朱厚榮, 鄭韶爵, 呂金慧, 徐然然, 羅麗娟, 董榮書

(1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院， 海南 ?？?570228； 2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所， 海南 ?？?571101)

磷(Phosphorus,P)是植物生長(zhǎng)所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，參與了光合作用、能量轉(zhuǎn)換、生物大分子合成等生理生化過程[1]?？扇苄詿o機(jī)磷(Pi)是植物可直接從土壤中吸收的主要磷源形式[2]。但是它很容易與土壤中的有機(jī)化合物、Al3+,Ca2+,Fe3+等金屬陽(yáng)離子相互作用形成不能被植物根系直接吸收的難溶性磷，導(dǎo)致土壤有效磷低，從而限制植物生長(zhǎng)發(fā)育[3]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通過施用過量磷肥以滿足農(nóng)作物對(duì)磷的需求，但是磷肥在當(dāng)季利用率低[4]。過量的磷肥會(huì)造成土壤退化、水體富營(yíng)養(yǎng)化等環(huán)境問題[5]。因此，研究植物適應(yīng)低磷脅迫機(jī)理并培育磷高效作物品種，對(duì)發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有重要意義。

為適應(yīng)低磷脅迫環(huán)境，植物在進(jìn)化過程中形成了一系列機(jī)制提高磷吸收和利用能力[6]。水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、紫花苜蓿(Medicagosativa)等植物通過調(diào)控根系形態(tài)，提高根系與土壤的接觸面積，從而增強(qiáng)根系獲取Pi的能力[7-9]。在低磷環(huán)境中，植物還通過調(diào)控有機(jī)酸、糖類、核苷酸等代謝物的積累提高對(duì)低磷脅迫的適應(yīng)能力。例如，水稻和大豆在低磷脅迫下根系會(huì)合成大量的有機(jī)酸，通過根系分泌的有機(jī)酸溶解難溶性磷，從而提高土壤磷的利用能力。而且水稻根系分泌的半乳糖醛酸不斷積累，降低了磷酸鹽對(duì)土壤膠體的吸附，增加土壤中Pi的有效性[10-11]。此外，在低磷脅迫下，玉米(Zeamays)、大麥(Hordeumvulgare)和柱花草(Stylosanthesguianensis)會(huì)增強(qiáng)對(duì)衰老組織含磷代謝物(如：核苷酸等)的再活化利用，從而提高對(duì)有效磷的吸收能力[12-14]。

假地豆(Desmodiumheterocarpon)為豆科山螞蝗屬多年生亞灌木狀草本，主要分布于我國(guó)南方各省區(qū)[15]。假地豆根系發(fā)達(dá)，對(duì)酸性缺磷土壤適應(yīng)性強(qiáng)，是我國(guó)熱帶與亞熱帶地區(qū)重要的豆科牧草和綠肥資源[16-17]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)假地豆的研究主要集中于生物學(xué)特性和藥用價(jià)值，然而對(duì)其耐缺磷脅迫的潛在機(jī)理卻鮮有報(bào)道。因此，本研究通過水培試驗(yàn)條件分析缺磷脅迫對(duì)假地豆生長(zhǎng)和代謝積累的影響，為解析假地豆耐缺磷脅迫機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。目的是(1)探索缺磷脅迫下，假地豆的生物量和全磷含量產(chǎn)生哪些變化；(2)明確假地豆的代謝衍生物適應(yīng)缺磷環(huán)境的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)所用假地豆(Desmodiumheterocarpon)種子(編號(hào)：151016001)由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。假地豆的水培試驗(yàn)方法如下：種子萌發(fā)后在1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)15 d。隨后，挑選長(zhǎng)勢(shì)均一的幼苗分別移至含250 μmol·L-1KH2PO4(+P處理)和0 μmol·L-1KH2PO4(-P處理)的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行正常供磷和缺磷處理。每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。分別在處理0 d，5 d，10 d和15 d時(shí)收取地上部和根部樣品，用于測(cè)定生物量、根系性狀、全磷含量。在15 d時(shí)收取所有葉片和根系鮮樣，用液氮速凍后，于-80℃保存用于代謝組學(xué)分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1干重和全磷含量測(cè)定 假地豆地上部和根部樣品分別于收獲后，置于烘箱中105℃殺青30 min，75℃烘干至恒重后稱其干重。樣品烘干粉碎后，稱取0.05 g樣品于灰化瓶中，加入適量濃硫酸和乙醇(5∶95，v/v)混合液浸濕樣品，于馬弗爐中600℃灰化10 h至無色，冷卻后，加入8 mL 100 mmol·L-1HCl充分溶解48 h，參照Murphy和Riley[18]的鉬銻抗顯色法，測(cè)定OD700的吸光度值，計(jì)算全磷含量。

1.2.2葉片及根系性狀分析 將假地豆整株展開，使用EPSON Expression 12 000 XL根系掃描儀掃描獲取葉片和根系圖像，再利用圖像分析軟件WINRHIZO(Regent Instruments Inc.，Canada)計(jì)算根系總根長(zhǎng)、根表面積和根體積[19]。

1.2.3代謝組學(xué)分析 廣泛靶向代謝組學(xué)分析委托深圳華大基因科技服務(wù)有限公司參照Chen等[20]的方法進(jìn)行。檢測(cè)代謝物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)為QTRAP 6500 plus(SCIEX,USA)。差異累積代謝物(Differential accumulation metabolites，DAMs)鑒定參考Thévenot等[21]的方法，根據(jù)OPLS-DA模型獲得的變量重要性投影(Variable importance in project，VIP)評(píng)分，將VIP ≥1.0，差異倍數(shù)(Fold change，F(xiàn)C) ≥2或≤0.5的代謝物定義為DAMs。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究相關(guān)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行整理和可視化作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示，利用SPSS軟件(V26.0，SPSS Institute，美國(guó))對(duì)同一天假地豆不同磷濃度處理(+P和-P)下的指標(biāo)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，分析其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 低磷脅迫對(duì)假地豆生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，從處理第5 d開始，-P條件下假地豆的地上部干重和磷含量顯著低于+P處理，而且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，兩個(gè)處理間的差異逐漸增大，在15 d時(shí)，-P處理的地上部干重和磷含量分別比+P處理降低39.7%和94.6%，差異極顯著(P<0.001)。第5 d時(shí)，根部干重在兩個(gè)處理間無顯著差異，但從第10 d開始，-P處理10 d和15 d的根部干重分別比+P處理顯著增加101.5%和61.0%(P<0.001)(圖1 D)。與地上部磷含量類似，-P處理5 d～15 d的根部磷含量均顯著低于+P處理(P<0.001)(圖1 E)。如圖2所示，與+P處理相比，-P處理對(duì)根系生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。-P處理5 d～15 d的總根長(zhǎng)、根表面積和根體積分別比+P處理顯著增加36.6%～160.5%，22.3%～147.3%和28.1%～118.6%(P<0.001)。

圖1 缺磷脅迫對(duì)假地豆干重和磷含量的影響Fig.1 Effects of P deficiency on dry weight and P content of D.heterocarpon注：(A)假地豆在兩個(gè)磷處理下的生長(zhǎng)表型；(B)地上部干重；(C)地上部磷含量；(D)根部干重；(E)根部磷含量。星號(hào)表示t-檢驗(yàn)-P與+P處理之間差異顯著，*:0.01≤P<0.05,**:0.001≤P<0.01,***:P<0.001，ns表示不顯著。下同Note:(A) Growth phenotypes of D.heterocarpon under two P treatments;(B) Shoot dry weight;(C) P contentin shoot;(D) Root dry weight;(E) P contentin root. The asterisks indicate significant differences between -P and +P according to Student’s t-test,*:0.01≤P<0.05,**:0.001≤P<0.01,***:P<0.001,ns means not significant. The same as below

圖2 缺磷脅迫對(duì)假地豆根系生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of P deficiency on root growth of D.heterocarpon注：(A)假地豆在兩個(gè)磷處理下的根系形態(tài)；(B)總根長(zhǎng)；(C)根表面積；(D)根體積Note:(A) Root morphology of D.heterocarpon under two P treatments;(B) Total root length;(C) Root surface area;(D) Root volume

2.2 假地豆響應(yīng)低磷脅迫的代謝組學(xué)分析

如圖3所示，基于LC-MS/MS的代謝組分析共檢測(cè)到假地豆代謝物267種，其中葉片DAMs共79個(gè)(上調(diào)42個(gè)，下調(diào)37個(gè))；根系DAMs共79個(gè)(上調(diào)48個(gè)，下調(diào)31個(gè))。

圖3 假地豆葉片(A)和根系(B)響應(yīng)缺磷脅迫的代謝組學(xué)分析Fig.3 Metabolomics response to P deficiency in leaves (A) and roots (B) of D.heterocarpon注：紅圈、綠圈和灰圈分別表示上調(diào)、下調(diào)和不顯著代謝產(chǎn)物Note:Red circles,green circles and gray circles indicate up-regulated,down-regulated,and non significant metabolites,respectively

這些DAMs可被分為類黃酮、萜類、有機(jī)酸、氨基酸及其衍生物、苯丙素類、生物堿、酚類、核苷酸及其衍生物、聚酮類、糖及醇類、甾體類和維生素及其衍生物共12類(圖4)。其中，在缺磷脅迫下，檢測(cè)到的生物堿、聚酮類和糖及醇類代謝物在假地豆葉片和根系均全部上調(diào)(圖4)。此外，檢測(cè)到的有機(jī)酸在根系全部上調(diào)(圖4)。

圖4 假地豆響應(yīng)缺磷脅迫的差異代謝物分類Fig.4 Classification of DAMs in response to P deficiency in D.heterocarpon注：L表示葉片的差異代謝物，R表示根系的差異代謝物。橙色和藍(lán)色分別表示上調(diào)和下調(diào)的代謝物。數(shù)字表示該類代謝物個(gè)數(shù)Note:L denotes the differential metabolites of leaves,R denotes the differential metabolites of roots. Orange and blue bars indicate up-regulated and down-regulated metabolites,respectively. The number in the bar indicates the number of metabolites in the class

2.3 低磷脅迫導(dǎo)致假地豆的生物堿、聚酮類和糖及醇類顯著積累

如圖5所示，缺磷處理導(dǎo)致假地豆葉片和根系的2種生物堿(蝙蝠葛蘇林堿和大麥芽堿)均顯著上調(diào)。此外，延胡索乙素、蟲草素、槐定堿、葫蘆巴堿這4種生物堿在根系中受低磷脅迫誘導(dǎo)也顯著增加(圖5)。在糖及醇類中，水蘇糖、麥芽糖醇、棉籽糖、葡萄糖醛酸內(nèi)酯4種代謝物在缺磷處理的根系中顯著上調(diào)，而葉片中只有L-亮氨醇受缺磷處理顯著上調(diào)(圖5)。對(duì)于聚酮類，缺磷處理使根系中大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷、羥基茜草素和升麻素苷的積累顯著提高，而-P處理的葉片中氧化白藜蘆醇和番瀉苷顯著上調(diào)(圖5)。

圖5 低磷脅迫對(duì)假地豆生物堿、聚酮類、糖及醇類積累的影響Fig.5 Effect of P deficiency on the accumulation of alkaloids,polyketides,sugars and alcohols in D.heterocarpon注：紅色和灰色分別表示差異代謝物顯著上調(diào)和不顯著。FC(-P/+P)表示代謝物在-P與+P處理下的差異倍數(shù)。下同Note:Red and grey indicate significantly up-regulated and insignificant differential metabolites,respectively. FC (-P/+P) indicates the ratio of relative levels of metabolites under -P to +P treatment. The same as below

2.4 低磷脅迫導(dǎo)致假地豆的原花青素、槲皮素及其衍生物顯著積累

如圖6所示，缺磷處理使假地豆葉片和根系的槲皮素及其2種衍生物(異槲皮苷和槲皮甙)均顯著上調(diào)。此外，葉片中二氫槲皮素和槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷在缺磷處理?xiàng)l件下積累顯著增加，而根系中槲皮萬(wàn)壽菊素7-O-葡萄糖苷受低磷條件誘導(dǎo)積累增加(圖6)。此外，葉片中的原花青素B1，B2和B3在缺磷條件下均顯著上調(diào)，而根系中只有原花青素B3受低磷條件誘導(dǎo)含量上升(圖6)。

圖6 低磷脅迫對(duì)假地豆原花青素、槲皮素及其衍生物積累的影響Fig.6 Effect of P deficiency on the accumulation of proanthocyanidins,quercetin and their derivatives in D.heterocarpon

2.5 低磷脅迫對(duì)假地豆有機(jī)酸、核苷酸及其衍生物的影響

如圖7所示，在缺磷處理下，假地豆葉片中馬來酰胺酸、芥子酸和5-氨基乙酰丙酸的積累顯著增加，而羥基酒石酸、單咖啡酰酒石酸和肉桂酸的積累顯著減少；假地豆根系中8種有機(jī)酸的含量受缺磷處理誘導(dǎo)顯著上調(diào)，包括馬來酰胺酸、異綠原酸C、苔色酸、京尼平苷酸、檸檬酸、奎寧酸、單咖啡酰酒石酸和肉桂酸。對(duì)于核苷酸及其衍生物，缺磷處理導(dǎo)致葉片和根系中2′-脫氧腺苷5′-單磷酸(dAMP)的積累均顯著降低，此外，葉片的肌苷、腺苷、胸苷和尿苷的積累也顯著減少(圖7)。

圖7 低磷脅迫對(duì)假地豆有機(jī)酸、核苷酸及其衍生物積累的影響Fig.7 Effect of P deficiency on the accumulation of organic acids,nucleotides and their derivatives in D.heterocarpon注：藍(lán)色表示差異代謝物顯著下調(diào)Note:Blue indicates significantly down-regulated differential metabolites

3 討論

磷元素參與植物體內(nèi)各種代謝過程，在很大程度上影響著植物生長(zhǎng)發(fā)育[22]。前人關(guān)于小麥(Triticumaestivum)、紫花苜蓿和硬皮豆(Macrotylomauniflorum)的研究均顯示，低磷脅迫下植株的生長(zhǎng)受到抑制，地上部的生物量和磷含量均顯著降低[23-25]。本試驗(yàn)與以上研究結(jié)果相似，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，缺磷處理抑制了假地豆地上部的生長(zhǎng)，從而顯著降低假地豆的地上部干重和磷含量(圖1)。有研究表明，玉米和菜豆(Phaseolusvulgaris)的磷吸收量與根表面積、根總長(zhǎng)度呈顯著正相關(guān)[26-27]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在低磷脅迫下假地豆根部的總根長(zhǎng)、根系表面積、根總體積均顯著增加(圖2)。這可能是由于植物通過改變根系形態(tài)提高了對(duì)土壤磷素的吸收能力，從而適應(yīng)缺磷環(huán)境[28]。低磷脅迫下，植物通過大量分配碳水化合物(如糖類和醇類)到根系中，促進(jìn)根系生長(zhǎng)，提高根冠比，從而增加根系與土壤的接觸面積，促進(jìn)磷的吸收[29]。本試驗(yàn)代謝組分析表明，缺磷脅迫導(dǎo)致假地豆根系的4種糖及醇類的積累顯著增加，這可能是缺磷脅迫下，假地豆通過分配更多的碳水化合物到根系中，促進(jìn)根系生長(zhǎng)。此外，假地豆還可以作為果樹間作的綠肥，在橡膠(Heveabrasiliensis)和龍眼(Dimocarpuslongan)林下種植假地豆，可以達(dá)到改良土壤的效果[30-31]。

在低磷脅迫下，植物根系會(huì)增加蘋果酸脫氫酶的表達(dá)量，調(diào)控多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等)，促進(jìn)有機(jī)酸合成與分泌，從而活化土壤難溶性磷，釋放出Pi供根系吸收[32-33]。比如柱花草(蘋果酸)[14]、紫花苜蓿(檸檬酸)[34]和菜豆(蘋果酸、檸檬酸)[35]等在低磷脅迫下根系合成和分泌的有機(jī)酸積累均有不同程度的增加。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺磷脅迫導(dǎo)致假地豆根系8個(gè)有機(jī)酸的含量顯著積累(圖7)，這可能有助于假地豆對(duì)難溶性磷的活化利用。類黃酮和原花青素具有增加抗氧化的能力。已有研究報(bào)道，低磷脅迫導(dǎo)致玉米[24]、茶(Camelliasinensis)[36]、大豆[37]等植物體內(nèi)的類黃酮和原花青素的積累顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)，缺磷脅迫導(dǎo)致假地豆葉片和根系分別有5種和4種槲皮素及其衍生物增加積累；此外，葉片和根系中的原花青素的含量在低磷脅迫下也有所增加。這些物質(zhì)的積累可能有利于假地豆抵抗由于缺磷脅迫誘發(fā)的氧化損傷，增加假地豆的抗氧化能力。

核苷酸及其衍生物是植物體內(nèi)主要的含磷代謝物類型之一。已有大量的研究表明，植物在低磷脅迫下會(huì)增加對(duì)核苷酸及其衍生物的再活化利用[38]。如，低磷脅迫導(dǎo)致擬南芥(Arabidopsisthaliana)[39]、大豆[40]、白羽扇豆(Lupinusalbus)[41]等植物體內(nèi)的核苷酸及其衍生物的含量顯著降低。這有可能是因?yàn)樵诘土酌{迫下，負(fù)責(zé)磷脂水解的磷脂酶C、磷脂酶D和磷脂酸磷酸酶等關(guān)鍵酶的表達(dá)量上調(diào)，導(dǎo)致磷脂降解而釋放Pi[42]。本研究中，假地豆葉片和根系的dAMP的含量在缺磷脅迫下顯著降低，很可能是由于假地豆為了緩解磷元素缺乏而對(duì)體內(nèi)的核苷酸及其衍生物進(jìn)行降解以釋放出Pi。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)假地豆的生長(zhǎng)受到缺磷脅迫的影響，包括生理和代謝的改變。在缺磷脅迫下，假地豆地上部干重和磷含量顯著降低，但根部的總根長(zhǎng)、根系表面積、根總體積均顯著增加。同時(shí)，假地豆通過改變根系形態(tài)，增加有機(jī)酸、糖類、槲皮素和原花青素的積累，增加對(duì)dAMP的再活化利用，從而適應(yīng)缺磷脅迫。研究結(jié)果為解析假地豆耐缺磷脅迫機(jī)制提供了一定的科學(xué)依據(jù)。