NOP降低了CH4排放、排放產(chǎn)量和強(qiáng)度，不會(huì)影響奶牛乳產(chǎn)量并增加了奶牛6.5%的乳脂濃度、5%的乳脂產(chǎn)量并產(chǎn)生大量的H2(比對(duì)照組高6倍)。Melgar等[46]在奶牛TMR中分別添加40、60、80、100、150和200 mg/kg DM的3-NOP，發(fā)現(xiàn)3-NOP不影響奶牛的DMI和產(chǎn)奶量，但總體而言，線性增加了乳脂濃度和產(chǎn)量，他們認(rèn)為這是3-NOP增加了奶牛乳腺中用于脂肪酸從頭合成的一些短鏈脂肪酸的濃度所致。在肉牛中，Alemu等[14]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，3-NOP可以增加2.5%的料重比，與Romero-Perez等[38]研究結(jié)果一致，他觀察到飼喂了3-NOP的肉牛體增重要略高于對(duì)照組，這可能是因?yàn)?-NOP降低瘤胃CH4的同時(shí)，一部分的H+會(huì)被機(jī)體所利用，從而產(chǎn)生額外的能量來用于肉牛的體增重[14,43]。

5 小 結(jié)

3-NOP可以特異性靶向MCR，通過氧化其活性位點(diǎn)鎳離子(Ni+)暫時(shí)失活MCR，進(jìn)而達(dá)到持續(xù)抑制反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵過程中CH4的生成并對(duì)其健康和生產(chǎn)性能沒有顯著影響，但在抑制CH4產(chǎn)生的同時(shí)其瘤胃中會(huì)聚集大量的H2。H2作為一種高能氣體，若積累過多極易導(dǎo)致瘤胃脹氣，其亟待有效的利用和處理。3-NOP現(xiàn)在仍處于試驗(yàn)階段，并沒有商品化。3-NOP作為一種新型的CH4抑制劑，其應(yīng)用前景是可觀的，待3-NOP商品化后，在確保不影響反芻動(dòng)物的采食量、飼料消化率和生產(chǎn)性能的情況下，可以考慮把CH4抑制后所積累H2的如何利用作為切入點(diǎn)來進(jìn)一步的研究和探討。