王洪超，何宇祺，李青

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，貴陽(yáng) 550004)

觸腦脊液神經(jīng)元(cerebrospinal fluid-contacting neurons，CSF-cNs)簡(jiǎn)稱(chēng)觸液神經(jīng)元，是一組直接與腦脊液接觸的中間神經(jīng)元亞群，產(chǎn)生于神經(jīng)發(fā)育晚期。有學(xué)者首次在兩棲動(dòng)物視網(wǎng)膜中觀察到直接與腦脊液接觸的雙極神經(jīng)元[1]。隨后，Dale等[2]在許多脊髓動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了雙極神經(jīng)元能夠在第三腦室和脊髓中央管區(qū)域通過(guò)頂端延伸接觸腦脊液，并稱(chēng)其為“KA(Kolmer-Agduhr)細(xì)胞”。1989年，Vigh-Teichmann和Vigh[3]將此類(lèi)神經(jīng)元正式命名為“CSF-cNs”。它幾乎存在于所有脊椎動(dòng)物中，可分為室管膜上、室管膜下和遠(yuǎn)位CSF-cNs三類(lèi)[4]。既往人們認(rèn)為，CSF-cNs所處的位置及其纖毛表明它可以感知腦脊液流動(dòng)、壓力及pH值的變化，并分泌神經(jīng)遞質(zhì)[5]，還可參與疼痛、應(yīng)激和藥物成癮等[6]。但因缺乏特異性標(biāo)志物，人們對(duì)其功能仍不十分清楚。有研究證實(shí)，多囊腎病蛋白2-樣1離子通道(polycystin kidney disease 2-like 1，PKD2L1)可特異性標(biāo)記脊椎動(dòng)物室管膜區(qū)與腦脊液接觸的CSF-cNs群體，目前多采用PKD2L1特異性抗體對(duì)CSF-cNs進(jìn)行免疫熒光及免疫組織化學(xué)標(biāo)記[7-8]。PKD2L1+CSF-cNs是γ-氨基丁酸能神經(jīng)元，現(xiàn)已證明其在體外具有神經(jīng)干細(xì)胞特性，是內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞組成之一[9]。因此，研究其生理功能可能為脊髓損傷后的內(nèi)源性修復(fù)提供新的切入點(diǎn)?，F(xiàn)就CSF-cNs生理特性與功能的研究進(jìn)展予以綜述。

1 CSF-cNs的分布及分類(lèi)

在哺乳動(dòng)物中，CSF-cNs的主要類(lèi)型位于脊髓中央管的室管膜層及脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)，其他分布于腦室管膜附近，如側(cè)腦室、第三腦室、導(dǎo)水管下部(Aq)和第四腦室(4V)底板上部的腹側(cè)灰質(zhì)內(nèi)[10]，也存在于海馬、中縫背核等腦實(shí)質(zhì)內(nèi)[11]。

根據(jù)CSF-cNs的形態(tài)和與室管膜的位置關(guān)系，其可以分為三類(lèi)：①室管膜上CSF-cNs，其胞體位于脊髓中央管的室管膜表面，直接與腦脊液相接觸；②室管膜下CSF-cNs，其胞體位于室管膜層，多為雙極，通過(guò)軸突延伸至腦脊液或鄰近的腦實(shí)質(zhì)，其樹(shù)突粗短，末端膨大，表面含有動(dòng)、靜纖毛，可感受腦脊液機(jī)械和化學(xué)變化；③遠(yuǎn)位CSF-cNs，其胞體位于距離室管膜較遠(yuǎn)的腦實(shí)質(zhì)，呈梭形或多邊形，樹(shù)突豐富，軸突較長(zhǎng)，伸向鄰近腦室或其他腦區(qū)[4,12]。

2 CSF-cNs的發(fā)育起源

在小鼠和斑馬魚(yú)等脊椎動(dòng)物中，CSF-cNs起源于兩個(gè)不同的祖細(xì)胞結(jié)構(gòu)域，其特征是表達(dá)不同的轉(zhuǎn)錄因子[13-14]。除了祖細(xì)胞結(jié)構(gòu)域，神經(jīng)發(fā)生的時(shí)間在神經(jīng)元多樣化中起決定作用。為了確定腦脊液中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的時(shí)間，Petracca等[15]在小鼠中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子GATA2和GATA3以及離子通道PKD2L1陽(yáng)性表達(dá)來(lái)鑒定CSF-cNs，他們?cè)谂咛グl(fā)育第14.5天時(shí)發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)PKD2L1+細(xì)胞，此發(fā)育階段被稱(chēng)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞生成期，脊髓神經(jīng)發(fā)生基本消失[16-17]，但隨著發(fā)育的進(jìn)行，CSF-cNs數(shù)量增加，在第16.5天后保持相對(duì)恒定。研究表明，小鼠CSF-cNs起源于兩個(gè)不同的中央管背、腹側(cè)坐標(biāo)的晚期祖細(xì)胞：①CSF-cNs′細(xì)胞約70%來(lái)源于Olig2+p2區(qū)域的Nkx6.1+/Pax6+祖細(xì)胞，約30%源自O(shè)lig2+的pOL區(qū)域的后半部；②CSF-cNs″細(xì)胞則由l-p3區(qū)域中的Nkx2.2+/Foxa2+祖細(xì)胞分化而來(lái)[15]。斑馬魚(yú)脊髓中央管中的KA細(xì)胞由KA′和KA″兩個(gè)亞群組成，其中KA′細(xì)胞來(lái)自PMN區(qū)域中的Olig2+祖細(xì)胞，KA″細(xì)胞是由LFP區(qū)域中的Nkx2.2a+/Nkx2.9+祖細(xì)胞分化而來(lái)[18]。雖然小鼠的CSF-cNs和斑馬魚(yú)的KA細(xì)胞在背腹位置和標(biāo)記表達(dá)上有相似之處，但與小鼠CSF-cNs的晚期發(fā)育相比，斑馬魚(yú)中KA細(xì)胞的出現(xiàn)于自身其他脊髓神經(jīng)元發(fā)生之前或同時(shí)發(fā)生[19-20]，這種異時(shí)性發(fā)育可能與羊膜動(dòng)物和非羊膜動(dòng)物中CSF-cNs和KA的不同功能有關(guān)[15]。

3 CSF-cNs的示蹤劑和特異性標(biāo)志物

3.1示蹤劑的演變 為尋求可靠的標(biāo)記方法，Song等[11]對(duì)辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)和霍亂毒素亞單位B與HRP復(fù)合物(cholera toxin subunit B conjugated with HRP，CB-HRP)兩種方法進(jìn)行了比較。由于HRP可自由通過(guò)腦脊液-腦屏障，擴(kuò)散至腦實(shí)質(zhì)，應(yīng)用HRP順行法標(biāo)記CSF-cNs很難得出科學(xué)的結(jié)論。因此，尋求一種只標(biāo)記CSF-cNs的示蹤劑至關(guān)重要。CB-HRP是一種酶標(biāo)配體示蹤劑，其注入側(cè)腦室后僅局限于腦室系統(tǒng)，不能自由通過(guò)血-腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，只可被具有遠(yuǎn)端延伸的CSF-cNs終末吸收，標(biāo)記效果優(yōu)于HRP。因此，早期應(yīng)用CB-HRP標(biāo)記CSF-cNs來(lái)探索其起源、生長(zhǎng)發(fā)育、功能是可行的。此外，CSF-cNs還可以通過(guò)GATA2和GATA3的表達(dá)來(lái)鑒定。

3.2CSF-cNs的特異性標(biāo)志物 雖然用CB-HRP標(biāo)記CSF-cNs是可行的，但仍缺乏識(shí)別這些細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。Huang等[21]通過(guò)建立PKD2L1表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠，意外發(fā)現(xiàn)CSF-cNs中存在PKD2L1離子通道，這一發(fā)現(xiàn)為CSF-cNs的后續(xù)研究提供便利并成為研究新熱點(diǎn)。PKD2L1是“瞬時(shí)受體電位”超家族中多囊藻毒素亞型的成員，是形成高電導(dǎo)的非選擇性陽(yáng)離子通道，其活性受電壓、鈣、質(zhì)子、細(xì)胞外pH值和滲透壓等影響[22]。多囊藻毒素通道存在于各種組織中，包括睪丸、腎臟和視網(wǎng)膜，也存在于腦組織和脊髓中。PKD2L1最初在小鼠出生后P1～P4階段脊髓的CSF-cNs中被發(fā)現(xiàn)[21]，Djenoune等[18]研究了PKD2L1在小鼠脊髓中的表達(dá)，在胚胎發(fā)育第14.5天時(shí)，頸髓中可見(jiàn)少量PKD2L1+細(xì)胞；從胚胎發(fā)育第16.5天開(kāi)始，定位于中央管周?chē)腜KD2L1+細(xì)胞呈典型的CSF-cNs形態(tài)，胞體通常位于室管膜下，在成年小鼠中也如此；并通過(guò)檢測(cè)小鼠、獼猴和斑馬魚(yú)等脊椎動(dòng)物CSF-cNs中PKD2L1的表達(dá)，證明了PKD2L1是脊椎動(dòng)物共享的CSF-cNs的特異性標(biāo)志物。雖然腦中多囊藻毒素通道的確切功能尚不清楚，但它們通常與細(xì)胞外信號(hào)的感覺(jué)整合有關(guān)，在一些組織中被認(rèn)為是機(jī)械感受器[23-24]和化學(xué)感受器[11,25]。由于CSF-cNs的特殊位置，它可能具有檢測(cè)腦脊液化學(xué)和機(jī)械信號(hào)的功能，與之前CSF-cNs參與腦脊液穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的假設(shè)相一致。Orts-Del′Immagine等[26]利用膜片鉗法對(duì)野生型和突變型PKD2L1小鼠腦干切片中的CSF-cNs進(jìn)行膜片鉗全細(xì)胞記錄，證明了CSF-cNs自發(fā)激活的單一電流是由PKD2L1通道引起，因此PKD2L1可能有助于CSF-cNs細(xì)胞的激活，并成為這些特殊神經(jīng)元的重要興奮性輸入。另外，CSF-cNs可以通過(guò)激活PKD2L1和酸敏感離子通道(acid-sensing ion channel，ASIC)來(lái)區(qū)分周?chē)h(huán)境的堿化和酸化[26]。

4 CSF-cNs的功能

4.1分泌功能 根據(jù)對(duì)CSF-cNs超微結(jié)構(gòu)的觀察，有學(xué)者提出，CSF-cNs胞體和樹(shù)突可基于包含突觸小泡和致密囊泡的軸突末梢組成神經(jīng)分泌系統(tǒng)，這些末梢通過(guò)半橋粒附著在神經(jīng)組織外表面的基底層上并聚集突觸小泡，因此CSF-cNs通過(guò)頂端延伸至脊髓中央管接收腦脊液信號(hào)，并將這些信號(hào)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)分泌輸出，通過(guò)軸突傳達(dá)出去[27-28]。研究表明，不同物種中不同區(qū)域CSF-cNs可釋放不同的神經(jīng)遞質(zhì)，如尾加壓素[29]、γ-氨基丁酸[7]、5-羥色胺[30]等。CSF-cNs通過(guò)分泌神經(jīng)遞質(zhì)向大腦及脊髓動(dòng)態(tài)傳遞信號(hào)，并調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)及發(fā)育。

4.2感知功能 CSF-cNs呈雙極細(xì)胞形態(tài)，其樹(shù)突可進(jìn)入腦室系統(tǒng)，樹(shù)突的末梢常有纖毛，這些帶有纖毛的末端與已知的感知細(xì)胞相似，在細(xì)胞學(xué)上類(lèi)似于化學(xué)感受器和機(jī)械感受器。Desban等[31]研究發(fā)現(xiàn)，CSF-cNs可感知腦脊液中pH值和滲透壓的變化，以及腦脊液流量[32]或脊柱彎曲相關(guān)的機(jī)械刺激[33]。

4.2.1感知酸堿平衡 酸堿平衡對(duì)于生物體的生存至關(guān)重要。研究表明，表達(dá)生長(zhǎng)抑素/γ-氨基丁酸的CSF-cNs可感受細(xì)胞外pH值的雙向偏離。Jalalvand等[34]將堿性和酸性的細(xì)胞外溶液應(yīng)用于小鼠分離的脊髓，同時(shí)對(duì)CSF-cNs進(jìn)行電流和電壓鉗記錄。當(dāng)細(xì)胞外液pH值降低或升高時(shí)，CSF-cNs中內(nèi)向電流顯著增加，應(yīng)用ASIC3阻斷劑APETx2(海藻毒素)后，阻斷了對(duì)酸性的反應(yīng)但不影響堿性反應(yīng)。在堿性pH值下，他們記錄了單一的內(nèi)向電流，大小約為15 pA，與PKD2L1通道的大電導(dǎo)一致。根據(jù)不同pH值下對(duì)CSF-cNs細(xì)胞尖峰活性的記錄發(fā)現(xiàn)，脊髓中CSF-cNs分別通過(guò)ASIC3和PKD2L1通道檢測(cè)pH值的酸性和堿性偏差，導(dǎo)致動(dòng)作電位的去極化和放電增加，并在pH值7.4附近呈U型反應(yīng)[34]。為了研究下丘腦中CSF-cNs堿性pH值的通道類(lèi)型，Jalalvand等[35]進(jìn)行了PKD2L1的原位雜交(不存在特定PKD2L1的阻斷劑)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下丘腦CSF-cNs并不表達(dá)PKD2L1，提示PKD2L1不是下丘腦CSF-cNs的堿性感受器。而連接蛋白半通道作為候選通道即使在沒(méi)有與相鄰細(xì)胞偶聯(lián)的情況下也可以存在于CSF-cNs的細(xì)胞膜上，被認(rèn)為是可以感知堿性pH值的候選分子。生長(zhǎng)抑素陽(yáng)性的下丘腦CSF-cNs對(duì)連接蛋白35/36呈免疫反應(yīng)，應(yīng)用阻斷劑三氯化鑭，可完全阻斷CSF-cNs對(duì)堿性pH值的反應(yīng)，表明下丘腦生長(zhǎng)抑素陽(yáng)性CSF-cNs的堿性反應(yīng)是通過(guò)連接蛋白半通道介導(dǎo)。CSF-cNs這一功能可能代表了一種新的穩(wěn)態(tài)機(jī)制，從而構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可能對(duì)pH值變化引起的損傷起保護(hù)作用。

4.2.2感知流體運(yùn)動(dòng)和光學(xué)信號(hào) ASIC3除了在細(xì)胞外pH值適度降低時(shí)可被質(zhì)子活化，還可以作為機(jī)械傳感器，感知流體運(yùn)動(dòng)。感覺(jué)系統(tǒng)對(duì)于引導(dǎo)對(duì)稱(chēng)生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)回路的平衡激活至關(guān)重要，但它們也可能與形態(tài)發(fā)生有關(guān)。研究已證明，CSF-cNs能調(diào)節(jié)控制運(yùn)動(dòng)和主動(dòng)姿勢(shì)的脊髓回路[36]。有學(xué)者在斑馬魚(yú)幼體中發(fā)現(xiàn)，Reissner纖維與腹側(cè)和背側(cè)CSF-cNs的纖毛和微絨毛緊密相連，兩者在功能上相互作用，以檢測(cè)脊椎動(dòng)物的脊柱彎曲[13,29]。此外，CSF-cNs也可作為光感受器發(fā)揮作用。下丘腦側(cè)葉腦室旁器官中的CSF-cNs對(duì)光敏感，可能參與鳥(niǎo)類(lèi)季節(jié)性繁殖的調(diào)節(jié)[37]。

4.3神經(jīng)干細(xì)胞功能 在低等脊椎動(dòng)物中，脊髓中央管周?chē)鷧^(qū)域是神經(jīng)發(fā)生的活躍部位，存在具有前體樣細(xì)胞和未成熟神經(jīng)元功能特性的細(xì)胞[38]。哺乳動(dòng)物中，CSF-cNs在形態(tài)上是接觸腦脊液最簡(jiǎn)單的神經(jīng)元類(lèi)型，其胞體位于室管膜或室管膜下，具有單個(gè)頂端投射的樹(shù)突樣突起[23]。新生小鼠中，它既可表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)志物也可表達(dá)未成熟神經(jīng)元標(biāo)志物[39-40]。因此，CSF-cNs在成熟哺乳動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中處于低分化狀態(tài)，具有不成熟神經(jīng)元特性，可能為內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源之一。基于以往關(guān)于CSF-cNs具有不成熟神經(jīng)元特性及室管膜區(qū)存在多分化潛能的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的研究，He等[41]利用霍亂毒素亞單位B-皂苷靶向毀損CSF-cNs后發(fā)現(xiàn)，其可加速內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，提示CSF-cNs對(duì)脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖過(guò)程有一定影響；同時(shí)他們?cè)隗w外培養(yǎng)CSF-cNs，利用其特異性標(biāo)志物PKD2L1標(biāo)記、鑒定CSF-cNs，發(fā)現(xiàn)PKD2L1+CSF-cNs不僅可在體外增殖，而且可以形成具有傳代能力的神經(jīng)球。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)，CSF-cNs可在體外表達(dá)巢蛋白及轉(zhuǎn)錄因子性別決定區(qū)Y框蛋白2等神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物；貼壁誘導(dǎo)分化后，可在體外表達(dá)神經(jīng)元核抗原、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、少突膠質(zhì)細(xì)胞抗體等神經(jīng)干細(xì)胞分化的標(biāo)志物，說(shuō)明CSF-cNs具有神經(jīng)干細(xì)胞特征，可能參與脊髓損傷后的內(nèi)源性修復(fù)。

4.4調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)和信息傳遞 研究顯示，激活CSF-cNs可以誘導(dǎo)斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)，表明CSF-cNs可以為脊髓運(yùn)動(dòng)中心模式發(fā)生器提供直接輸入[42]。研究發(fā)現(xiàn)，CSF-cNs和尾部初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元亞群之間存在直接聯(lián)系[43]，CSF-cNs對(duì)慢速和快速運(yùn)動(dòng)中樞模式發(fā)生器進(jìn)行門(mén)控和調(diào)節(jié)，從而控制運(yùn)動(dòng)事件的發(fā)生和持續(xù)時(shí)間。

Zhang等[44]通過(guò)電鏡觀察表明，中縫背核的CSF-cNs與腦實(shí)質(zhì)的非CSF-cNs之間存在突觸聯(lián)系，形成軸-樹(shù)突觸或樹(shù)-樹(shù)突觸，在信息傳遞中發(fā)揮重要作用。這些突觸既有興奮性也有抑制性突觸，其共同特點(diǎn)是突觸前成分均為非CSF-cNs的結(jié)構(gòu)，突觸后成分均為CSF-cNs的結(jié)構(gòu)。在七鰓鰻中，CSF-cNs向腹側(cè)神經(jīng)叢或腹外側(cè)緣發(fā)送神經(jīng)突，在那里它們顯示末梢結(jié)構(gòu)的神經(jīng)支配，這使得信息可以在內(nèi)部和外部腦脊液之間傳遞[28,45]。七鰓鰻的CSF-cNs似乎在腹側(cè)神經(jīng)叢中接觸到邊緣細(xì)胞的脊髓內(nèi)伸展感受器，這種感受器調(diào)節(jié)著運(yùn)動(dòng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[45]。這一研究表明，CSF-cNs可能通過(guò)影響邊緣細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)，從而影響運(yùn)動(dòng)相關(guān)的感覺(jué)反饋。

4.5參與疼痛信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 腦干被公認(rèn)為是整合下行調(diào)節(jié)系統(tǒng)的關(guān)鍵部位，下行調(diào)節(jié)系統(tǒng)抑制和促進(jìn)脊髓水平的疼痛。遠(yuǎn)位CSF-cNs簡(jiǎn)稱(chēng)觸液核，主要分布于導(dǎo)水管下部腹側(cè)灰質(zhì)和第四腦室底板上部腹側(cè)灰質(zhì)內(nèi)。研究表明，觸液核可能與疼痛信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)密切相關(guān)，在不同疼痛條件下，觸液核的c-Fos、5-羥色胺及受體、M8型瞬時(shí)受體電位通道和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶等10余種神經(jīng)活性物質(zhì)的表達(dá)可發(fā)生變化，但其具體機(jī)制尚不清楚[11]。Song等[6]將逆行示蹤劑霍亂毒素亞單位B注射入大鼠標(biāo)記觸液核，證明CSF-cNs在大腦與腦脊液的聯(lián)系中起關(guān)鍵作用，且觸液核接受來(lái)自下丘腦室旁核、視上核、A11多巴胺細(xì)胞的輸入并可能參與痛覺(jué)調(diào)制[46-49]。目前對(duì)于生物疼痛機(jī)制尚不清楚，觸液核作為聯(lián)系腦實(shí)質(zhì)及腦脊液的紐帶，在參與疼痛反應(yīng)中發(fā)揮級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)作用，其作用機(jī)制可能會(huì)為研究新型鎮(zhèn)痛藥提供新靶標(biāo)。

5 小 結(jié)

CSF-cNs作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，不僅參與腦脊液之間的物質(zhì)交換、信息傳遞，在感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)控制方面也扮演重要角色。它的雙重起源和形態(tài)學(xué)差異也預(yù)示著不同區(qū)域的CSF-cNs發(fā)揮其特定功能。以往研究表明，CSF-cNs是一群高度保守的神經(jīng)元群體[15]。PKD2L1離子通道的發(fā)現(xiàn)，加速了對(duì)CSF-cNs的研究，且體外懸浮培養(yǎng)的PKD2L1+CSF-cNs表現(xiàn)出良好的自我更新和多分化潛能，所以CSF-cNs是內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞組成之一。隨著人們對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞領(lǐng)域的深入研究，CSF-cNs的不成熟特性可能會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的內(nèi)源性修復(fù)做出巨大貢獻(xiàn)，如何有效調(diào)控CSF-cNs，使其快速增殖和分化幫助脊髓損傷后修復(fù)受損神經(jīng)，將是未來(lái)研究的方向。