張 婧

（北京市朝陽區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，北京 100125）

葉綠素是植物光合作用中的重要光合色素。通過測定浮游植物葉綠素，可掌握水體的初級生產(chǎn)力情況。在環(huán)境監(jiān)測中，可將葉綠素a 含量作為湖泊富營養(yǎng)化的指標之一[1]。近30年來，由于我國水環(huán)境的惡化，特別是水體富營養(yǎng)化問題，使得浮游植物葉綠素a 的測定被廣泛地應(yīng)用[2]。

目前本實驗室測定葉綠素a 的方法為環(huán)境保護部發(fā)布的HJ 897—2017《水質(zhì) 葉綠素a 的測定 分光光度法》[3]。該法使用90%丙酮作為提取試劑，丙酮試劑對人體危害較大且易揮發(fā)，在人工研磨過程中存在少量飛濺現(xiàn)象，對實驗人員健康影響存在隱患，在反復(fù)研磨過程中葉綠素a 容易發(fā)生光降解[4-6]直接影響葉綠素a的測定結(jié)果；另一方面，不同材質(zhì)濾膜的提取效率對葉綠素a 測定結(jié)果有直接影響。因此，本文通過手工研磨與儀器研磨方式、乙酸纖維濾膜與玻璃纖維濾膜進行了對比，經(jīng)檢驗本文改進方法的實驗結(jié)果符合標準要求，在一定程度上提高了葉綠素a 的檢出效率。

1 方法與材料

1.1 方法標準及原理

目前測定地表水中葉綠素a 含量的標準方法是環(huán)境保護部于2017年12月21日發(fā)布的HJ 897—2017《水質(zhì) 葉綠素a 的測定 分光光度法》[3]。標準方法原理是將一定量樣品用濾膜過濾截留藻類，研磨破碎藻類細胞，再用丙酮溶液提取水中浮游植物的葉綠素，離心分離后分別于750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 波長處測定提取液吸光度值，根據(jù)公式計算水中葉綠素a的濃度。

1.2 材料與試劑

分析時均使用符合國家標準的分析純試劑，實驗用水為新制備的超純水，使用試劑及溶劑情況登記表見表1。

表1 使用試劑及溶劑情況登記表

材料及試劑配制如下。

（1）丙酮溶液：9+1

在900 mL 丙酮中加入100 mL 實驗用水。

（2）碳酸鎂懸濁液

稱取1.0 g 碳酸鎂加入100 mL 實驗用水，攪拌成懸濁液（使用前充分搖勻）。

（3）玻璃纖維濾膜：孔徑0.45～0.7 μm。

（4）乙酸纖維濾膜：孔徑為0.45 μm。

1.3 儀器和設(shè)備

實驗室現(xiàn)有儀器設(shè)備：紫外可見分光光度計（配10 mm 石英比色皿）、離心機（相對離心力1000×g，轉(zhuǎn)速3 000 ～4 000 r/min）、組織研磨器、玻璃研磨器、配真空泵不銹鋼溶液過濾器、0.45 μm 有機相針式過濾器等均符合方法要求，且儀器已檢定/校準合格，并在有效期內(nèi)，儀器使用情況見表2。

表2 使用儀器情況登記表

2 樣品采集與保存

為保證研究方法所得實驗結(jié)果的可靠性與全面性，根據(jù)本轄區(qū)（朝陽區(qū)）近幾年水質(zhì)監(jiān)測數(shù)據(jù)，特選取葉綠素a 濃度處于中營養(yǎng)、輕富營養(yǎng)、中富營養(yǎng)不同特征的紅領(lǐng)巾湖、朝陽公園湖、鎮(zhèn)海寺公園湖3個地表水點位進行方法研究與對比。依據(jù)文獻[3]進行保存與運輸。

3 實驗方法分析步驟

3.1 樣品過濾

在過濾裝置上裝好濾膜，根據(jù)水體營養(yǎng)化狀態(tài)確定取樣體積。雖然都屬于中營養(yǎng)化水平，但紅領(lǐng)巾湖程度偏輕，用量筒量取200 mL 的混勻樣品，朝陽公園湖和鎮(zhèn)海寺公園湖程度偏重，分別量取100 mL 的混勻樣品進行過濾，最后用少量蒸餾水沖洗濾器壁。過濾時負壓不超過50 kPa，在樣品剛剛完全通過濾膜時結(jié)束抽濾，用鑷子將濾膜取出，將有樣品的一面對折，用濾紙吸干濾膜水分。

3.2 研磨

玻璃研磨器：手工研磨將樣品濾膜放置于研磨裝置中，加入3～4 ml 丙酮溶液，研磨至糊狀。補加3～4 mL丙酮溶液，繼續(xù)研磨，并重復(fù)1～2 次，保證充分研磨5 min 以上。將完全破碎后的細胞提取液轉(zhuǎn)移至玻璃刻度離心管中，定容至10 mL。

組織研磨器：本文選用珠磨式研磨儀，通過劇烈晃動裝有待測濾膜、玻璃珠（直徑0.5 mm）和提取液的微離心管，使數(shù)百顆玻璃珠豎直運動的同時高速撞擊濾膜，研磨5 min 后將完全破碎后的細胞提取液轉(zhuǎn)移至玻璃刻度離心管中，定容至10 mL。

3.3 浸泡提取、離心、測定

依據(jù)文獻[3]進行浸泡提取、離心、測定。

3.4 計算

葉綠素a（μg/L）=［11.85×（D664－D750）－1.54×（D647－D750）－0.08×（D630－D750）］×V1/V2·δ，式中V1為提取定容后的體積（mL），V2為樣品體積（L），D 為吸光度值，δ 為比色皿光程（cm）。

4 測定葉綠素a 方法研究

4.1 濾膜的比對

4.1.1 空白試驗測試

為確定改進方法的濾膜類型，研究不同類型濾膜對水樣葉綠素a 測定結(jié)果的影響，文獻[1]采用的是乙酸纖維濾膜，文獻[3]采用的是玻璃纖維濾膜過濾水樣。

首先比較不同濾膜的吸光度。將空白水樣作為樣品，每組實驗設(shè)7個平行，抽濾體積為500 mL，與實際水樣按相同步驟操作，以丙酮溶液為參比，于波長750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 處測量吸光度。

結(jié)果表明乙酸纖維濾膜和玻璃纖維濾膜在750 nm 處吸光度小于0.005，見表3，兩種濾膜都符合開展監(jiān)測葉綠素a 濃度的條件。

表3 空白試驗測試結(jié)果

4.1.2 檢出限、測定下限的測試

由于空白試驗無法檢測到目標測試物，按照HJ 168—2020《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制訂技術(shù)導(dǎo)則》[7]的指導(dǎo)規(guī)范，選擇方法檢出限值3~5 倍的樣品（紅領(lǐng)巾湖）進行7 次平行測定，計算公式：MDL=t×S，其中S 為7 次重復(fù)樣品的標準偏差，t 是當自由度為n-1，置信度為99%時，單邊t 檢驗情況下的標準偏差，查表可得t=3.143，結(jié)果見表4。

表4 紅領(lǐng)巾湖方法檢出限、測定下限測試結(jié)果 單位:μg/L

玻璃纖維濾膜7 次平行測定計算得到檢出限為1.49 μg/L，測定下限為5.96 μg/L，乙酸纖維濾膜7 次平行測定計算得到檢出限為1.54 μg/L，測定下限為6.16 μg/L，兩種濾膜均低于標準HJ 897—2017[3]中規(guī)定檢出限2 μg/L、測定下限8 μg/L 的要求。但通過數(shù)據(jù)可以看出，玻璃纖維濾膜的測試結(jié)果更優(yōu)于乙酸纖維濾膜。

4.1.3 濾膜精密度測試

再研究玻璃纖維濾膜與乙酸纖維濾膜對實際水樣中葉綠素a 測定結(jié)果的影響，本文選取本轄區(qū)內(nèi)處于中營養(yǎng)、輕富營養(yǎng)、中富營養(yǎng)不同特征的紅領(lǐng)巾湖、朝陽公園湖、鎮(zhèn)海寺公園湖作為樣品，同時為減少實驗人為誤差，研磨方式統(tǒng)一選用本文3.2 中的珠磨式研磨儀。對比兩種濾膜在相同實驗條件下，不同濾膜對實驗結(jié)果的影響程度，結(jié)果見表5。

表5 濾膜精密度測試結(jié)果 單位：μg/L

測定實際水樣的過程中發(fā)現(xiàn)，玻璃纖維濾膜呈化學(xué)惰性，不含粘合劑，不發(fā)生溶解，玻璃纖維濾膜在研磨過程中較難研磨，需要的機械力比較大，但對于藻類細胞的破碎比較完全。乙酸纖維濾膜抽濾速度較慢，抽濾同一樣品的時間約是玻璃纖維濾膜的2～3 倍；同時，乙酸纖維濾膜部分溶于丙酮，遇丙酮融化成糊狀，不容易完全轉(zhuǎn)移，而且不容易判斷研磨是否充分。

4.1.4 方法比對t 檢驗

對于改進方法中玻璃纖維濾膜與原方法乙酸纖維濾膜進行統(tǒng)計學(xué)檢驗，對三種濃度的實際樣品進行7次平行測定，同時對每個濃度樣品使用改進方法與原方法均分別進行平行雙樣測定，平行雙樣測定的平均值分別記做改進方法的測定值（A）和原方法測定值（B）。通過t 檢驗對對比試驗結(jié)果進行評價，測試結(jié)果見表6，t 檢驗計算公式為

表6 方法比對t 檢驗結(jié)果表 單位：μg/L

經(jīng)過計算得出低、中、高三種不同濃度下t 值分別為1.641、1.889、1.110，給定α=0.05，查t 值表：t0.05（12）=2.179，三種濃度下的t 值均小于t0.05（12），所以兩種方法測定結(jié)果無顯著性差異，比對測試結(jié)果滿意。

4.2 研磨方式

4.2.1 研磨方式精密度測試

本文通過人工研磨與珠磨式研磨儀對比，測試不同研磨方式對實驗結(jié)果的影響程度，結(jié)果見表7。

表7 研磨方式精密度測試結(jié)果 單位：μg/L

通過實驗及數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，珠磨式研磨儀操作簡單，研磨過程中研磨管帶有螺紋研磨蓋，大幅度減少光照對葉綠素a 測定的影響，同時減少丙酮的揮發(fā)與飛濺；另一方面，研磨較為充分，樣品濾膜經(jīng)過浸泡離心后，比較容易沉入離心管底部，方便上清液的提取。

4.2.2 準確度測試

為進一步論證珠磨式研磨儀的準確度，特加入人員比對測試，參與比對測試人員均持有《水質(zhì) 葉綠素a 測定 分光光度法》的測定證書，采集三種不同濃度水樣，通過相同實驗條件對同一水樣進行測試，測試結(jié)果見表8。

表8 人員比對測試結(jié)果 單位：μg/L

比對結(jié)果表明三種濃度樣品不同人員測定的相對偏差分別為2.5%、1.8%、1.1%，符合平行樣的相對偏差值<20%的要求。

5 結(jié)論

5.1 濾膜比較優(yōu)勢

玻璃纖維濾膜較乙酸纖維濾膜的優(yōu)勢在于：

（1）玻璃纖維濾膜呈化學(xué)惰性，不含粘合劑，不發(fā)生溶解，對于藻類細胞的破碎比較完全，減少誤差；

（2）玻璃纖維濾膜表面截留的藻類含量高、研磨率高，對葉綠素的提取效率較好；

（3）測定結(jié)果表明玻璃纖維濾膜所測得葉綠素a的濃度值更準確。

5.2 研磨方式比較的優(yōu)勢

組織研磨較人工研磨的優(yōu)勢在于：

（1）珠磨式研磨儀操作簡單、節(jié)省時間，研磨過程中研磨管帶有螺紋研磨蓋，較大程度減少丙酮的揮發(fā)與飛濺及光照條件對葉綠素a 測定的影響；

（2）在測定葉綠素a 的研磨過程中需要加入90%丙酮作為提取試劑，運用珠磨式研磨儀減少對實驗人員與丙酮試劑的接觸，較大程度減少影響實驗人員健康存在的隱患；

（3）珠磨式研磨儀研磨較為充分，減少實驗人員判定誤差，同時，樣品濾膜經(jīng)過浸泡離心后，比較容易沉入離心管底部，方便上清液的提取。

5.3 改進方法滿足標準要求

由以上各項實驗數(shù)據(jù)的比較結(jié)果，可以得出結(jié)論：選擇玻璃纖維濾膜和組織研磨方式在空白實驗、檢出限、精密度和準確度方面都滿足HJ 897—2017《水質(zhì) 葉綠素a 的測定 分光光度法》的要求，可以選用改進方法。