王錦秀，趙晴晴，徐心怡，謝 倩，陳清西

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州 350000）

百香果（Passiflara eduliaSims.）又名巴西果、雞蛋果，為西番蓮科（Passiloraceae）、西番蓮屬（Passiflora）多年生常綠攀緣性藤本植物[1?2]。2018 年底全國百香果總產(chǎn)量達(dá)到590.03 kt，較上年新增67.47%，福建省總產(chǎn)量達(dá)200.00 kt，較上年增長150.00%[3]。百香果汁因營養(yǎng)豐富[4?5]常被加工成復(fù)合果汁[6]、果醋[7]、果酒[8]等加工產(chǎn)品；百香果皮（PFP）占鮮果重50%～55%[9]，在百香果加工中常作為廢棄物丟棄[10]，而PFP中富含果膠、多酚、膳食纖維等多種活性物質(zhì)[11?12]，因此對PFP 進(jìn)行有效利用可提高百香果全果利用價(jià)值。

果膠主要存在于高等植物細(xì)胞壁中，提取方法主要有酸法、酶法、微波輔助法、超聲波輔助法、螯合劑法等[9,13?14]，提取方法不同果膠得率、性質(zhì)差異較大，如酸法提取果膠質(zhì)量好、生產(chǎn)成本低，但果膠得率低且會(huì)變性[9]；酶法提取果膠操作簡單、果膠性質(zhì)穩(wěn)定，但對酶純度要求較高；微波輔助法可加速果膠溶出，但成本高且溫度不易控制[15]，超聲-微波協(xié)同法提取時(shí)間短、提取率較高，但對設(shè)備條件要求較高，還需進(jìn)一步研究。超聲波的“空化作用”可使細(xì)胞破碎或崩解[16?17]，促使植物細(xì)胞有效成分溶出[18]，利用超聲波輔助酸法提取果膠可有效中和酸法缺點(diǎn)，大大縮短提取時(shí)間[19]，但不同物料對超聲提取條件要求不同。目前，提取PFP 果膠的方法有超聲波輔助純水法（12.67%[20]）、超聲-微波協(xié)同輔助提取法（12.14%[21]）、超聲波輔助酶法（3.22%[22]）等，也有使用超聲波輔助檸檬酸法提取PFP 果膠（13.07%[23]），但多使用熱干燥法干燥物料。果品熱處理已被證明會(huì)降解和脫甲氧基化果膠分子，果膠降解程度隨溫度增加而增加[24]，而非熱處理則可以保留更多原果膠。

研究表明，多種植物果膠均具有抗氧化活性[25]，如柑橘皮[26]、檸檬皮[27]、胡蘿卜[28]等，在功能性食品及藥品中的應(yīng)用具有較大利用價(jià)值。因此，本文針對當(dāng)?shù)卮砥贩N，以‘福建百香果2 號’為試驗(yàn)對象，使用冷凍干燥法干燥PFP，以酸法為對照，采用超聲輔助檸檬酸法提取PFP 果膠，在單因素基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面優(yōu)化得到PFP 果膠的最佳提取工藝，并在提取果膠的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究兩種方法提取的果膠對DPPH 自由基（DPPH·）、羥自由基（·OH）以及超氧陰離子自由基（·）清除能力的差異，為解決當(dāng)?shù)仄贩N百香果皮的資源浪費(fèi)狀況，為其進(jìn)一步開發(fā)及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘福建百香果2 號’果皮 福建省漳州市華安縣聯(lián)眾果蔬專業(yè)合作社提供，將去除海綿層的百香果外果皮洗凈晾干，冷凍干燥48 h 后用高速多功能粉碎機(jī)粉碎，過80 目篩后保存于?40 ℃冰箱；檸檬酸、咔唑、半乳糖醛酸、水楊酸、硫酸亞鐵（FeSO4）、鄰苯三酚（C6H6O3） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；羥甲基氨基甲烷（Tris）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）生工生物工程上海股份有限公司；所有試劑均為分析純。

LGJ-25C 型真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Allegra 64R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)美國 BECKMAN 公司；Infinite M200 Pro 多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan 集團(tuán)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸法提取百香果皮果膠 參考劉運(yùn)花[9]的方法，并略有改動(dòng)。稱取5.00 g PFP 粉末于150 mL 檸檬酸提取液（pH2.0）中攪拌均勻，在水浴溫度80 ℃條件下提取4 h，用2 層200 目尼龍布作為濾布抽濾2 次得果膠原液，果膠原液濃縮至原體積1/3 后加入1.5 倍95%乙醇醇沉12 h，抽濾得粗果膠濾餅，95%乙醇洗滌2 次，所得濾餅冷凍干燥48 h 后即得PFP 果膠。

1.2.2 超聲波輔助酸法提取百香果皮果膠 參考辛明等[23]的方法，并略有改動(dòng)。超聲提取條件為超聲溫度50 ℃、超聲功率180 W 條件下超聲70 min，其他步驟參照1.2.1。

1.2.3 果膠提取得率測定 參照黎英等[21]方法略有改動(dòng)。吸取0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0 mg/L 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00 mL 于25 mL 玻璃試管中，分別加入0.25 mL 1 g/L 咔唑-乙醇溶液，產(chǎn)生白色絮狀沉淀，不斷搖動(dòng)試管，快速加入5.0 mL 濃硫酸，振蕩搖勻，85 ℃水浴20 min，取出后放入冷水中冷卻，在波長528 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取一定質(zhì)量果膠粉末溶于超純水，即為果膠樣品溶液，吸取1 mL 果膠樣品溶液于25 mL 試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定果膠樣品溶液吸光度。按照公式（1）計(jì)算PFP 果膠提取得率。

式中：C 為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得半乳糖醛酸濃度，mg/L；V 為果膠樣品溶液總體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；W 為果膠粉末質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 pH 對提取得率的影響 稱取5.00 g PFP 粉末，以pH 為變量（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5）在料液比1:30 g/mL、超聲時(shí)間70 min、超聲溫度40 ℃、超聲功率180 W 條件下超聲提取70 min，以PFP 果膠提取得率為指標(biāo)確定最佳pH。

1.2.4.2 料液對提取得率的影響 稱取5.00 g PFP粉末，以最佳pH2.0 在不同料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）條件下考察不同提取料液比對PFP 果膠提取得率的影響，確定最佳料液比。

1.2.4.3 超聲時(shí)間對提取得率的影響 稱取5.00 g PFP 粉末，以最佳料液比1:25 g/mL、pH2.0 在不同超聲時(shí)間（30、50、70、90、110 min）條件下考察不同提取超聲時(shí)間對PFP 果膠提取得率的影響，確定最佳超聲時(shí)間。

1.2.4.4 超聲功率對提取得率的影響 稱取5.00 g PFP 粉末，以最佳料液比1:25 g/mL、pH2.0、超聲時(shí)間70 min 在不同超功率（150、180、210、240、270 W）條件下考察不同提取超聲功率對PFP 果膠提取得率的影響，確定最佳超聲功率。

1.2.4.5 超聲溫度對提取得率的影響 稱取5.00 g PFP 粉末，以最佳料液比1:25 g/mL、pH2.0、超聲時(shí)間70 min、超聲功率210 W 在不同超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）條件下考察不同提取超聲溫度對PFP 果膠提取得率的影響，確定最佳超聲溫度。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇pH、超聲時(shí)間、超聲功率和超聲溫度為主要考察因素，確定如表1 所示的因素和水平，采用Design-Expert 10.0 軟件，應(yīng)用Box-Behnken 原理進(jìn)行4 因素3 水平試驗(yàn)（共29 組），從而確定提取最優(yōu)條件并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factor and level table of response surface

1.2.6 PFP 果膠抗氧化活性的測定

1.2.6.1 DPPH·清除能力測定 參照馬麗蘋等[29]方法略有修改。配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL PFP 果膠溶液，各取2 mL 至10 mL 試管，分別加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-甲醇溶液混合均勻，室溫避光反應(yīng)30 min 后，在517 nm 波長處測定吸光度。本底組用2 mL 95%甲醇溶液代替2 mL DPPH-甲醇溶液，空白組用2 mL 超純水代替果膠溶液；以抗壞血酸（VC）為陽性對照。按公式（2）計(jì)算PFP 果膠對DPPH·清除率。

式中：A1為測定組吸光度；A2為本底組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.2.6.2 對·OH 清除能力測定 參照宋佳敏等[30]方法略有修改。配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL PFP 果膠溶液，各取1 mL 至10 mL 試管，分別加入1.00 mL 1.8 mmol/L FeSO4、1.0 mL 1.8 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2，振蕩試管使溶液混合均勻，37 ℃水浴30 min，在510 nm 處測定吸光度；空白組用超純水代替樣品溶液；以VC為陽性對照。按公式（3）計(jì)算PFP 果膠對·OH 清除率。

式中：A樣品為測定組吸光度；A空白為空白組吸光度。

式中：Ai為測定組吸光度；Aj為空白組吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次以上，以Excel 2019 整理數(shù)據(jù)，以SPSS 26.0 進(jìn)行顯著性分析及回歸分析，以單因素方差分析（One-way ANOVA）法對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，以Design Expert 10.0 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。用Origin 2019 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1 所示，在波長528 nm 下測定吸光度，以半乳糖醛酸溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程:y=0.0241x+0.2157，R2=0.9991，在0～90 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Galacturonic acid standard curve

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 pH 對PFP 果膠提取得率的影響 如圖2，PFP果膠提取得率隨pH 升高呈先上升后下降趨勢。當(dāng)pH 為2.0 時(shí)，果膠提取得率達(dá)最大值14.44%。當(dāng)pH＜2.0 時(shí)，果膠提取得率隨著酸性的增高而降低，這是因?yàn)闃悠吩谳^強(qiáng)酸性溶劑的浸泡中，原果膠逐漸轉(zhuǎn)化成可溶性果膠，然而較強(qiáng)的酸性環(huán)境又會(huì)促使果膠脫脂分解[32]；當(dāng)pH＞2.0 時(shí)，果膠提取得率隨酸性降低而下降，這是因?yàn)槿軇┧嵝暂^低時(shí)，樣品中原果膠轉(zhuǎn)化成可溶性果膠能力也隨之降低，提取效率下降[33]。

圖2 pH 對PFP 果膠提取得率的影響Fig.2 Effect of pH on pectin extraction ratio of PFP

2.2.2 料液比對PFP 果膠提取得率的影響 如圖3，PFP 果膠提取得率隨料液比加大呈先上升后下降趨勢，當(dāng)料液比為1:25 g/mL 時(shí)，提取得率達(dá)最大值14.57%，可能酸性溶液用量逐漸加大時(shí)，溶質(zhì)與溶劑濃度差也隨之增大，作為溶質(zhì)的原果膠則更加迅速擴(kuò)散溶出，果膠提取得率增高[34]；當(dāng)料液比＞1:25 g/mL時(shí)，果膠提取得率呈下降趨勢，下降了3.09%，這可能是因?yàn)楣z擴(kuò)散距離拉長，擴(kuò)散能力降低，且隨溶劑增加，溶劑對超聲波的能量消耗也隨之增加，導(dǎo)致作為溶質(zhì)的原果膠吸收能量減少，果膠提取得率下降[33?34]。

圖3 料液比對PFP 果膠提取得率的影響Fig.3 Effect of liquid to material ratio on pectin extraction ratio of PFP

2.2.3 超聲時(shí)間對PFP 果膠提取得率的影響 如圖4，PFP 果膠提取得率隨超聲時(shí)間延長呈先上升后下降趨勢，當(dāng)超聲時(shí)間70 min 時(shí)，果膠提取得率達(dá)最大值13.79%。當(dāng)超聲時(shí)間＜70 min 時(shí)，隨時(shí)間增加，果膠逐漸從物料組織中溶出并擴(kuò)散，轉(zhuǎn)變成水溶性果膠，提取得率增加[35]；而超聲時(shí)間過長（＞70 min）會(huì)使果膠部分結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生降解、脫脂等，且雜質(zhì)溶出率增加，導(dǎo)致果膠提取得率下降[36]。

圖4 超聲時(shí)間對PFP 果膠提取得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on pectin extraction ratio of PFP

2.2.4 超聲功率對PFP 果膠提取得率的影響 如圖5，PFP 果膠提取得率隨超聲功率增強(qiáng)呈先上升后下降趨勢，當(dāng)超聲功率為210 W 時(shí)，提取得率達(dá)最大值14.56%。當(dāng)超聲功率＜210 W 時(shí)，超聲波“空化作用”加速了超聲波對物料組織的破壞，促使果膠大分子逐漸溶出，提取得率增加[17]；當(dāng)超聲功率＞210 W 時(shí)，果膠降解率隨著大功率超聲波作用增大而增大，溶質(zhì)留在超聲場中作用時(shí)間縮短，無法充分破壁，且其他雜質(zhì)也會(huì)溶出，導(dǎo)致果膠提取得率下降[37]。

圖5 超聲功率對PFP 果膠提取得率的影響Fig.5 Influence of ultrasonic power on pectin extraction ratio of PFP

2.2.5 超聲溫度對PFP 果膠提取得率的影響 如圖6，PFP 果膠提取得率隨超聲溫度升高呈先上升后下降趨勢，當(dāng)超聲溫度為50 ℃時(shí)，提取得率達(dá)最大值14.82%。當(dāng)超聲溫度＜50 ℃時(shí)，隨著溫度升高會(huì)產(chǎn)生更高的傳質(zhì)速率和溶劑擴(kuò)散速率，從而提高提取得率[38]；當(dāng)超聲溫度＞50 ℃時(shí)，溫度過高會(huì)對果膠分子結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，使部分果膠發(fā)生降解[39]，導(dǎo)致果膠提取得率降低。

圖6 超聲溫度對PFP 果膠提取得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on pectin extraction ratio of PFP

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 運(yùn)用Design Expert 10.0 軟件對響應(yīng)值和各個(gè)因素進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得二次多元回歸方程為：Y=14.63?0.42A+0.03B?0.12C?0.39D+0.73AB+0.03AC+0.2AD?0.65BC?0.08BD+0.43CD?1.2A2?0.91B2?0.8C2?0.61D2，響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表2 所示。

表2 Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Benhnken test

2.3.2 回歸模型的方差分析 通過F統(tǒng)計(jì)量、響應(yīng)面二次多項(xiàng)式模型的方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)了回歸模型的顯著性，見表3。失擬項(xiàng)通常用來描述回歸模型的合適程度，考察沒有在回歸范圍內(nèi)被包含的數(shù)據(jù)點(diǎn)。本研究模型失擬項(xiàng)F值為2.93，P值為0.1558（P＞0.05），表明失擬項(xiàng)不顯著，該模型擬合度較好。A、D、AB、A2、B2、C2、D2對PFP 果膠提取量影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)B、C 項(xiàng)與交互項(xiàng)AC、AD、BD、CD 均不顯著（P＞0.05）。由各因素P值可以得知各因素對PFP 果膠提取得率影響順序?yàn)锳＞D＞C＞B，即pH＞超聲溫度＞超聲功率＞超聲時(shí)間。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3.3 響應(yīng)面分析 各因素及其交互作用對果膠提取得率的影響可從響應(yīng)面的變化得到直觀反映，本試驗(yàn)所構(gòu)建模型響應(yīng)面圖如圖7 所示。PFP 果膠的提取得率隨著各因素水平變化而變化，A 與B 曲線坡度最為陡峭，說明pH 與超聲時(shí)間的交互作用最為顯著，其次是B 與C，說明超聲功率與超聲時(shí)間的交互作用比其它兩因素較為顯著，結(jié)果與方差分析一致。

圖7 各因素之間的交互作用對果膠提取得率的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of interaction between various factors on pectin extraction rate

2.3.4 最佳工藝驗(yàn)證 通過對PFP 果膠提取得率二次多項(xiàng)式解析，得提取PFP 果膠最佳工藝條件為：pH1.90，超聲時(shí)間70.54 min，超聲功率204.09 W，超聲溫度45.78 ℃，此時(shí)PFP 果膠理論提取得率為14.76%?？紤]到實(shí)際操作可行性，將工藝調(diào)整為：pH2.0，超聲時(shí)間70 min，超聲功率210 W，超聲溫度45 ℃，按此工藝條件進(jìn)行5 組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得PFP 果膠提取得率為14.78%±0.21%。

2.4 PFP 果膠的抗氧化活性

2.4.1 對DPPH·的清除率 DPPH 是一種親脂自由基，溶于醇時(shí)會(huì)呈紫色，在517 nm 處存在特殊的吸收峰[40]。當(dāng)果膠樣品存在抗氧化活性時(shí)，DPPH·會(huì)失去孤對電子，失去孤對電子數(shù)量越多，樣品溶液褪色越明顯，表明樣品抗氧化能力越強(qiáng)，所以此現(xiàn)象常被用來評價(jià)抗氧化劑的抗氧化性[41]。本研究以VC為陽性對照，研究PFP 中果膠對DPPH·清除能力。如圖8，PFP 果膠對DPPH·的清除作用在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈一定劑量依賴效應(yīng)。在0.5～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，VC對DPPH·的清除率保持在91%以上，酸法和超聲波輔助酸法提取的PFP 果膠對DPPH·清除率的變化均呈緩慢上升趨勢，當(dāng)果膠濃度為3.0 mg/mL 時(shí)，對DPPH·清除率分別為46.37%±1.45%和60.96%±1.03%。結(jié)果表明PFP 果膠對DPPH·具有良好的清除能力，且超聲波輔助提取后清除能力得到明顯增強(qiáng)。

圖8 PFP 果膠對DPPH·清除率Fig.8 DPPH free radical scavenging rate of PFP pectin

2.4.2 對·OH 的清除率 ·OH 是一種常見自由基，它從細(xì)胞膜、DNA 等方面損害生物體[42]。如圖9，在質(zhì)量濃度0.5～3.0 mg/mL 范圍內(nèi)，VC對·OH 清除率穩(wěn)定保持在90%以上；酸法和超聲波輔助酸法提取的PFP 果膠對·OH 清除能力均隨果膠質(zhì)量濃度增加而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL 時(shí)，對·OH 清除率分別為58.37%±1.09%和80.16%±1.78%，且在此質(zhì)量濃度范圍，PFP 果膠對·OH 清除效果差異均顯著（P＜0.05）。超聲波輔助酸法提取的果膠清除·OH 能力作用明顯高于酸法，這與Torkamani 等[19]的研究結(jié)果一致。

圖9 PFP 果膠對·OH 清除率Fig.9 Hydroxyl radical scavenging rate of PFP pectin

圖10 PFP 果膠對·清除率Fig.10 Superoxide anion radical scavenging rate of PFP pectin

3 結(jié)論

本研究以‘福建百香果2 號’果皮為試驗(yàn)原料，依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得出最優(yōu)提取工藝參數(shù)為pH2.0，超聲時(shí)間70 min，超聲功率210 W，超聲溫度45 ℃，按此工藝條件進(jìn)行5 組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得PFP 果膠平均提取得率為14.78%±0.21%，與響應(yīng)面預(yù)測值僅差0.02%，說明模型能較好預(yù)測果膠提取得率。研究發(fā)現(xiàn)PFP 果膠具有較好的抗氧化活性，且經(jīng)過超聲波處理后PFP 果膠的抗氧化活性明顯提高，尤其是對清除·OH 能力明顯增強(qiáng)。結(jié)果表明，利用超聲波輔助酸法能夠提高果膠得率，并且增強(qiáng)了提取果膠的抗氧化活性，為百香果皮果膠的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。但超聲波增強(qiáng)果膠抗氧化活性的途徑暫不明確，可能是超聲波通過影響果膠結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等途徑，也可能與PFP 果膠的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等有關(guān)，之后可進(jìn)行深入研究。