顏彩繽，胡福初，趙 亞，王祥和，陳 哲，張世青，吳鳳芝，范鴻雁*

（1．海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院，海南 三亞 572000；2．海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶果樹(shù)研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海口熱帶果樹(shù)科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，海南省熱帶果樹(shù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南省熱帶果樹(shù)育種工程技術(shù)研究中心，海南 ?？?571100）

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）屬無(wú)患子科、荔枝屬，原產(chǎn)于中國(guó)，其栽培歷史悠久，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、對(duì)人類健康有益的南亞熱帶水果[1-2］?！有Α笾κ呛Ｄ戏N植范圍較廣的早熟荔枝品種[3］，但該品種成花時(shí)花量大，消耗土壤養(yǎng)分過(guò)多，保果難度大，土壤缺鈣缺水時(shí)嚴(yán)重影響花葉正常生長(zhǎng)[4］。平托花生（Arachis pintoi cv. Amarillo）又稱野花生，是一種熱帶亞熱帶豆科牧草，為多年生匍匐性蔓生草本植物。本試驗(yàn)采用的‘熱研12號(hào)’平托花生是1991年中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶牧草研究中心從哥倫比亞國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)研究中心（CIAT）引進(jìn)篩選的具有耐酸、耐瘠、耐旱、耐蔭、適應(yīng)性強(qiáng)、覆蓋性強(qiáng)、無(wú)需人工除草、減少除草劑使用量等特點(diǎn)的品種[5］。有研究表明，荔枝園間作平托花生不僅具有增加土壤肥力、提高保水性能、改善園內(nèi)小氣候和控制雜草生長(zhǎng)等作用，還能提高果品質(zhì)量，是生態(tài)果園優(yōu)良的套間種植物[6］。

果園間作在生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，易顯鳳等[7］在杧果、龍眼和荔枝園種植豆科牧草試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，種植豆科牧草不僅能抑制果園雜草生長(zhǎng)，還能提高土壤肥力以及促進(jìn)果樹(shù)健康生長(zhǎng)；顏彩繽等[8］研究得出檳榔園間作平托花生能提高不同土層中的土壤有機(jī)碳、全氮和全磷等理化因子以及土壤蔗糖酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶和蛋白酶的含量；劉芳等[9］得出劍麻園內(nèi)種植平托花生不僅能提高土壤保水性能，還能提高土壤養(yǎng)分，且套種時(shí)間越長(zhǎng)，效果越顯著；覃嬋嬋[10］研究發(fā)現(xiàn)，荔枝幼齡果園間作大豆和紅薯可以顯著改善土壤的物理性狀，提高養(yǎng)分利用效率以及顯著增加荔枝園土壤微生物多樣性。目前，關(guān)于荔枝園間作平托花生對(duì)土壤理化性質(zhì)、酶活性以及土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響還未見(jiàn)報(bào)道，其土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌的相關(guān)性尚未明確，本試驗(yàn)以荔枝間作平托花生和荔枝單作地區(qū)10～20 cm土層的土壤為研究對(duì)象，采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤細(xì)菌群落V4～V5區(qū)片段進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析，揭示荔枝間作平托花生和荔枝單作土壤理化性質(zhì)、酶活性和土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的變化，并分析土壤理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌的相關(guān)性，為篩選荔枝果園良好復(fù)合栽培模式提供科學(xué)的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)笾ζ贩N為‘妃子笑’，于1998年定植，種植規(guī)格為4 m×5 m；間作物平托花生品種為‘熱研12號(hào)’，于2015年定植于荔枝樹(shù)莖基部 1.5 m處。

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)區(qū)位于海南省澄邁縣永發(fā)果樹(shù)基地荔枝示范果園（109°45′～110°15′ E、19°23′～20°01′ N）。熱帶季風(fēng)氣候，四季如春，雨量充沛，日照充足，年平均氣溫為23.7℃，極端高溫為38℃，極端低溫為7℃。6月最熱，平均氣溫達(dá)35℃，2月最冷，平均氣溫達(dá)15℃。試驗(yàn)地土壤為紅壤土，全年日照時(shí)數(shù)為2060.6 h，年均降水量為1756 mm，全年無(wú)霜。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)2個(gè)處理，荔枝間作平托花生和荔枝單作，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，分別編號(hào)為L(zhǎng)P-1、LP-2、LP-3和CK-1、CK-2、CK-3。

1.3.2 土壤樣品采集

在平托花生營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期采集土壤樣品，每個(gè)重復(fù)采取5點(diǎn)取樣法選擇5株荔枝。2019年12月分別在荔枝間作平托花生和荔枝單作試驗(yàn)處理區(qū)，于荔枝根系和平托花生交界處（大約距離荔枝樹(shù)莖基部1.5 m處）東、西、南、北4個(gè)方向，拔開(kāi)平托花生莖蔓后挖取10～20 cm土層根際土壤，混勻后分別裝入無(wú)菌瓶與密封袋中。無(wú)菌瓶放入裝有冰袋的保溫箱，密封袋常溫放置，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。在超凈工作臺(tái)上將無(wú)菌瓶?jī)?nèi)土壤樣品的雜根去除，分裝于50 mL滅菌離心管中，-20℃下保存，用于高通量測(cè)序；密封袋土樣過(guò)1 mm篩，常溫下保存，用于土壤理化因子和土壤酶活性分析。

1.3.3 土壤理化因子測(cè)定

采用水合熱重鉻酸鉀氧化法測(cè)定土壤有機(jī)碳；采用半微量凱氏定氮法測(cè)定全氮；采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定堿解氮；采用王水酸溶鉬銻抗比色法測(cè)定全磷；采用雙酸浸提鉬銻抗比色法測(cè)定酸性有效磷；采用堿熔-火焰光度法測(cè)定全鉀；采用醋酸銨浸提-火焰光度法測(cè)定速效鉀；采用鋁盒烘干法測(cè)定干濕比；采用酸度計(jì)測(cè)定土壤pH。測(cè)定方法參考魯如坤[11］的方法。

1.3.4 土壤酶活性測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定蔗糖酶；采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測(cè)定脲酶；采用分光光度法測(cè)定過(guò)氧化氫酶；采用鄰苯三酚比色法測(cè)定多酚氧化酶；采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑比色法測(cè)定脫氫酶；采用酪蛋白水解法測(cè)定蛋白酶。測(cè)定方法參考關(guān)松蔭等[12］和周禮愷[13］的方法。

1.3.5 土壤總DNA的提取

使用FastDNA? SPIN Kit for Soil試劑盒提取樣本土壤微生物基因組的DNA，干冰運(yùn)輸，由上海天昊生物科技有限公司采用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)土壤細(xì)菌進(jìn)行16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序（V4～V5）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，獲得更為精準(zhǔn)、高質(zhì)量、可用于分析的序列；應(yīng)用Usearch、QIIME，根據(jù)序列97%的相似度，將序列歸并后劃分為多個(gè)OTUs。利用Mothur、R計(jì)算Chao1和ACE豐富度指數(shù)以及Simpson和Shannon多樣性指數(shù)，并進(jìn)行Alpha多樣性分析；同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌群落分布、聚類分析和細(xì)菌功能預(yù)測(cè)分析。采用SPSS 20.0獨(dú)立t檢驗(yàn)分析土壤理化因子和土壤酶活性差異性，利用Canoco 5構(gòu)建細(xì)菌菌屬與土壤理化因子的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 間作對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

由表1可知，荔枝園間作平托花生后，土壤的特定理化因子具有顯著性差異。間作平托花生后速效鉀含量極顯著增加138.9%；堿解氮含量顯著減少19.6%；全氮、全鉀和干濕比均提高，全磷、酸性有效磷以及pH稍降低，但均無(wú)顯著性差異。

表1 土壤理化性質(zhì)

2.2 間作對(duì)土壤酶活性的影響

由表2可知，間作模式較單作模式的土壤酶活性均有所提高，其中蔗糖酶和酸性蛋白酶分 別極顯著增加154.4%和76.5%；脲酶、過(guò)氧化氫酶和多酚氧化酶分別顯著增加15.0%、16.9%和32.6%；中性、堿性蛋白酶稍有增加但均無(wú)顯著差 異性。

表2 土壤酶活性

2.3 間作對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響

2.3.1 間作后土壤細(xì)菌群落多樣性分析

為明確荔枝園間作平托花生能否提高土壤細(xì)菌豐富度和多樣性，對(duì)兩種種植模式的土壤細(xì)菌群落進(jìn)行Alpha多樣性分析，其中荔枝間作模式較單作模式的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)分別顯著提高5.5%、5.2%，間作后細(xì)菌豐富度明顯提高；Simpson指數(shù)顯著提高3.7%；而間作的物種數(shù)目和Shannon指數(shù)與單作相比無(wú)明顯差異（表3）。

表3 不同樣品的α多樣性指數(shù)

2.3.2 間作后土壤細(xì)菌群落組成分析

2.3.2.1 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門(mén)水平的分析 從圖1可知，荔枝在兩種種植模式下土壤細(xì)菌群落平均相對(duì)豐度＞1%的門(mén)類群共有12個(gè)，其中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為酸桿菌門(mén)（Acidobacteria 28.38%～ 22.78%）、變形菌門(mén)（Proteobacteria 20.63%～ 27.26%）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi 8.81%～12.23%）和放線菌門(mén)（Actinobacteria 8.33%～11.21%）。箱體圖（圖2）顯示間作模式和單作模式下具有顯著差異性的菌門(mén)，間作平托花生后變形菌門(mén)和放線菌門(mén)的相對(duì)豐度分別極其顯著和顯著提高，酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度極顯著降低。

圖1 土壤門(mén)水平上的細(xì)菌群落組成

圖2 土壤細(xì)菌門(mén)水平箱形圖

2.3.2.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平的分析 由圖3顯示的供試細(xì)菌菌群平均相對(duì)豐度＞1%的屬類群共有16個(gè)，其中單作模式12個(gè)，間作模式為14個(gè)；兩種模式相同優(yōu)勢(shì)菌屬為Gp1（8.5%～4.72%）、Gp2（5.03%～1.95%）、Gp3（1.64%～1.36%）、Gp4（1.44%～2.33%）、Gp6（3.98%～5.82%）、芽孢桿菌屬（Bacillus 2.16%～1.58%）、Gaiella（2.12%～3.17%）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas 1.87%～2.2%）、亞硝化球菌屬（Nitrososphaera 1.3%～2.78%）和硝化螺菌屬（Nitrospira 1.22%～1.22%），而Gp7僅存在于單作模式，紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）、黃桿菌屬（Flavobacterium）和Gp5僅存在于間作模式；此外，間作模式下Gp6菌屬相對(duì)豐度最高，但單作模式下Gp1菌屬相對(duì)豐度最高。對(duì)測(cè)定菌屬進(jìn)行顯著差異分析，由箱體圖（圖4）可知，間作后紅游動(dòng)菌屬、Gaiella和黃桿菌屬的相對(duì)豐度極顯著或顯著提高，但芽孢桿菌屬、Gp2和Candidatus_Koribacter相對(duì)豐度顯著降低。

圖3 土壤屬水平上的細(xì)菌群落組成

圖4 土壤細(xì)菌屬水平箱形圖

2.4 土壤細(xì)菌與理化因子的相關(guān)性分析

在屬分類水平上，對(duì)土壤總細(xì)菌中相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌進(jìn)行冗余分析，以探究特定細(xì)菌與土壤理化因子的關(guān)系。排序軸1對(duì)土壤總細(xì)菌變異程度的解釋度為71.64%，排序軸2解釋了15.15%的變異，對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的解釋度總共高達(dá)86.79%（表4）。由條件效應(yīng)可知，堿解氮解釋的變異程度最高，為55.7%，pH、全磷和酸性有效磷解釋度分別為18.0%、13.7%和10.3%（表5）。由圖5可見(jiàn)，Gp1、Gp2、Gp3及Gp7與pH呈正相關(guān)；Gp4、Gp5、Gp6與pH呈負(fù)相關(guān)；芽孢桿菌屬與堿解氮呈正相關(guān)；Gaiella、紅游動(dòng)菌屬和黃桿菌屬均與堿解氮、pH、全磷及酸性有效磷呈負(fù)相關(guān)；芽單胞菌屬與有效磷、全磷呈負(fù)相關(guān)；亞硝化球菌屬與堿解氮、pH呈負(fù)相關(guān)；硝化螺菌屬與pH呈負(fù)相關(guān)，但與酸性有效磷、全磷呈正相關(guān)。單作模式（CK）的土壤樣品主要分布在第3象限，其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異主要是由pH的變化引起；間作模式（LP）的土壤樣品分布第1和第4象限，其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主要受堿解氮的影響。

圖5 屬水平土壤主要細(xì)菌類群與土壤理化因子的關(guān)系

表4 土壤因子與土壤細(xì)菌屬水平RDA分析結(jié)果

表5 主要土壤因子RDA結(jié)果

3 討論

3.1 間作對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

土壤鉀素對(duì)增加產(chǎn)量、提高果實(shí)品質(zhì)和保持土壤肥力起到重要作用[14］，間作平托花生后速效鉀含量極顯著增加，這是由于受到平托花生根系的影響，非根區(qū)土壤速效鉀向根區(qū)轉(zhuǎn)移，而且距離根區(qū)越近，鉀素移動(dòng)量越大[15］。作物生長(zhǎng)期間，氮素施用容易導(dǎo)致豆科植物產(chǎn)生“氮阻遏”現(xiàn)象，也就是結(jié)瘤數(shù)量和生物固氮量下降[16］，荔枝與平托花生間作后堿解氮含量顯著減少，原因可能是荔枝樹(shù)能大量吸收土壤硝酸鹽，并減少礦質(zhì)氮含量，對(duì)豆 科作物“氮阻遏”起減緩作用，間作群體通過(guò)直接或者間接的“氮轉(zhuǎn)移”促進(jìn)土壤氮素的高效利用[17］，因此，間作平托花生后堿解氮含量顯著減少與間作平托花生具有的固氮作用密切相關(guān)。

3.2 間作對(duì)土壤酶活性的影響

土壤酶是土壤中產(chǎn)生的能夠參與轉(zhuǎn)化土壤有機(jī)化合物和分解動(dòng)植物殘?bào)w過(guò)程的生物催化劑，可作為土壤肥力的重要指標(biāo)之一[18］。其中，蔗糖酶參與土壤有機(jī)質(zhì)降解，酸性蛋白酶加速土壤的氮素循環(huán)，脲酶參與氮元素轉(zhuǎn)化過(guò)程，過(guò)氧化氫酶可分解有害物質(zhì)，還有多酚氧化酶參與土壤芳香族化合物循環(huán)[19-21］。本試驗(yàn)中荔枝園間作平托花生后土壤蔗糖酶、酸性蛋白酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶及多酚氧化酶活性均顯著提高，尤其是蔗糖酶和酸性蛋白酶 的活性提高幅度較大，可能是由于平托花生根系的穿插作用影響土壤的孔隙度和通氣狀況，其根系分泌物質(zhì)改變土壤微生物環(huán)境從而提高土壤酶活性[8］。

3.3 間作對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

果園生草栽培可以有效控制雜草的生長(zhǎng)從而減少或避免使用化學(xué)除草劑，同時(shí)草的凋落物以及根系分泌物為果園土壤微生物提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，最終對(duì)土壤微生物優(yōu)勢(shì)種群和數(shù)量的變化產(chǎn)生影響[22-23］。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映土壤細(xì)菌群落豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)體現(xiàn)群落均勻度，與群落多樣性呈正相關(guān)[24］。本試驗(yàn)中Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)以及Simpson指數(shù)均顯著提高，說(shuō)明荔枝園間作平托花生有效提高了土壤細(xì)菌群落豐富度、多樣性和優(yōu)勢(shì)OTUs，在改善土壤生態(tài)環(huán)境和提高土壤微生物多樣性方面起著重要作用。

3.4 間作對(duì)土壤細(xì)菌群落組成的影響

各菌群相對(duì)豐度的不同反映了土壤環(huán)境的變化，變形菌門(mén)多存在于營(yíng)養(yǎng)較高的土壤環(huán)境，屬于富營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌，酸桿菌門(mén)多存在于營(yíng)養(yǎng)貧瘠的土壤環(huán)境，屬于寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌[25］，放線菌作為植物根際土壤的一種重要微生物，有著促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、防治病害的作用[26-27］。本研究中荔枝間作模式下變形菌門(mén)、放線菌門(mén)的相對(duì)豐度均顯著提高，酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度顯著降低。酸桿菌是廣泛分布在土壤中的嗜酸菌，其相對(duì)豐度體現(xiàn)土壤酸性條件[28］，有研究表明酸桿菌與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)[29-30］，也有研究表明土壤酸桿菌的相對(duì)豐度與土壤pH呈顯著正相關(guān)關(guān)系[31-32］。間作平托花生后酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度顯著降低，但土壤pH無(wú)顯著差異性，這與Liu等[33］的研究結(jié)果一致。導(dǎo)致這些差異情況產(chǎn)生的原因可能是不同亞群或同一亞群中的酸桿菌對(duì)土壤pH具有不同的響應(yīng)作用[34］。

3.5 土壤細(xì)菌與理化因子的相關(guān)性分析

冗余分析表明，酸桿菌門(mén)亞群Gp1～Gp7與pH均存在相關(guān)性，Gp1、Gp2、Gp3及Gp7與pH呈正相關(guān)，Gp4、Gp5、Gp6與pH呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明酸桿菌門(mén)不同亞群對(duì)土壤pH均有不同的調(diào)節(jié)作用；與土壤pH相關(guān)的菌屬還有Gaiella、紅游動(dòng)菌屬、黃桿菌屬、亞硝化球菌屬和硝化螺菌屬。間作平托花生后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異從主要受土壤pH影響轉(zhuǎn)變成主要受堿解氮含量影響，這與林洪鑫等[35］發(fā)現(xiàn)pH是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要理化因子，但施用氮肥和間作花生均能顯著影響土壤細(xì)菌屬水平群落組成的研究結(jié)果基本一致。本研究中絕大多數(shù)的菌屬與土壤理化因子均呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)是由于土壤細(xì)菌能夠分解和利用土壤養(yǎng)分從而為自身或植物提供能量[36］。

4 結(jié)論

荔枝園間作平托花生提高了土壤供鉀能力，但降低了供氮能力，pH穩(wěn)定，說(shuō)明長(zhǎng)期間作平托花生可適當(dāng)施用氮肥。間作平托花生后土壤蔗糖酶、酸性蛋白酶和脲酶等酶活性的提高能夠改善土壤肥力，影響土壤營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)和轉(zhuǎn)化過(guò)程；同時(shí)土壤細(xì)菌豐富度、多樣性的有效提高以及土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，為荔枝栽培提供良好的環(huán)境條件，有效促進(jìn)植株的健康生長(zhǎng)。