靳 燕，李延嘯，馬俊文，王玉川，閆巧娟，江正強(qiáng),3,

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，中國輕工業(yè)食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023）

淀粉是地球中儲(chǔ)量最豐富的可再生資源之一[1]，是一種天然的葡萄糖聚合物，主要包括兩種類型：直鏈淀粉和支鏈淀粉。α-淀粉酶（EC.3.2.1.1）可以隨機(jī)水解淀粉分子內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，生成短鏈糊精、麥芽寡糖和少量葡萄糖，因其生產(chǎn)成本低、pH 適用范圍廣、熱穩(wěn)定性能好[2]等優(yōu)點(diǎn)而在淀粉糖[3]、釀造[4]和面包烘焙等食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用。

分子改造技術(shù)能提高已有α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性和比酶活等酶學(xué)特性，是提升α-淀粉酶工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的有效方法之一[5]。目前，許多研究報(bào)道了α-淀粉酶的分子改造，常用的方法包括定向進(jìn)化、定點(diǎn)突變和理性設(shè)計(jì)等。其中，定向進(jìn)化無需了解蛋白酶結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，可快速建立突變體文庫，通過高通量篩選，能有效改良酶的功能[5?6]。如HUANG 等[7]利用定向進(jìn)化技術(shù)對地衣芽孢桿菌來源的α-淀粉酶（BSA）進(jìn)行分子改造，獲得了一個(gè)耐酸性提高的突變體G81R，在pH4.5 下孵育40 min 后仍然保留10%的初始酶活，而相同條件下的野生型淀粉酶已經(jīng)基本沒有活性。WU 等[8]利用易錯(cuò)PCR 對解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）來源的液化α-淀粉酶（BAA）進(jìn)行分子改造，有效降低了突變體對Ca2+的依賴性，且突變體的催化效率（kcat/Km）較野生型提高了2.4 倍。劉雪蓮等[9]利用DNA 重排技術(shù)構(gòu)建地衣芽孢桿菌來源的α-淀粉酶突變文庫，篩選得到最適溫度提高10 ℃、最適pH 降低0.5～1 個(gè)單位且對Ca2+依賴性降低的突變體V-2。此外，基于基因工程技術(shù)進(jìn)行異源表達(dá)是實(shí)現(xiàn)α-淀粉酶高產(chǎn)量的重要途徑之一。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)因具有高效表達(dá)、胞外分泌等優(yōu)勢而受到廣大研究者和生產(chǎn)者的關(guān)注。如趙寧等[10]將嗜熱真菌樟絨枝霉（Malbranchea cinnamomea）來源的α-淀粉酶在畢赤酵母中高效表達(dá)，高密度發(fā)酵至168 h 時(shí)，胞外酶活力達(dá)到13440.6 U/mL。WANG 等[11]將米黑根毛霉來源的α-淀粉酶在畢赤酵母中高效表達(dá)，發(fā)酵168 h 后，其酶活達(dá)29794.2 U/mL。WANG等[12]將嗜熱杜邦菌來源的α-淀粉酶在畢赤酵母中高效表達(dá)，發(fā)酵168 h 后，其酶活達(dá)38314 U/mL。迄今，已有較多α-淀粉酶在畢赤酵母系統(tǒng)中成功表達(dá)，但達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平的不多。因此，基于定向進(jìn)化技術(shù)獲得一個(gè)穩(wěn)定性和比酶活力同時(shí)提高的α-淀粉酶突變體具有重要意義。

前期研究了嗜熱杜邦菌（Thermomyces dupontii）來源的GH13 家族α-淀粉酶（Td-amy）的酶學(xué)性質(zhì)和異源表達(dá)[11]。該酶具有優(yōu)良的水解特性，在焙烤食品等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力，但是該酶的熱穩(wěn)定性和比酶活較低。本研究利用易錯(cuò)PCR 及定向進(jìn)化技術(shù)對Td-amy 進(jìn)行分子改造，構(gòu)建隨機(jī)突變文庫，經(jīng)高通量篩選以期篩選得到耐熱性和比酶活同時(shí)提高的突變體，并通過定點(diǎn)突變分析各突變氨基酸對其酶學(xué)性質(zhì)的影響，最后將改造后的α-淀粉酶在畢赤酵母中高效表達(dá)，為淀粉酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱杜邦菌 本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏；載有嗜熱杜邦菌來源α-淀粉酶基因的重組質(zhì)粒pPIC9k-Tdamy 和重組質(zhì)粒pET28a-Td-amy 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；克隆表達(dá)宿主大腸桿菌工程菌株DH5α 和Rosetta（DE3） 北京博邁德基因技術(shù)有限公司；表達(dá)載體pET-28a（+） Novagen；畢赤酵母GS115北京全式金生物技術(shù)有限公司；載體pPIC9K 美國Invitrogen；Fast Pfu DNA 聚合酶（500 U/mL） 北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHI（20000 U/mL）、NdeI（20000 U/mL）、AvrII（20000 U/mL）、SnaBI（20000 U/mL）、SalI（10000 U/mL）和T4 DNA 連接酶（1000 U/mL）美國NEB 公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒 北京博邁德基因技術(shù)有限公司；高純質(zhì)粒小量提取試劑盒 北京天根生物科技有限公司；酵母膏和胰蛋白胨Oxoid 公司；DNS 北京索萊寶科技有限公司；溶菌酶（20000 U/mg）、可溶性淀粉、NaCl、檸檬酸、檸檬酸三鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、2-嗎啉乙磺酸（MES）、2-環(huán)己基氨基乙磺酸（CHES）、3-環(huán)己基-1-丙磺酸（CAPS）和咪唑 美國sigma 公司；Geneticin（G418）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素和氨芐青霉素 美國 Inalco；其它試劑若無特殊說明均是國產(chǎn)分析純。

MD 平板培養(yǎng)基（g/L）：10×葡萄糖（20%，w/v）100 mL，10×YNB（13.4%，w/v）100 mL，500×生物素（0.02 g/L）2 mL，瓊脂粉15 g；LB 液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g；LB 平板培養(yǎng)基（g/L）：LB 液體培養(yǎng)基，瓊脂粉15 g；YPD 液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物10 g，胰蛋白胨20 g，葡萄糖20 g（葡萄糖與其他成分分開滅菌）；YPDG418 平板培養(yǎng)基（g/L）：YPD 液體培養(yǎng)基，瓊脂粉15 g，1～4 mg/mL G418。

Gene Pulser MXcell 電轉(zhuǎn)儀、PCR MyCycler 自動(dòng)擴(kuò)增儀和 Power Pac BasicTM 型電泳儀 美國BIO-RAD 公司；TGL 12GB 高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；TU 1800PC 紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；金屬親和層析柱料Ni-NTA agarose 德國 Qiagen 公司；國強(qiáng)5 L 高密度發(fā)酵罐 上海國強(qiáng)生化工程設(shè)備有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；HZQ-X100 恒溫?fù)u床 江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技公司；XMTD-6000恒溫水浴鍋 北京長風(fēng)儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1α-淀粉酶（Td-amy）隨機(jī)突變文庫的建立及高通量篩選

1.2.1.1α-淀粉酶（Td-amy）隨機(jī)突變文庫的建立易錯(cuò)PCR 反應(yīng)體系如下：0.1 mmol/L Mn2+/0.2 mmol/L Mn2+1 μL，5 mmol/L Mg2+1 μL，0.2 mmol/L dGTP和dATP 各1 μL，1.0 mmol/L dCTP 和dTTP 各1 μL，0.2 μmol/L Td-amy-F 和Td-amy-R 各1 μL（見表1），1.25 U rTaq DNA 聚合酶1 μL，5 ng pPIC9K-Tdamy 重組質(zhì)粒1 μL，5x pfu buffer 10 μL，剩余用超純水補(bǔ)足至50 μL。易錯(cuò)PCR 反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，90 s；反應(yīng)循環(huán)34 次；72 ℃，10 min。

表1 本文所用引物Table 1 Primers used in this study

易錯(cuò)PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證正確后進(jìn)行膠回收，膠回收產(chǎn)物與pET28a 質(zhì)粒用相同的限制性酶BamHI 和HindIII 在37 ℃下雙酶切處理，并在T4DNA 連接酶的作用下16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將所有單菌落從平板刮取至新鮮LB 培養(yǎng)基中，搖菌提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta（DE3）中，收集所有轉(zhuǎn)化子，即為隨機(jī)突變文庫。隨機(jī)對10 個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序分析，計(jì)算突變體文庫的文庫容量和突變量。

1.2.1.2 突變文庫的初篩 將96 孔板中加入100 μL的含卡那霉素（50 μg/mL）的LB 培養(yǎng)基，之后用牙簽挑取突變體接種至96 孔板，同時(shí)接種野生型作為對照，37 ℃培養(yǎng)4 h 作為種子液。將96 孔板中的菌液取20 μL 轉(zhuǎn)接至新的裝有180 μL 新鮮LB 培養(yǎng)基（含卡那霉素50 μg/mL）的96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)3 h后加入IPTG 10 μL 使其終濃度為0.5 mmol/L，16 ℃、180 r/min 誘導(dǎo)16 h。4 ℃、3000 r/min 離心20 min獲得菌體，將菌體于?80 ℃冷凍2 h 后于室溫下復(fù)融，加入100 μL 溶菌酶（10 mg/mL），pH8.0、37 ℃處理30 min，再于4 ℃、3000 r/min 離心20 min，獲得上清液即為粗酶液。

在96 孔深孔板中加入90 μL 1%（w/v）可溶性淀粉（50 mmol/L MES 緩沖液，pH6.5），然后加入10 μL 的粗酶液，置于55 ℃反應(yīng)10 min，加入100 μL的DNS 終止反應(yīng)。將上述反應(yīng)液于沸水浴煮10 min，冷卻至室溫后，3000 r/min 離心10 min 后取上清用酶標(biāo)儀測酶活。選擇酶活高于對照的菌株用于下一步的復(fù)篩。

1.2.1.3 突變文庫的復(fù)篩 選取初篩為陽性的克隆接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)，取1 mL 菌液在600 nm 處測吸光度值。當(dāng)其OD600達(dá)0.6～0.8，加入10 μL IPTG 使其終濃度為0.5 mmol/L 進(jìn)行重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)。分別測定不同菌株粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)。以最適溫度和酶活升高的突變體作為正向突變體。

1.2.2 mTd-amy 的純化和酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.2.1 純化 粗酶液使用Ni-IDA 柱（1 cm×5 cm）純化。先用10 個(gè)柱體積的緩沖液A（20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液PB，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH8.0）以1.0 mL/min 的流速平衡柱子，粗酶液以0.5 mL/min 流速上樣；用緩沖液A 以1.0 mL/min 流速洗脫至OD280＜0.05，除去雜蛋白，然后分別用洗脫緩沖液B（20 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L 咪唑，pH8.0）和緩沖液C（20 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl，100 mmol/L 咪 唑，pH8.0）以1.0 mL/min 洗脫并收集目的蛋白。洗脫后經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢驗(yàn)其純度。

1.2.2.2 酶活力和蛋白濃度的測定α-淀粉酶酶活力的測定采用DNS 法（3,5-二硝基水楊酸法）[13]：將酶液用MES 緩沖液（50 mmol/L，pH6.5）進(jìn)行適當(dāng)稀釋，吸取100 μL 適當(dāng)稀釋的酶液至900 μL 可溶性淀粉溶液（1.0%，w/v，50 mmol/L MES 緩沖液，pH6.5）中，振蕩均勻后，在55 ℃下反應(yīng)10 min，加入1 mL DNS 溶液終止反應(yīng)，于沸水浴中加熱10 min，測定OD540條件下的吸光度值，并使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)。α-淀粉酶酶活力定義為：在以上反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol 葡萄糖所需要的酶量定義為1 U。蛋白質(zhì)濃度測定參考LOWRY 等[14]的方法。Folin 甲A 液和Folin 甲B 液按50:1 比例混合，每個(gè)樣品加1 mL 上述混合液和100 μL 適當(dāng)稀釋的酶液，輕振蕩后室溫靜置10 min，加入100 μL Folin乙，迅速振蕩后于37 ℃水浴靜置30 min 后于OD650處測定吸光度值。以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.3 野生型Td-amy 及突變體mTd-amy 酶學(xué)性質(zhì)的測定 a.最適pH 及pH 穩(wěn)定性：在50 ℃（Td-amy）、55 ℃（mTd-amy）50 mmol/L 不同pH 的緩沖溶液中測定純酶的酶活以確定其最適pH。所選擇的緩沖體系分別為：檸檬酸鹽緩沖液（pH3.0～5.0）、MES 緩沖液（pH5.5～6.5）、磷酸鹽緩沖液（pH7.0～8.0）、CHES緩沖液（pH8.5～10.0）、CAPS 緩沖液（pH10.5～11.0）。將酶液用上述不同體系不同 pH 的緩沖液稀釋至OD540為0.2～0.8，于45 ℃水浴中保溫30 min，然后迅速置于冰水浴冷卻30 min，測定殘余酶活力。

b.最適溫度及熱穩(wěn)定性：最適溫度的測定是將純酶用50 mmol/L、pH6.5 的MES 緩沖溶液適當(dāng)稀釋，分別在40～80 ℃下測定野生型Td-amy 和突變體mTd-amy 酶活力，確定其最適溫度。將純酶用50 mmol/L、pH6.5 的MES 緩沖溶液適當(dāng)稀釋，在40～80 ℃下孵育30 min，然后于冰水浴中冷卻30 min后，加熱至55 ℃（Td-amy）和60 ℃（mTd-amy）測定殘余酶活力。

1.2.2.4 底物特異性的測定 分別以1.0%（w/v）可溶性淀粉、紅薯淀粉、小麥淀粉、玉米淀粉和馬鈴薯淀粉為底物，測定野生型Td-amy 和突變體mTdamy 的底物特異性。分別在55 ℃（Td-amy）和60 ℃（mTd-amy）、pH6.5（50 mmol/L MES 緩沖液）的條件下反應(yīng)10 min。采用DNS 法[13]測定酶活，以可溶性淀粉為底物測得的酶活設(shè)定為100%，每分鐘反應(yīng)生成1 μmol 葡萄糖所需要的酶量定義為1 個(gè)酶活力單位。

1.2.3α-淀粉酶（Td-amy）的定點(diǎn)突變及結(jié)構(gòu)模擬分析 將篩選到的陽性突變體α-淀粉酶基因（mTdamy）測序后，與野生型基因（Td-amy）序列進(jìn)行比對分析，確定陽性克隆的突變位點(diǎn)。根據(jù)突變位點(diǎn)信息，以野生型基因?yàn)槌霭l(fā)點(diǎn)向陽性突變體的方向逐一進(jìn)行定點(diǎn)突變。

定點(diǎn)突變以重組質(zhì)粒pET28a-Td-amy 為模板，用定點(diǎn)突變引物（表1），PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s；72 ℃延伸3 min，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnI 在37 ℃條件下消化2 h，直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的重組菌涂布于LB 固體培養(yǎng)基（含卡那霉素50 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)12 h，對單菌落進(jìn)行菌落PCR，并測序得到每個(gè)突變位點(diǎn)的20 個(gè)突變體。收集質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）。

以米曲霉（A.oryzae）來源的Takaα-淀粉酶（PDB：6XSJ，序列同源性為65.54%）結(jié)構(gòu)為模板，經(jīng)SWISS-MODEL 進(jìn)行同源結(jié)構(gòu)模擬，得到α-淀粉酶（Td-amy）結(jié)構(gòu)，根據(jù)預(yù)測的結(jié)構(gòu)信息對突變位點(diǎn)進(jìn)行分析。利用PyMOL 軟件分析氨基酸殘基間氫鍵相互作用和突變位點(diǎn)對蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

1.2.4 mTd-amy 在畢赤酵母中表達(dá)及高密度發(fā)酵

1.2.4.1 mTd-amy 在畢赤酵母中表達(dá) 用限制性內(nèi)切酶 SnaBI 和AvrII 對淀粉酶突變體基因（mTdamy）和載體 pPIC9K 雙酶切，凝膠回收后連接獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-mTd-amy。重組質(zhì)粒pPIC9KmTd-amy 用限制性內(nèi)切酶SalⅠ線性化后電轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母GS115 中。取 100～200 μL 電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于MD 平板培養(yǎng)基，30 ℃下培養(yǎng)2～3 d 后用無菌蒸餾水將MD 平板上生長的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子洗脫和重懸。分別涂布于含有不同質(zhì)量濃度的YPD-G418 平板培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)2～5 d。挑取不同質(zhì)量濃度G418 平板培養(yǎng)基上的單菌落搖瓶發(fā)酵3 d，吸取上清液檢測淀粉酶酶活力。

1.2.4.2 突變體mTd-amy 的高密度發(fā)酵 選取搖瓶發(fā)酵淀粉酶酶活力最高的重組菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵。發(fā)酵方法及培養(yǎng)基的配制參照畢赤酵母發(fā)酵手冊（Version B,053002,Invitrogen）操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖片處理采用 Origin 8.0 進(jìn)行，數(shù)據(jù)均為3 次平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-淀粉酶突變文庫的構(gòu)建和篩選

采用Mg2+和Mn2+進(jìn)行易錯(cuò)PCR 擴(kuò)增，與pET28a載體酶切連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，得到隨機(jī)突變文庫。隨機(jī)對10 個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明，當(dāng)Mg2+濃度為5 mmol/L 和Mn2+濃度為0.1 mmol/L 時(shí)，隨機(jī)突變文庫中堿基突變率約為0.21%，氨基酸突變率約為0.63%，為合適突變率。經(jīng)過兩輪篩選，最終得到1 個(gè)比酶活明顯升高的正向突變體，命名為mTd-amy。該突變體的比酶活為466.3 U/mg，相對于野生型（227.90 U/mg）提高至2.0 倍，測序結(jié)果表明，α-淀粉酶突變基因（mTd-amy）中有四個(gè)堿基發(fā)生改變，分別為C11T、C365T、A581G 和C1403A，導(dǎo)致該突變體中四個(gè)氨基酸發(fā)生改變，即Ala4Val、Ala122Val、Lys194Arg和Ala468Asp。將野生型α-淀粉酶基因（Td-amy）和突變體基因（mTd-amy）的氨基酸序列與其它GH13 家族α-淀粉酶進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)Ala4Val、Ala122Val、Lys194Arg 為部分保守氨基酸，而Ala468Asp 為非保守氨基酸。

2.2 野生型Td-amy 和突變體mTd-amy 的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適條件的測定 將突變體mTd-amy 純化后，SDS-PAGE 結(jié)果分析表明目的蛋白條帶均一，分子量為61.2 kDa（圖1），與其預(yù)測分子量和野生型Td-amy 分子量一致。對野生型Td-amy 和突變體mTd-amy 酶學(xué)性質(zhì)測定結(jié)果如圖2。mTd-amy 的最適pH 為6.5（圖2A），在pH4.5～10.0 范圍內(nèi)保持穩(wěn)定（圖2B），與野生型Td-amy 研究結(jié)果一致[12]。mTd-amy 的最適溫度為60 ℃（圖2C），較野生型（大腸桿菌中表達(dá)）提高了5 ℃，明顯高于許多不同來源的重組α-淀粉酶，如來源于萊斯氏菌屬（45 ℃）[15]、海洋專性放線菌（50 ℃）[16]、柄籃狀菌（50 ℃）[17]和嗜堿溶淀粉性堿單胞菌（50 ℃）等[18]；mTd-amy 在55 ℃以下保持穩(wěn)定，在55 ℃下保溫30 min 后仍能夠殘留90%左右的酶活力（圖2D），而Td-amy（大腸桿菌中表達(dá)）僅在50 ℃以下保持穩(wěn)定。另外，mTdamy 在65 和70 ℃保溫30 min 后，殘余酶活分別為27.3%和14.2%；而經(jīng)過相同處理后，Td-amy（在大腸桿菌中表達(dá)）的殘余酶活分別僅為16.3%和8.1%。這表明進(jìn)化后突變體mTd-amy 的最適溫度和熱穩(wěn)定性均有所提高。

圖1 野生型（Td-amy）和突變體（mTd-amy）純化蛋白電泳圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of the proteins during purification process of Td-amy and mTd-amy

圖2 野生型Td-amy 和突變體mTd-amy 的最適pH（A）、pH 穩(wěn)定性（B）、最適溫度（C）和溫度穩(wěn)定性（D）Fig.2 Optimal pH (A),pH stabilities (B),optimal temperatures(C) and thermostabilities (D) of Td-amy and mTd-amy

2.2.2 底物特異性 野生型Td-amy 和突變體mTdamy 對不同底物的特異性如表2 所示。結(jié)果表明，野生型Td-amy 和突變體mTd-amy 對多種底物均有水解活性，兩者均對玉米淀粉的水解能力最強(qiáng)，與丁夢瑤等[19]對約氏黃桿菌HSL13 中新型α-淀粉酶的底物特異性研究一致，其次是小麥淀粉、紅薯淀粉和馬鈴薯淀粉。突變體mTd-amy 對不同底物的比酶活均明顯提高，其中，底物為馬鈴薯淀粉和可溶性淀粉時(shí)，其比酶活都比野生型Td-amy 提高了2 倍以上。

表2 野生型Td-amy 和突變體mTd-amy 的底物特異性Table 2 Substrate specificity of Td-amy and mTd-amy

2.3 定點(diǎn)突變及結(jié)構(gòu)模擬分析

定點(diǎn)突變結(jié)果表明（表3），與野生型Td-amy 相比，單突變體Ala122 Val 的比酶活較野生型提高至194.6%，但低于突變體mTd-amy（提高至204.6%），其余三個(gè)單突變體Ala4Val、Lys194Arg 和Ala468Asp與野生型Td-amy 相比，比酶活明顯降低。突變體Ala122Val 和Ala468Asp 的最適溫度較野生型提高了5 ℃。所有突變體最適pH 未發(fā)生變化。推測第122 位丙氨酸（Ala）突變和第468 位丙氨酸（Ala）突變是影響mTd-amy 酶學(xué)性質(zhì)的關(guān)鍵。

表3 突變體mTd-amy 的定點(diǎn)突變各個(gè)突變體的最適溫度、最適pH 及相對酶活Table 3 The optimal temperature,optimal pH and relative enzyme activity of mutants for site-directed mutation of mTd-amy

經(jīng)SWISS-MODEL 同源結(jié)構(gòu)模擬，得到α-淀粉酶（Td-amy）的結(jié)構(gòu)模型（圖3），與其他GH13 家族α-淀粉酶相似，Td-amy 呈現(xiàn)典型的（β/α）8-TIM 桶結(jié)構(gòu)，C 端區(qū)域還包含有一個(gè)小的β-片層結(jié)構(gòu)，由8 個(gè)β-折疊和1 個(gè)小的α-螺旋結(jié)構(gòu)組成。其中，Asp179、Glu232 和Asp299 為關(guān)鍵催化氨基酸，位于TIM 桶入口處。根據(jù)三維結(jié)構(gòu)可知，該酶第4 位的丙氨酸、第194 賴氨酸和第468 位的丙氨酸均位于酶分子的表面，而第122 位的丙氨酸位于酶分子內(nèi)部。

圖3 Td-amy 和 mTd-amy 的結(jié)構(gòu)、改變位點(diǎn)、作用力和表面電荷分布示意圖Fig.3 Schematic diagram of structure,mutant sites,molecular force changes and surface charge distribution of Td-amy and mTd-amy

通常，蛋白質(zhì)表面電荷的變化會(huì)影響蛋白質(zhì)的折疊以及酶分子的催化特性[20?21]。第4 位電中性的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸后，具有較大β側(cè)鏈的氨基酸纈氨酸不利于α螺旋的穩(wěn)定[22]，這可能是造成其比酶活降低的原因。第194 位賴氨酸突變?yōu)榫彼岷?，精氨酸有更長的側(cè)鏈，增加了空間位阻，影響α螺旋的穩(wěn)定，導(dǎo)致突變體酶活明顯降低[23]。第468位電中性的丙氨酸突變?yōu)樨?fù)電性的天冬氨酸，導(dǎo)致該區(qū)域表面電荷由電中性變?yōu)槿踟?fù)電性，推測可能是表面電荷的變化使其比酶活降低。另外，突變后第468 位的天冬氨酸增加了與第469 位精氨酸的相互作用力，有利于該Loop 區(qū)的穩(wěn)定，可能是導(dǎo)致其最適溫度提高的原因。雖然122 位丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸沒有導(dǎo)致酶分子相互作用和表面電荷的改變，但A122 與三個(gè)催化氨基酸均位于催化凹槽入口處的Loop 區(qū)域。由于Loop 區(qū)是酶結(jié)構(gòu)中最靈活的部分，酶的進(jìn)化經(jīng)常涉及它們在環(huán)區(qū)的殘基變化[24]。Loop 區(qū)域氨基酸的變化可能對底物的特異性結(jié)合產(chǎn)生了影響。另外，丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸后，穩(wěn)定了底物結(jié)合區(qū)的空間結(jié)構(gòu)，有利于底物的結(jié)合，既提高了酶活性，也提高了熱穩(wěn)定性[25]。

雖然單突變體Ala4Val、Lys194Arg 和Ala468-Asp 比酶活都相對于野生型Td-amy 有所降低，但四突變體mTd-amy 的比酶活較野生型Td-amy 提高204.6%，說明單突變體的酶學(xué)性質(zhì)經(jīng)組合突變后并不一定產(chǎn)生疊加效應(yīng)。這一結(jié)果與陳春等[26]對來源于Arthrobacter ramosus的MTHase 以及史然等[27]對地桿菌來源的α-L-巖藻糖苷酶進(jìn)行定向進(jìn)化的研究結(jié)果類似。

2.4 mTd-amy 的高密度發(fā)酵

突變體mTd-amy 成功在畢赤酵母中高效表達(dá)，經(jīng)168 h 高密度發(fā)酵，發(fā)酵上清液的α-淀粉酶酶活力和蛋白含量分別達(dá)64696 U/mL 和33.6 mg/mL，菌體濕重439 mg/mL（圖4A）。發(fā)酵過程中發(fā)酵上清液的蛋白電泳如圖4B 所示，誘導(dǎo)開始，發(fā)酵上清液出現(xiàn)目的條帶（61.2 kDa）；隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間延長，目的條帶逐漸變粗，發(fā)酵上清液中mTd-amy 的蛋白含量逐漸增加。

圖4 畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)α-淀粉酶（mTd-amy）歷程圖（A）和SDS-PAGE 分析（B）Fig.4 Time-course of mTd-amy expression in P.pastoris by high-cell density fermentation (A) and SDS-PAGE analysis (B)

突變體mTd-amy 的產(chǎn)酶水平明顯高于許多不同來源α-淀粉酶在畢赤酵母中異源表達(dá)的產(chǎn)酶水平，如來源于米曲霉（72 U/mL）[28]、微小根毛霉（8285 U/mL）[29]、地衣芽孢桿菌（11000 U/mL）[30]、米黑根毛霉（29794.2 U/mL）[11]和微小胞根霉（32100 U/mL）[31]。此外，mTd-amy 的蛋白含量也明顯高于許多不同來源重組α-淀粉酶在畢赤酵母中表達(dá)的蛋白含量，如米曲霉（0.4 mg/mL）[32]、微小胞根霉（1.5 mg/mL）[31]和地衣芽孢桿菌（12.2 mg/mL）[30]?？梢姡蛔凅wmTd-amy 的高效表達(dá)為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論與討論

本研究基于定向進(jìn)化及高通量篩選方法對嗜熱杜邦菌來源α-淀粉酶（Td-amy）進(jìn)行分子改造研究，成功篩選到正向突變體mTd-amy，其比酶活較野生型Td-amy 提高至2.0 倍，最適溫度較野生型Tdamy 提高5 ℃，熱穩(wěn)定性也有明顯提升，進(jìn)一步將該酶在畢赤酵母中高效表達(dá)，酶活水平達(dá)64696 U/mL，較野生型Td-amy 提高1.68 倍[12]。ZHU 等[33]基于易錯(cuò)PCR 技術(shù)對來源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶進(jìn)行隨機(jī)突變得到突變體G300H，其比酶活僅提高了9.6%。馬銀鳳等[34]基于酶分子進(jìn)化原理，得到催化特性明顯提高的突變體E2M6，其最適溫度提高5 ℃，但其比酶活沒有明顯改變。本文利用定向進(jìn)化技術(shù)得到了最適溫度和比酶活力同時(shí)改善的正向突變體mTd-amy，為淀粉酶的分子改造提供了理論依據(jù)。同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了該酶的高效表達(dá)，為淀粉酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供了實(shí)踐基礎(chǔ)。今后，仍需對淀粉酶進(jìn)行更深入的分子改造，以提高淀粉酶在不同應(yīng)用中的適應(yīng)性。