石 娜，張楚穹，歐陽鋼

(1.臨沂市人民醫(yī)院，山東 臨沂 276003；2.南京中醫(yī)藥大學附屬淮安市中醫(yī)院，江蘇 淮安 223001； 3.江蘇省老年病醫(yī)院，江蘇 南京 210024)

絕經(jīng)后骨質疏松癥(Post-menopausal osteoporosis，PMOP)在絕經(jīng)后女性的發(fā)病率大約為25%～50%，多發(fā)生在55～70歲或絕經(jīng)后5～10年內，以60～65歲為發(fā)病高峰期[1]?；颊呖沙霈F(xiàn)全身乏力、骨痛等癥狀，且易發(fā)生骨折[2]，嚴重影響患者的生活質量。目前西醫(yī)治療本病的方法主要是應用激素替代療法，但這種治療方法不良反應多，且有致癌的風險[3]。穴位埋線對PMOP的防治有確切的療效，治療機制多集中于提高骨密度、提高雌激素水平及改善骨代謝生化指標等方面[4-6]，而對信號通路及分子層面的研究較少。代謝組學是一門定量測量生物樣品中所有代謝產(chǎn)物組成及其在內外刺激[7]下動態(tài)變化的科學，代謝產(chǎn)物水平的高低與機體發(fā)育、生理和病理狀態(tài)有關[8]。筆者擬使用代謝組學觀察與PMOP相關的代謝產(chǎn)物及代謝通路，并初步探討穴位埋線治療PMOP的靶代謝產(chǎn)物及代謝通路，為臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雌性3月齡SD大鼠32只，體質量180～200 g，未曾交配，購于浙江省實驗動物中心[SPF級，許可證號：SCXK(浙)：2014-0001]。在南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心(屏障環(huán)境)喂養(yǎng)，環(huán)境溫度21～25 ℃，濕度40%～60%，光照時間每日12 h，飼養(yǎng)期間大鼠自由攝食飲水。動物喂養(yǎng)及實驗方案通過南京中醫(yī)藥大學倫理審查(No.201812A023)。

1.2 造模與分組

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，將其隨機分為A空白組、B假手術組、C模型組及D埋線組，每組各8只。用3 %戊巴比妥鈉(按0.1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠后，局部去毛，取背側改良切口，切口位于最下肋下緣一橫指，腰椎旁開一個半橫指位置，二者交點為切口中心，縱行切開0.8～1 cm，于深部脂肪層中可發(fā)現(xiàn)粉紅色卵巢，在子宮角處結扎后切除卵巢。假手術組僅切除卵巢周圍少量脂肪組織，逐層縫合。為防止抗菌藥物對實驗結果的影響，術后不予注射或局部應用任何抗菌藥物。大鼠術后自由攝食、飲水。

1.3 干預方法

1.3.1 空白組、假手術組及模型組 正常喂養(yǎng)，不做任何處理。

1.3.2 埋線組 選取大鼠“腎俞”“后三里”進行埋線干預。按《實驗針灸學》[9]大鼠常用針灸穴位中的定位方法選取“腎俞”“后三里”?！澳I俞”：第2腰椎下兩旁；“后三里”：膝關節(jié)后外側，在腓骨頭下約5 mm處。用7號埋線針(高冠牌，生產(chǎn)許可證：蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許2001-0244號)，3/0的長約5 mm膠原蛋白線(龍騰生物公司，生產(chǎn)許可證：贛食藥監(jiān)械生產(chǎn)許可證：20160099)進行埋線。由助手幫忙固定住大鼠，并將穴位局部皮膚繃緊，術者右手持針，斜面端朝上，使針尖快速刺透皮膚，刺入到穴位肌肉層時放置膠原蛋白線，然后將埋線針退出，當針體退到皮下時快速出針并按壓針孔，保證線體置于穴位下的肌肉內，皮膚外面不能露出線頭。每次選取單側“腎俞”“后三里”埋線，雙側穴位交替，每周埋線1次，連續(xù)治療12周。

1.4 標本收集

收集標本前1天晚上8點開始禁食，不禁水。第2天使用3 %戊巴比妥鈉(按0.1 mL/100 g)將大鼠進行腹部麻醉后，置于無菌操作臺上，腹主動脈取血后離心血清，置于-20 ℃冰箱保存。戴一次性無菌手套，用無菌鑷子收集大鼠腸管糞便，-80 ℃低溫冰箱保存。大鼠放血致死后，剝離大鼠右側股骨及脛骨，徹底去除肌肉及肌腱等組織，用生理鹽水紗布包裹后放入EP管中，置于-20 ℃冰箱保存。

1.5 主要儀器和試劑

1.5.1 儀器 MEDIX90雙能X線骨密度檢測儀(法國奧斯托公司);雷勃爾離心機(北京雷勃爾離心機有限公司);Thermo QE質譜儀、Thermo Vanquish UHPLC液相色譜、Thermo Hyperil Gold column色譜柱、Thermo ST16R低溫離心機和RT-6000酶標儀(深圳雷杜公司)。

1.5.2 試劑 戊巴比妥鈉(德國默克公司,中國上海分裝);甲醇、甲酸等(美國Thermo公司);ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司)。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 骨密度的檢測 將大鼠離體股骨和脛骨自冰箱中取出，室溫下靜置30 min后，使用MEDIX90雙能X線骨密度檢測儀進行骨密度檢測，進行數(shù)據(jù)分析，得出骨密度值。

1.6.2 血液指標的檢測 使用酶聯(lián)免疫法測定雌激素含量。按照說明書設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL。分別設定空白孔和待測樣品孔，在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL。將樣品加于酶標板孔底部，不能觸及孔壁，輕輕晃勻，除空白孔外每孔加入酶標試劑100 μL，用封板膜封板后放至37 ℃溫育60 min；揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每個孔內加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次，最后拍干；每個孔內先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min；每個孔內加終止液50 μL，終止反應；在加終止液后15 min以內測定，以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

權頭真上火，不就結個婚嗎，怎么弄得跟電視劇似的，今天他想，明天她不想，還有完嗎：“你是現(xiàn)在不想，還是就想跟他吹了？”

1.6.3 代謝組學 (1)樣本處理：①取100 mg大鼠糞便經(jīng)液氮研磨后置于EP管中；②加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋震蕩；③冰浴下靜置5 min；④4 ℃ 15 000 rpm離心10 min；⑤取上清加質譜級水將甲醇含量稀釋至60 %；⑥稀釋后的溶液置于帶有0.22 μm濾膜的離心管中；⑦4 ℃ 15 000 rpm離心10 min；⑧收集濾液，進行LC-MS分析。從每個實驗樣本中取等體積樣本混合均勻作為QC樣本；Blank樣本為含有0.1%甲酸的60%甲醇溶液，處理過程與實驗樣本相同。(2)色譜條件：色譜柱：Hyperil gold column(C18)；柱溫：40 ℃，流速：0.2 mL/min。正模式：流動相A：0.1%甲酸；流動相B：甲醇。負模式：流動相A：5 mM醋酸銨，pH 9.0；流動相B：甲醇。(3)質譜條件：掃描范圍選擇m/z 70～1050；ESI源：Spray Voltage：3.2 kV；Sheath gas flow rate：35 arb；Aux Gas flow rate：10 arb；Capillary Temp：320 ℃。Polarity：positive；negative；MS/MS二級掃描為data-dependent scans。(4)代謝物的鑒定：①將下機數(shù)據(jù)文件導入CD搜庫軟件中，進行保留時間、質荷比等參數(shù)的簡單篩選；②對不同樣品根據(jù)保留時間偏差0.2 min和質量偏差5 ppm進行峰對齊；③設置信息：質量偏差5 ppm、信號強度偏差30 %、信噪比3和最小信號強度100 000；④進行峰提取，對峰面積進行定量，整合目標離子；⑤通過分子離子峰與碎片離子預測物質分子式；⑥與mzCloud和Chemspider數(shù)據(jù)庫進行對比，用Blank樣本去除背景離子；⑦歸化定量結果。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組骨密度、雌激素比較

表1中可見，經(jīng)干預12周后，模型組大鼠股骨、脛骨骨密度較空白組及假手術組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，埋線組與模型組比較，骨密度出現(xiàn)一定水平的升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組血清雌激素水平與空白組及假手術組比較明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；埋線組與模型組對比雌激素水平出現(xiàn)一定水平的升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組骨密度及雌激素對比

2.2 代謝組學結果

對干預后鑒定到的糞便代謝物進行功能和分類注釋，經(jīng)HMDB(Human Metabolome Database)分析，發(fā)現(xiàn)糞便脂質、有機酸、糖類和多酮類化合物、有機氧化合物、苯型化合物、核苷、核苷酸、生物堿及其衍生品等物質含量較高。與脂質圖譜比對，發(fā)現(xiàn)糞便代謝物中所含的脂質主要包括脂肪酸(FA)、聚酮類(PK)、甘油酯(GL)、甘油磷脂(GP)及固醇脂(ST)等。

圖1～4 PLS-DA得分散點圖中，橫縱坐標分別代表樣本在第一、第二主成分上的得分。R2Y表示模型的解釋率，Q2Y用于評價PLS-DA模型的預測能力，上述4圖中可見R2Y均>Q2Y，表示模型建立良好。圖1～4中，可見在正負離子模式下，干預后CD兩組樣本主成分的得分較BD兩組更為接近。說明模型組與埋線組大鼠去卵巢后代謝物的種類及數(shù)量發(fā)生了的變化，埋線可干預這一過程。采用PLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度值、差異倍數(shù)并結合T-test的P值可以找到不同組別之間的差異代謝物。

圖5在負離子模式下，DBC 3組之間共有的差異代謝物有48個，埋線組與假手術組之間共有184個差異代謝物，其中顯著上調的代謝物有28個，下調的有156個；埋線組與模型組共有136個差異代謝物，其中顯著上調的代謝物有7個，下調的有129個。圖6在正離子模式下，DBC 3組之間共有的差異代謝物有12個，埋線組與假手術組之間有94個差異代謝物，其中顯著上調的代謝物有68個，下調的有26個；埋線組與模型組之間有58個差異代謝物，其中顯著上調的代謝物有8個，下調的有50個?？梢姛o論是正離子模式還是負離子模式下，DB兩組之間共有的差異代謝物數(shù)量都高于DC兩組，說明大鼠去卵巢是干預代謝物變化的主要原因，埋線可對代謝物的變化有一定影響。

對檢測到的差異代謝物繼續(xù)進行KEGG富集分析，可以確定不同組之間的差異代謝物行使的主要生物學功能。在KEGG富集氣泡圖中，X坐標為X/Y(對應代謝途徑中不同代謝產(chǎn)物的數(shù)量/該代謝途徑中所識別出的代謝產(chǎn)物總數(shù))。值越高說明不同代謝物在途徑中的富集程度越高。點的顏色表示超幾何檢驗的P值，值越小，檢驗越可靠，統(tǒng)計意義越顯著。點的大小表示對應通路中差異代謝物的數(shù)量，點越大表示通路中差異代謝物越多。

圖7正離子模式下，DB兩組之間差異代謝物富集的KEGG通路主要包括類固醇激素生物合成、皮質醇合成與分泌及庫欣綜合征，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；另外，色氨酸代謝、卵巢類固醇生成、醛固酮合成與分泌、卟啉與葉綠素代謝、刺激神經(jīng)的配體與受體相互作用和膽汁分泌等KEGG通路中也有一定富集(P>0.05)。D組與B組相比，糞便孕烯醇酮、色氨酸和膽紅素等差異代謝物顯著上調，而尿皮質醇、黃尿酸和3-hydroxy-5-pregnan-20-one則出現(xiàn)下調。

圖8負離子模式下，DB兩組之間差異代謝物顯著富集的KEGG通路包括糖酵解/糖異生、磷酸戊糖通路和維生素B6代謝通路，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。另外，果糖和甘露糖代謝、磷酸肌醇代謝、硫胺素代謝及半乳糖代謝、半乳糖代謝等通路也出現(xiàn)富集，但這些通路富集結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。D組與B組相比，糞便3-磷酸甘油醛、熊果苷、D-核酮糖-5-磷酸鹽、NPC、前列腺素G2、胞嘧啶核苷、7α-25-二羥基膽固醇和二高-γ-亞麻酸鹽等差異代謝物出現(xiàn)下調。

圖9正離子模式下，DC兩組之間差異代謝物富集的KEGG通路包括色氨酸代謝和類固醇激素生物合成，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。D組與C組相比，無上調的差異代謝物，糞便黃尿酸和苯膽堿酮出現(xiàn)下調。圖10負離子模式下，DC兩組之間差異代謝物顯著富集的KEGG通路主要包括血小板活化、亞油酸代謝和5-羥色胺能突觸等，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而花生四烯酸代謝、α亞麻酸代謝、丙酸鹽代謝、視黃醇代謝、硫中繼系統(tǒng)、AMPK信號通路、壞死性凋亡、血管平滑肌收縮、Fcγ-R介導的吞噬作用、長時程抑制、GnRH信號通路、卵巢類固醇生成和不飽和脂肪酸的生物合成等通路也出現(xiàn)富集，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。D組與C組相比，糞便花生四烯酸、前列腺素G2、二高γ亞麻酸、丁二酸、維生素A、腺苷甲硫氨酸和黃連素等差異代謝物出現(xiàn)顯著下調。

3 討論

絕經(jīng)后卵巢功能下降和雌激素水平降低是引起PMOP[10]的主要原因。雌激素水平降低可刺激炎癥因子的釋放，從而增加破骨細胞的活性，導致骨質疏松[11]。此外，雌激素水平的下降還會降低骨對機械刺激的敏感性，導致類似[12]廢用性骨丟失的病理改變。

穴位埋線是一種集穴位封閉、針刺、刺血和組織治療[13]等多種療效于一體的復合治療方法。膠原蛋白線在體內被軟化、分解和吸收的過程對穴位起了緩慢的“長效針感”效應[14]，也有學者認為其是一種局部炎癥反應刺激效應[15]。這種刺激可促進肌肉合成代謝，降低分解代謝，使肌蛋白、糖類合成增高而乳酸和肌酸分解代謝降低[16]，還可以在大腦皮層功能區(qū)建立新的興奮點，從而調整神經(jīng)-內分泌和胃腸系統(tǒng)，加速新陳代謝[16-17]。有研究表明穴位埋線可明顯改善PMOP患者的臨床癥狀，調節(jié)激素水平，增加骨密度[18-20]。這與本研究中埋線組大鼠的血清雌激素水平及骨密度均較模型組明顯升高相符，說明埋線對PMOP有明確的治療作用。

代謝組學技術是近年來發(fā)展起來的一種能夠全面、快速和簡捷地反映體內代謝總體變化的技術手段，它注重人體內部的有機聯(lián)系以及人體與外在環(huán)境的統(tǒng)一，強調用動態(tài)觀點來研究生物體，從而達到了解病變過程及機體內物質的代謝途徑和代謝狀況的目的[21]。PMOP作為一種代謝性疾病，必然會導致生物體內的代謝物類型和濃度及代謝通路的改變[22-24]。

筆者發(fā)現(xiàn)，大鼠去卵巢后糞便脂質、有機酸、糖類和多酮類等化合物含量較多，這與文獻報道的高血糖、高血脂等糖脂代謝紊亂會對骨密度產(chǎn)生負面影響[25]相符。

研究表明[26-28]，類固醇激素生物合成、卵巢類固醇生成通路與骨質疏松癥的發(fā)生密切相關，雌激素及雄激素水平的降低均會增加罹患骨質疏松癥的風險。孕烯醇酮是大多數(shù)類固醇激素的主要前體，已被認為是一種新的抗骨質疏松劑。SUN X等[29]應用孕烯醇酮治療卵巢切除術引起的骨丟失，證明孕烯醇酮可預防卵巢切除引起的骨質疏松癥。庫欣綜合征等疾病會導致皮質醇增多，增多的皮質醇會促進蛋白分解，從而使骨基質減少，影響鈣的沉著，最終導致骨質疏松癥發(fā)生。FERRAF等[30]發(fā)現(xiàn)庫欣綜合征患者骨髓肥厚，認為這可能是高皮質激素誘發(fā)的骨骼脆弱的標志。

在本實驗中發(fā)現(xiàn)，埋線組大鼠與假手術組相比，主要在類固醇激素生物合成、皮質醇合成與分泌、庫欣綜合征、糖酵解和糖異生、磷酸戊糖途徑及維生素B6代謝等通路發(fā)生了顯著變化，說明去卵巢大鼠之所以發(fā)生骨質疏松與以上通路密切相關。糞便中孕烯醇酮、色氨酸和膽紅素等物質含量顯著上調，而尿皮質醇、黃尿酸、3-hydroxy-5-pregnan-20-one、3-磷酸甘油醛及5-磷酸核酮糖等則出現(xiàn)下調。這些代謝物主要通過參與上述代謝通路，導致了PMOP的發(fā)生。

埋線組與模型組相比，發(fā)生顯著變化的通路主要包括色氨酸代謝、類固醇激素生物合成、血小板活化、亞油酸代謝和5-羥色胺能突觸等，證明這是通過埋線干預PMOP的主要通路，其主要代謝產(chǎn)物包括花生四烯酸和前列腺素。游離的花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧合酶途徑可被催化成前列腺素和血栓素，經(jīng)脂氧合酶途徑可被催化成白三烯和脂氧素[31]。前列腺素和白三烯作為重要的炎性介質，可誘導激活炎癥反應相關的轉錄因子如NF-KВ等，從而刺激破骨細胞分化形成，對骨代謝和骨折愈合產(chǎn)生副作用[32]。另外，花生四烯酸還可誘導成骨細胞膜上RANKL表達，通過與破骨細胞上RANK的結合而促進破骨細胞成熟、分化和激活，還可通過抑制OPG分泌而增加破骨細胞作用[33]。可見，花生四烯酸通過多種途徑直接或間接地影響骨代謝，促進骨質疏松的發(fā)生。

本研究中，埋線組大鼠糞便中的花生四烯酸、前列腺素G2等代謝物含量較模型組均出現(xiàn)顯著下調，可見穴位埋線可通過降低花生四烯酸及前列腺素等物質的含量以減少或抑制炎癥反應，最終達到治療骨質疏松的目的。

綜上所述，穴位埋線可顯著提高去卵巢大鼠的雌激素水平及骨密度，這種作用可能主要通過干預色氨酸代謝、類固醇激素生物合成、血小板活化、亞油酸代謝和5-羥色胺能突觸等通路來實現(xiàn)。穴位埋線可有效糾正去卵巢大鼠的激素代謝紊亂、糖脂代謝紊亂及色氨酸代謝紊亂等情況，并可通過降低花生四烯酸及前列腺素的含量以減少或抑制炎癥反應，最終達到治療骨質疏松的目的。因而，筆者認為穴位埋線可通過干預多條代謝通路、多種途徑對絕經(jīng)后骨質疏松癥起到預防及治療作用，這為臨床應用提供了一定的理論基礎。而穴位埋線治療PMOP的最佳時間間隔及療程如何，則需要繼續(xù)深入研究。