石林林，郝思妤，李佳怡，喻 瑩，史嘉銘，高社干,2

食管癌是消化道腫瘤中具有侵襲性和致命性的惡性腫瘤之一，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致癌癥患者死亡的第六大原因[1]。中國(guó)作為食管癌高發(fā)國(guó)家，約占全球每年新發(fā)病例的54.1%、死亡病例的56%,其中河南省是全球食管癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一[2-4]。目前，食管癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括手術(shù)、放化療以及靶向治療等多學(xué)科方法，但患者的總體預(yù)后仍不理想，5 a總生存率僅為30%～40%，嚴(yán)重危害人民健康[5]。因其病因及演進(jìn)機(jī)制不明，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)外至今在早期診療和精準(zhǔn)防治方面尚未取得關(guān)鍵性突破，成為困擾食管癌領(lǐng)域科學(xué)研究的難點(diǎn)問題。與此同時(shí)，食管癌目前缺乏有效的臨床前模型來(lái)研究其惡性演進(jìn)機(jī)制，以高效準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者的藥物敏感度，實(shí)現(xiàn)患者的個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療[6-7]。細(xì)胞培養(yǎng)從傳統(tǒng)液體培養(yǎng)到三維的轉(zhuǎn)變是模擬人體內(nèi)部微環(huán)境的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，三維模型比傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)環(huán)境能更好地重現(xiàn)體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境[8-10]。與傳統(tǒng)二維單層培養(yǎng)技術(shù)相比，腫瘤類器官技術(shù)實(shí)現(xiàn)了腫瘤生長(zhǎng)過程的可視化，提供了腫瘤干細(xì)胞克隆動(dòng)態(tài)和可塑性的研究方法，為尋找腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)提供了新的途徑[11-14]。

本研究將微纖維生物復(fù)合水凝膠和細(xì)胞自組裝相結(jié)合，構(gòu)建可負(fù)載食管癌類器官來(lái)源單細(xì)胞懸液的新型光固化生物復(fù)合水凝膠。通過對(duì)微流控芯片雙層同軸流體的精準(zhǔn)調(diào)控，制備含有水凝膠的中空食管仿生微纖維材料，將其作為食管癌類器官的3D生物載體?；隗w外3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在三維體系中構(gòu)建食管癌類器官模型，結(jié)合微流控技術(shù)，可較好地維持腫瘤異質(zhì)性，保留腫瘤局部復(fù)雜微環(huán)境的影響，為食管癌發(fā)病機(jī)制研究、患者藥物療效檢測(cè)提供技術(shù)保障，為食管癌患者個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療方案的制定奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料方法

1.1 甲基丙烯酸酐化明膠的制備依次將20 g明膠和10 g無(wú)水碳酸鈉在50 ℃充分溶解到200 mL超純水中，倒入裝有轉(zhuǎn)子的錐形瓶，在50 ℃熱水浴中攪拌直至完全溶解。將4 mL甲基丙烯酸酐緩慢滴加到錐形瓶中，滴加時(shí)間控制在2 min。將上述溶液在50 ℃熱水浴中持續(xù)攪拌1 h，其間每10 min用10%(w/v)的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9.0，滴加5次，約需要20 mL氫氧化鈉。將上述混合初品在50 ℃熱水浴下透析，每2 h換一次水，換水至少20次，將透析產(chǎn)物放在-20 ℃冰箱預(yù)凍2 h后再真空干燥5 d。

1.2 毛細(xì)管微流控裝置的搭建該部分使用的微流控裝置是由兩根玻璃毛細(xì)圓管和一根方管同軸排列在載玻片上構(gòu)建而成。玻璃毛細(xì)圓管的內(nèi)徑和外徑分別為600 μm和1 mm。其中一根玻璃毛細(xì)圓管首先由拉針儀拉細(xì)，然后經(jīng)燒針器將尖端直徑截至300 μm。該一端為300 μm的玻璃毛細(xì)圓管作為內(nèi)相注入管置于載玻片左側(cè)，另一根玻璃毛細(xì)圓管被截至45 mm長(zhǎng)作為出口置于載玻片右側(cè)。兩根圓管同軸插入方管并用環(huán)氧樹脂膠固定約6 h，即完成微流控裝置的搭建。為使內(nèi)外相形成穩(wěn)定的層流，內(nèi)外相的流速設(shè)置為0.4 mL·h-1和2 mL·h-1。

1.3 食管鱗癌類器官的構(gòu)建將類器官完全培養(yǎng)液(RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基+100 ng·mL-1Noggin+200 ng·mL-1R-spondin-1+10 μg·mL-1Gentamicin+50 ng·mL-1EGF)在冰上進(jìn)行預(yù)冷，調(diào)整食管鱗癌細(xì)胞濃度至1×105·mL-1。然后將Matrigel與細(xì)胞懸液以1∶9體積充分混合后置于冰上，每孔300 μL滴入提前預(yù)冷好的24孔培養(yǎng)板。種板后將培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱60 min。當(dāng)Matrigel充分固化之后，沿培養(yǎng)板壁緩慢加入1 mL食管鱗癌類器官完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，CO2濃度5%，37 ℃靜置培養(yǎng)，每隔5 d更換一次培養(yǎng)液，于顯微鏡下觀察。

1.4 食管癌仿生類器官芯片的制備內(nèi)相含有100 μL食管癌類器官消化得到的單細(xì)胞懸液(5×106個(gè)·mL-1)和10% PVA+0.1% CaCl2溶液作為逃逸材料，外相含NaAlg(2%)、GelMa(10%)和HMPP(1%)。所有溶液通過注射泵泵入微流控裝置，并在0.1%的CaCl2溶液中進(jìn)行收集。當(dāng)流體由出口流出時(shí)，在紫外線照射(365 nm、100 W)條件下，纖維進(jìn)一步光交聯(lián)5 min，接著轉(zhuǎn)移入2% CaCl2加固2 min，最后用PBS洗兩遍，加入培養(yǎng)基，再在纖維表面滴加200 μL血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC懸液(5×106個(gè)·mL-1)，用培養(yǎng)基將固化后的負(fù)載細(xì)胞微纖維清洗兩遍，然后轉(zhuǎn)移至盛有完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。全程在無(wú)菌環(huán)境下操作，Alg-GelMa、CaCl2水溶液均經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾頭過濾除菌。

1.5 食管癌仿生中空纖維的形貌及功能表征將制得的食管癌仿生生物復(fù)合水凝膠單層中空載細(xì)胞微纖維用去離子水清洗一遍，然后浸泡在去離子水中用液氮快速冷凍，最后經(jīng)冷凍干燥完成制樣。用導(dǎo)電膠將其固定在載物臺(tái)上，將樣品放入真空離子濺射儀，經(jīng)噴金處理15 min后，放入掃描電子顯微鏡內(nèi)固定，選取適當(dāng)?shù)姆糯蟊稊?shù)，挑選合適的視野觀察樣品表面及截面形貌并拍攝。通過細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定單層中空纖維中食管癌細(xì)胞及常規(guī)液體培養(yǎng)環(huán)境中食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 單層中空食管仿生復(fù)合水凝膠纖維的制備及表征本研究通過搭建的微流控裝置，首先制備了食管仿生中空結(jié)構(gòu)的微纖維，同時(shí)負(fù)載所構(gòu)建的食管鱗癌類器官來(lái)源的細(xì)胞。如圖1所示，初步成功制備了具有光滑內(nèi)壁結(jié)構(gòu)的Alg-GelMa復(fù)合水凝膠單層中空微纖維，其管徑大小可以通過內(nèi)外相流速加以控制。在掃描電子顯微鏡下觀察，如圖1A所示，上述中空微纖維截面的圓形空洞清晰可見，高倍鏡下還可以清楚地觀察到中空微纖維具有較厚的管壁，管壁呈多孔結(jié)構(gòu)。將收集到的單層中空纖維在紫外光照條件下進(jìn)行滅菌處理，并用培養(yǎng)基清洗后移至盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔板內(nèi)，將食管癌類器官來(lái)源的3D腫瘤細(xì)胞球消化處理制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞進(jìn)行綠色熒光標(biāo)記(Dio)之后接種于中空纖維中，食管癌細(xì)胞可以在纖維狀復(fù)合水凝膠中黏附生長(zhǎng)(圖1B)。

A：?jiǎn)螌又锌辗律鷱?fù)合水凝膠纖維掃描電鏡圖(從左到右電鏡圖片倍數(shù)逐級(jí)放大)；

2.2 單層中空仿生復(fù)合水凝膠纖維的細(xì)胞負(fù)載和活性功能研究本研究初步構(gòu)建的負(fù)載食管癌類器官來(lái)源腫瘤細(xì)胞的單層中空仿生復(fù)合水凝膠纖維如圖2A中所示。將腫瘤細(xì)胞進(jìn)行綠色熒光標(biāo)記，血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行紅色熒光標(biāo)記，將制備得到的食管癌類器官模型進(jìn)行熒光染色共定位分析，結(jié)果如圖2B中所示。本研究制備的食管癌仿生類器官模型，其橫截面呈現(xiàn)單層中空結(jié)構(gòu)，內(nèi)層為食管癌細(xì)胞，外層為血管內(nèi)皮細(xì)胞，較好地還原了患者的組織病理結(jié)構(gòu)，且腫瘤細(xì)胞在3D模型中的生長(zhǎng)情況與常規(guī)液體培養(yǎng)條件下差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，支持所構(gòu)建的模型具有良好的生物相容性。

A：食管癌仿生類器官芯片3D建模示意圖(左：平視圖；右：縱切面示意圖)；

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多基因改變、多階段演進(jìn)積累的復(fù)雜病理過程，建立不同階段的腫瘤模型是解析其發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的關(guān)鍵[15]。傳統(tǒng)液體培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，易于體外擴(kuò)增，但在培養(yǎng)過程中常丟失腫瘤異質(zhì)性且無(wú)法重現(xiàn)體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境，而動(dòng)物模型由于移植成功率低、種屬差異明顯、培養(yǎng)周期長(zhǎng)以及成本高，難以大規(guī)模用于個(gè)體化的藥物篩選[16]。腫瘤類器官的出現(xiàn)很好地解決了上述問題，其高度概括了來(lái)源腫瘤組織的特征，較好地保留了原位腫瘤組織的生物學(xué)特征和個(gè)體之間的異質(zhì)性，培養(yǎng)周期較短，且經(jīng)多次傳代后依然能保持基因組穩(wěn)定性，因而具有較高的轉(zhuǎn)化應(yīng)用價(jià)值[17]。類器官能夠在一定程度上還原特定的細(xì)胞類型組成和真實(shí)器官的三維結(jié)構(gòu)及功能，其作為研究干細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控、器官發(fā)生、疾病模型的前沿技術(shù)，已被作為關(guān)鍵性共性技術(shù)之一納入科技部“十四五”首批重點(diǎn)專項(xiàng)[18]。

本研究首次制備了一種簡(jiǎn)便的雙層微流控系統(tǒng)，包括兩種可更換的流體和一個(gè)由玻璃毛細(xì)管同軸組裝而成的微流體裝置。通過該系統(tǒng)，使用生物相容性良好的復(fù)合水凝膠制備了具有單層中空結(jié)構(gòu)的食管仿生微纖維。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了食管癌類器官來(lái)源的3D仿生類器官芯片，后續(xù)可將其應(yīng)用于研究食管癌的發(fā)生和發(fā)展過程、病原微生物誘發(fā)食管癌惡性演進(jìn)的分子機(jī)制以及高通量的藥物療效篩選等，具有廣闊的應(yīng)用前景。