湯 寶，王金子，趙延存，劉鳳權(quán)

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；3.江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013；4.海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228）

熱穩(wěn)定抗真菌因子（Heat stable antifungal factor，簡(jiǎn)稱(chēng)HSAF）是產(chǎn)酶溶桿菌產(chǎn)生的一種活性抗菌物質(zhì)，分子量為512 Da，其結(jié)構(gòu)由一個(gè)獨(dú)特的大環(huán)內(nèi)酰胺體系、一個(gè)四胺酸結(jié)構(gòu)單元和5,5,6-三環(huán)組成，這一新穎結(jié)構(gòu)不同于目前市場(chǎng)上任何一種殺真菌劑[1,2]。HSAF對(duì)病原真菌的作用方式也與目前已報(bào)道的商用殺真菌劑截然不同，它通過(guò)抑制病原菌神經(jīng)酰胺合成酶活性，改變鞘脂類(lèi)化合物的形成，從而影響菌絲的極性生長(zhǎng)[3]。HSAF生物合成主要由一個(gè)雜合的聚酮合酶（PKS）/非核糖體肽合成酶（NRPS）來(lái)完成，PKS負(fù)責(zé)合成HSAF結(jié)構(gòu)中的兩條聚酮鏈，然后通過(guò)NRPS與鳥(niǎo)氨酸結(jié)合形成HSAF的骨架結(jié)構(gòu)（大環(huán)內(nèi)酰胺）[4,5]。綜上所述，HSAF可以代表一類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用方式新穎、生物合成機(jī)制獨(dú)特、對(duì)環(huán)境友好的生物殺菌劑。

一直以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)HSAF的合成機(jī)制和發(fā)酵調(diào)控進(jìn)行了大量研究，使HSAF產(chǎn)量得到了不斷提高，當(dāng)前報(bào)道最高產(chǎn)量為440.26 mg/L[6]，但進(jìn)一步提高存在限制，主要原因是HSAF合成代謝規(guī)律尚不清楚，無(wú)法確定影響產(chǎn)量的確切因素。目前關(guān)于HSAF研究所采用的培養(yǎng)基為天然培養(yǎng)基（10% TSB）[7]或者半合成培養(yǎng)基（其中含有大豆粉）[8]，它們均含有不明確的成分，難以用于胞內(nèi)代謝途徑研究。而合成培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分明確，能有效彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)。

本研究在前期基礎(chǔ)上，首先設(shè)計(jì)一種基本的合成培養(yǎng)基，接著通過(guò)單因素缺失試驗(yàn)對(duì)影響HSAF發(fā)酵的具體碳源、氮源等進(jìn)行考察，篩選出最為合適的培養(yǎng)基成分，最后應(yīng)用正交方法對(duì)各組分進(jìn)行優(yōu)化，獲得一種有利于HSAF發(fā)酵的全合成培養(yǎng)基。該研究為后續(xù)提高HSAF產(chǎn)量打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

HSAF發(fā)酵菌株產(chǎn)酶溶桿菌OH11為本實(shí)驗(yàn)室從辣椒根際土壤中分離獲得[9]，甘油管保藏于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2 化學(xué)試劑

酵母抽提物、胰蛋白胨，Oxoid公司；其他各類(lèi)化學(xué)試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：酵母抽提物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂粉20 g/L，pH自然。LB液體培養(yǎng)基為不加瓊脂的LB固體培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：具體成分參照如下試驗(yàn)，并利用0.1 mol/L HCl或NaOH調(diào)至pH 7.0。

金屬離子混合母液（g/L）：NaCl 5、CaCl21.25、ZnSO4·7H2O 1.25、MgSO4·7H2O 1.25、FeSO4·7H2O 1.0、MnCl2·4H2O 0.5、CuSO4·5H2O 0.5。

1.4 培養(yǎng)方法

平板培養(yǎng)：取出-80 ℃超低溫冰箱中的OH11菌株甘油管，冰上融化后倒入含50 mL LB培養(yǎng)液的三角瓶中，28 ℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，用接種環(huán)蘸取菌液在固體平板上劃線(xiàn)，于28 ℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)48 h。

種子液培養(yǎng)：劃取平板上的單菌落于50 mL LB培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600≈1.5，即為種子液。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：按照2.5%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.5 單因素缺失試驗(yàn)

在基本培養(yǎng)基其他組分不變的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素缺失試驗(yàn)考察不同碳源、氮源、金屬離子、磷酸緩沖鹽對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及HSAF產(chǎn)量的影響。首先是將基本培養(yǎng)基中葡萄糖和蔗糖替換成單一碳源（葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉），質(zhì)量濃度均為8 g/L；確定適宜單一碳源后，對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置濃度梯度為2、4、8、12、16、20 g/L。然后，按照上述方案對(duì)氮源、金屬離子、磷酸緩沖鹽種類(lèi)及添加濃度進(jìn)行研究。氮源種類(lèi)：NH4Cl、(NH4)2SO4、NaNO3、尿素，質(zhì)量濃度均為2 g/L；確定適宜氮源后，設(shè)置質(zhì)量濃度梯度0.5、1、2、4、8 g/L。金屬離子種類(lèi)及質(zhì)量濃度為：FeSO4·7H2O（10 mg/L）、FeCl3（10 mg/L）、MgSO4·7H2O（20 mg/L）、CaCl2（20 mg/L）、MnCl2·4H2O（10 mg/L）、CuSO4·5H2O（10 mg/L）、ZnSO4·7H2O（20 mg/L）；確定FeCl3為適宜金屬離子后，設(shè)置質(zhì)量濃度梯度為2、4、8、16、32、48 和 64 mg/L。磷酸緩沖鹽組合為 K2HPO4和 KH2PO4、Na2HPO4和 NaH2PO4、K2HPO4和 NaH2PO4、Na2HPO4和KH2PO4，質(zhì)量濃度分別為1.0、0.5 g/L；確定適宜磷酸鹽后，設(shè)置質(zhì)量濃度梯度如表1所示。

表1 不同磷酸鉀緩沖鹽濃度Table 1 Different concentrations of potassium phosphate buffer

1.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以葡萄糖（A）、(NH4)2SO4（B）、FeCl3（C）、K2HPO4和 KH2PO4（D）為研究因素，以發(fā)酵液中HSAF產(chǎn)量為指標(biāo)，采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，如表2所示，設(shè)計(jì)軟件為正交試驗(yàn)助手，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.7 生物量測(cè)定

菌體生物量采用干細(xì)胞重量（Dry cell weight，DCW）來(lái)表示，具體如下：取發(fā)酵液200 μL，通過(guò)超微量核酸蛋白測(cè)定儀（Eppendorf BioPhotometer plus）在波長(zhǎng)600 nm出測(cè)定菌液吸光值（Optical density,OD），按照干細(xì)胞重量與吸光值間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（Y＝0.4841X－0.0718，R2＝0.9985，其中X指 OD600，Y指DCW），將OD600換算成DCW。

1.8 HSAF提取檢測(cè)

取3 mL發(fā)酵液加入濃 HCl調(diào)節(jié)pH至2.5，按照與發(fā)酵液等比例加入3 mL乙酸乙酯，旋渦振蕩1 min，10000 r/min離心3 min，吸取1 mL上清液與通風(fēng)櫥中吹干，最后加入500 μL甲醇溶解后用于HPLC分析，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)條件為，紫外吸收值：318 nm，反相柱：InterSustainSwift C18 5 μm，250×4.6 mm，流動(dòng)相：溶液A（0.025% TFA水溶液）和溶液B（0.025% TFA乙腈溶液），流速：1 mL/min；進(jìn)樣程序：0～10 min，將溶液B 5%～25%；25 min，增長(zhǎng)到80% B；26 min，增長(zhǎng)到100%；30 min返回到5%，溶液A和B總比例為100%。記錄HSAF特征峰面積，通過(guò)HSAF濃度與峰面積間的線(xiàn)性方程（Y＝0.00004X＋32.385，R2＝0.9998）計(jì)算發(fā)酵液中HSAF的具體產(chǎn)量。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013和OriginPro 8.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性檢驗(yàn)，利用OriginPro 8.6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)

本研究在前期半合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上[8]，設(shè)計(jì)基本培養(yǎng)基成分如下：葡萄糖6 g/L，蔗糖2 g/L；NH4Cl 1 g/L，NaNO31 g/L；金屬離子混合母液1 mL；K2HPO41 g/L，KH2PO40.5 g/L，研究菌株生長(zhǎng)及HSAF合成情況。發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，OH11在所設(shè)計(jì)的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)比較旺盛，DCW達(dá)到（1.83±0.08）g/L。而且HSAF也有較高水平的積累，為（112.08±4.63）mg/L，這是10%TSB培養(yǎng)基（29.34 mg/L）下HSAF產(chǎn)量的3.82倍。因此，可將此基本培養(yǎng)基用于下一步單因素試驗(yàn)。

2.2 不同碳源對(duì)HSAF發(fā)酵的影響

將基本培養(yǎng)基中葡萄糖和蔗糖替換成單一碳源，研究菌株生長(zhǎng)和HSAF產(chǎn)生情況。結(jié)果如圖1A所示，HSAF合成最適碳源為麥芽糖，產(chǎn)量達(dá)到（162.08±8.38）mg/L，其次是葡萄糖，而在木糖、阿拉伯糖下完全不能合成。以葡萄糖作為唯一碳源時(shí)HSAF產(chǎn)量雖略低于麥芽糖，但無(wú)顯著性差異。當(dāng)葡萄糖濃度為2～8 g/L時(shí)，DCW和HSAF產(chǎn)量均隨著濃度的增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)葡萄糖濃度為8～20 g/L時(shí)，隨著濃度增加反而出現(xiàn)下降，這很可能是由于高濃度葡萄糖產(chǎn)生底物抑制造成的[10]。因此，葡萄糖最適濃度為8 g/L，此時(shí)DCW及HSAF產(chǎn)量均達(dá)到最大，分別為（2.12±0.06）g/L和（152.08±8.48）mg/L。

圖1 碳源種類(lèi)和濃度對(duì)HSAF產(chǎn)量及生物量的影響Fig.1 Effects of carbon source types and concentrations on HSAF production and biomass

2.3 不同氮源對(duì)HSAF發(fā)酵的影響

研究了無(wú)機(jī)氮源種類(lèi)和濃度對(duì)HSAF發(fā)酵的影響。由圖2A所示，OH11菌株對(duì)NH4Cl、(NH4)2SO4的利用要明顯優(yōu)于NaNO3、尿素，特別是(NH4)2SO4作為唯一氮源條件下，HSAF產(chǎn)量最高達(dá)到（140.30±6.51）mg/L。故選擇(NH4)2SO4作為HSAF發(fā)酵全合成培養(yǎng)基中的最適氮源。進(jìn)一步，對(duì)其添加濃度進(jìn)行了考察，如圖2B所示。低濃度的(NH4)2SO4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及HSAF產(chǎn)量均具有促進(jìn)作用，而隨著的濃度的升高，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致DCW和HSAF產(chǎn)量出現(xiàn)下降。因此，確定最適(NH4)2SO4濃度為1 g/L。

圖2 氮源種類(lèi)和濃度對(duì)HSAF產(chǎn)量及生物量的影響Fig.2 Effects of nitrogen source types and concentrations on HSAF production and biomass

2.4 不同金屬離子對(duì)HSAF發(fā)酵的影響

由圖3A可知，不同種類(lèi)金屬離子對(duì)OH11細(xì)胞生長(zhǎng)影響較小，而對(duì)HSAF產(chǎn)量影響顯著。Mn2+、Cu2+、Zn2+對(duì)HSAF產(chǎn)量均有一定程度的抑制作用，F(xiàn)e2+、Fe3+能顯著促進(jìn)HSAF合成。由于Fe2+性質(zhì)不穩(wěn)定，在酸性溶液中容易被氧化[11]，故選用Fe3+作為最佳金屬離子。通過(guò)對(duì)Fe3+添加濃度進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)DCW和HSAF產(chǎn)量在16 mg/L時(shí)均達(dá)到最大（圖3B），為（2.59±0.05）g/L和（196.73±6.52）mg/L。因此，選取此添加量用于后續(xù)研究。

圖3 金屬離子種類(lèi)及濃度對(duì)HSAF產(chǎn)量及生物量的影響Fig.3 Effects of metal ion types and concentrations on HSAF production and biomass

2.5 不同磷酸緩沖鹽對(duì)HSAF發(fā)酵的影響

在4種不同磷酸緩沖鹽組合中，DCW、和HSAF產(chǎn)量均在K2HPO4和KH2PO4下取得最大，因此選用K2HPO4、KH2PO4作為合成培養(yǎng)基中的緩沖鹽（圖 4A）。進(jìn)一步研究不同濃度的磷酸鉀緩沖鹽對(duì) HSAF發(fā)酵的影響如圖4B所示，隨著濃度的升高，DCW 和HSAF產(chǎn)量逐漸提高，在P5時(shí)達(dá)到最大，隨后，出現(xiàn)下降。因此，確定最適的磷酸鉀緩沖鹽體系為P5，即K2HPO41.0 g/L和KH2PO40.5 g/L。

圖4 磷酸緩沖鹽種類(lèi)及濃度對(duì)HSAF產(chǎn)量及生物量的影響Fig.4 Effects of phosphate buffer types and concentrations on HSAF production and biomass

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化及驗(yàn)證

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了獲得 HSAF發(fā)酵最佳全合成培養(yǎng)基配方，利用正交試驗(yàn)，對(duì)葡萄糖、(NH4)2SO4、FeCl3、磷酸鉀緩沖鹽4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)及分析結(jié)果如表2所示。根據(jù)極差R分析，四種因素對(duì)HSAF產(chǎn)量的影響大小排序?yàn)锳＞B＞C＞D；同時(shí)還可以看出，A、B、C、D四種因素各個(gè)水平中，A2、B2、C1及D2均數(shù)K最大，其最優(yōu)組合為A2B2C1D2，即全合成培養(yǎng)基配方為：葡萄糖8 g/L、(NH4)2SO41 g/L、FeCl38 mg/L、K2HPO41.0 g/L、KH2PO40.5 g/L。將上述培養(yǎng)基經(jīng)搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證后，DCW 為（3.27±0.14）g/L，HSAF產(chǎn)量達(dá)到（215.46 ±6.85）mg/L，略高于正交試驗(yàn)組合方案，能夠證實(shí)本研究中正交試驗(yàn)結(jié)果具有高度的可靠性。

表2 L9(34) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 2 L9 (34) orthogonal experimental design and result analysis

2.7 優(yōu)化培養(yǎng)基與原始培養(yǎng)基比較

采用優(yōu)化后的合成培養(yǎng)基培養(yǎng)OH11菌株48 h，發(fā)酵液中DCW 為（3.27±0.14）g/L、HSAF產(chǎn)量達(dá)到（215.46±6.85）mg/L，相比優(yōu)化前基本培養(yǎng)基分別提高了78.69%、92.24%，說(shuō)明優(yōu)化后的合成培養(yǎng)基更有利于菌株OH11生長(zhǎng)并產(chǎn)生代謝物質(zhì)。

3 討論

培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)于微生物的生長(zhǎng)代謝至關(guān)重要。營(yíng)養(yǎng)過(guò)多會(huì)使細(xì)菌生長(zhǎng)快速，抑制目標(biāo)產(chǎn)物合成；而營(yíng)養(yǎng)缺乏細(xì)菌生長(zhǎng)太慢，產(chǎn)物合成減少[12]。通過(guò)對(duì)合成培養(yǎng)基組分的研究，能夠明確發(fā)酵底物的代謝流向，更加深入的理解代謝合成規(guī)律，確定影響產(chǎn)量的主要因子，有利于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，推動(dòng)實(shí)際生產(chǎn)，也利于代謝產(chǎn)物合成機(jī)制的研究。如陳騰飛[13]開(kāi)發(fā)了一種適宜絳紅小單孢菌產(chǎn)慶大霉素Cla的全合成培養(yǎng)基，使Cla產(chǎn)量提高了35.3%，并通過(guò)13C標(biāo)記分析了木糖對(duì)菌體代謝的影響機(jī)理，為工業(yè)生產(chǎn)菌株的基因改造及生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供了依據(jù)。廖建國(guó)等[14]運(yùn)用高通量篩選技術(shù)優(yōu)化了紅霉素A發(fā)酵的合成培養(yǎng)基，是優(yōu)化前培養(yǎng)基下紅霉素A產(chǎn)量的13.6倍。王龍等[15]首次篩選到以硝酸鉀為主要氮源的合成培養(yǎng)基，將土霉素合成能力從75.2 mg/L提高到145.6 mg/L，并應(yīng)用到13C葡萄糖標(biāo)記試驗(yàn)，證實(shí)了龜裂鏈霉素中不存在 2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸裂解途徑。田云龍等[16]對(duì)中生菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵合成培養(yǎng)基進(jìn)行了設(shè)計(jì)和優(yōu)化，使中生菌素可達(dá)2000 mg/L，為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、代謝、遺傳育種和產(chǎn)素機(jī)制等研究提供了基礎(chǔ)。

本研究首先通過(guò)單因素試驗(yàn)明確了不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)HSAF產(chǎn)量的影響，對(duì)于其定向發(fā)酵調(diào)控具有重要的指導(dǎo)意義。從結(jié)果來(lái)看，碳源是菌株OH11生長(zhǎng)和HSAF合成唯一必需的營(yíng)養(yǎng)成分，研究表明碳源是一種為微生物細(xì)胞生長(zhǎng)代謝提供骨架和能量的基本前體物質(zhì)[17]；另外OH11對(duì)各類(lèi)碳源的偏好和利用程度不盡相同，這主要與微生物細(xì)胞內(nèi)的酶系有關(guān)。鑒于葡萄糖作為一種工業(yè)發(fā)酵中最常用的碳源，來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉（單價(jià)約為麥芽糖的1/5）[18]，故選擇葡萄糖作為合成培養(yǎng)基中的最適碳源。對(duì)于篩選最佳氮源，發(fā)現(xiàn)銨態(tài)氮（NH4+）比硝態(tài)氮（NO3-）更有利于菌體生長(zhǎng)和HSAF的合成，但隨著NH4+的濃度的升高，細(xì)胞生長(zhǎng)和HSAF產(chǎn)量明顯受到抑制，其主要原因是NH4+能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)某些氨基酸脫氫酶和?；D(zhuǎn)移酶的活性，以此改變相關(guān)氨基酸的代謝和前體合成水平，最終影響抗生素的生物合成[19,20]。除了必需的能源和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，OH11的生長(zhǎng)代謝還需要金屬離子，特別是Fe2+、Fe3+均能顯著促進(jìn)菌株生長(zhǎng)和HSAF合成。鐵元素是微生物生長(zhǎng)必不可少的微量元素，參與諸多代謝過(guò)程，如氧的運(yùn)輸、細(xì)胞呼吸，許多酶的重要輔因子[21,22]。與對(duì)照相比（不添加磷酸鹽），磷酸鹽添加對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和HSAF產(chǎn)量都具有明顯的促進(jìn)作用。一方面，磷酸鹽能維持發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基pH的相對(duì)穩(wěn)定[23]；另外，磷還是磷壁酸、高能磷酸化合物的重要組成部分，能為細(xì)胞代謝傳遞能量[24]。在不同磷酸緩沖鹽對(duì)HSAF發(fā)酵的影響中，發(fā)現(xiàn)磷酸鉀緩沖鹽比磷酸鈉緩沖鹽要更適合HSAF發(fā)酵過(guò)程。

本研究利用正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化，試驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單高效、結(jié)果可靠等[25]，不僅獲得了最適配方：葡萄糖8 g/L、(NH4)2SO41 g/L、FeCl38 mg/L、K2HPO41.0 g/L、KH2PO40.5 g/L，還明確了各成分對(duì)HSAF產(chǎn)量的影響主次。在此配方下，HSAF產(chǎn)量為（215.46±6.85）mg/L，這是10% TSB培養(yǎng)基（29.34 mg/L）下的 7.34倍。雖然低于大豆粉培養(yǎng)基（356.34±13.86）mg/L，但該培養(yǎng)基優(yōu)勢(shì)在于成分已知、含量穩(wěn)定，不僅能避免工業(yè)生產(chǎn)中因大豆粉生產(chǎn)批次不同而導(dǎo)致HSAF產(chǎn)量不穩(wěn)定現(xiàn)象，而且可以對(duì)OH11的胞內(nèi)代謝特征和HSAF合成的關(guān)鍵因素進(jìn)行深入研究，進(jìn)而提高產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本。