徐雪嬌，李天英，李 欣，喬延盈，劉俊麟，田家華，何秀麗

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著工作和生活壓力的不斷增加，越來越多的人處于焦慮抑郁狀態(tài)，長期持續(xù)的焦慮抑郁狀態(tài)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生率顯著增高，嚴(yán)重影響人類的生命健康。隨之而來抑郁癥的發(fā)病率也呈爆發(fā)式增長，分布在各個年齡段，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。抑郁癥的病因是由遺傳和環(huán)境等多因素共同作用的結(jié)果。在眾多抑郁癥的發(fā)病機制中，經(jīng)典單胺類假說一直被大家認(rèn)可[1-2]，大量研究表明抑郁癥的發(fā)病存在單胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂的現(xiàn)象[3-4]，抑郁癥治療的相關(guān)研究表明抗抑郁藥物對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用[5-7]。針刺四神聰治療抑郁癥具有療效確切、依從性好且副作用小的優(yōu)勢[8-9]。筆者采用的抑郁模型為束縛抑郁模型，其模擬人類在日常生活中肉體和精神受到的持續(xù)束縛[10]，導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生。本研究針刺四神聰治療束縛抑郁模型大鼠，觀察針刺對行為學(xué)及海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗選用雄性SD大鼠，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物許可證編號：SCXK(黑)2018-003，所有大鼠飼養(yǎng)環(huán)境及飲食水均相同，符合嚙齒類動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實驗及造模流程

將18只雄性SD大鼠隨機分為3組，對照組、束縛組和束縛+針刺組各6只。大鼠進(jìn)入實驗室后首先適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，提供標(biāo)準(zhǔn)的實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境、飲食和飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，第8天進(jìn)行糖水基線測定，第9天進(jìn)行曠野實驗。第10～30天進(jìn)行抑郁造模。大鼠每天固定時間進(jìn)行束縛。具體束縛方法為[11]：每天9—15時將大鼠放置在塑料束縛容器中，連續(xù)束縛21 d。束縛結(jié)束后，第31天進(jìn)行糖水消耗實驗，第32天進(jìn)行曠野實驗。然后開始針刺治療14 d，針刺結(jié)束后第47天糖水消耗實驗，第48天進(jìn)行曠野實驗。第49天取材。見圖1。

1.3 行為學(xué)

1.3.1 糖水消耗 取兩個大小外形完全一致的飲水瓶，其中一瓶裝純水，另一瓶裝2 %濃度糖水。檢測2 h大鼠的糖水消耗值，即糖水飲用量/糖水+純水飲用量[12-13]。糖水消耗實驗前6 h禁水，糖水消耗實驗過程中禁食。見圖2。

1.3.2 曠野實驗 大鼠依次進(jìn)行曠野實驗，每只大鼠放置于相同的位置，且上一只實驗完畢后及時清理排泄物及曠野箱中的氣味，以保證放入大鼠不受到上只大鼠排泄物及氣味的影響[14]。大鼠放置于曠野箱(100 cm×100 cm×40 cm)后，適應(yīng)30 s后再進(jìn)行追蹤器(SMART, Panlab SL, Barcelona, Spain)拍攝。拍攝數(shù)據(jù)為5 min運動距離和中心范圍運動時間。記錄過程中保證大鼠在曠野箱內(nèi)活動，若爬出曠野箱則此次記錄失敗。見圖3。

1.4 針刺

使用一次性無菌針灸針(0.18 mm×13 mm，華佗針具，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)針刺四神聰[15-16]，操作前使用酒精棉球消毒穴位，刺入深度約5～6 mm，留針15 min。

1.5 取材

麻醉后即刻斷頭取腦，將腦組織放置于冰盤上，迅速剝離海馬組織。見圖4。放置于凍存管內(nèi)，做好編號標(biāo)記，超低溫冰箱(-80 ℃)保存。

1.6 單胺神經(jīng)遞質(zhì)芯片

進(jìn)行RNA提取和實時PCR微陣列程序。大鼠海馬組織提取RNA樣品，所有實驗均使用獨立的樣品進(jìn)行了3次。使用Trizol提取規(guī)程(Invitrogen，CA)提取總RNA，然后通過RNeasy?MinEluteTMCleanup Kit(Qiagen，Valencia，CA)純化。RNA濃度和純度通過NanoDrop ND-1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific，威爾明頓，DE)進(jìn)行定量。使用SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并使用2X Super Array PCR Master Mix(SuperArray Bioscience，F(xiàn)rederick，MD)通過PCR擴增互補DNA。使用大鼠多巴胺和5-羥色胺途徑PCR陣列(目錄號PAMM-158z，SuperArray Bioscience)以及大鼠GABA和谷氨酸PCR陣列(目錄號PAMM)測量樣品的基因表達(dá)。目錄號PAMM-152z，SuperArray Bioscience。使用△△Ct方法(表示為倍數(shù)變化)和Student’st檢驗對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 24.0軟件，根據(jù)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布選擇t檢驗或非參數(shù)檢驗。當(dāng)P<0.05時被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

2.1.1 糖水消耗結(jié)果 第8天，糖水基線測定，3組大鼠糖水消耗無差異。第31天，束縛造模結(jié)束后，束縛組和束縛+針刺組大鼠的糖水消耗值與對照組比較顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明束縛抑郁模型造模成功。針刺治療結(jié)束后，第47天，束縛+針刺組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與束縛組比較，糖水消耗顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明針刺可以逆轉(zhuǎn)束縛大鼠的欣快感缺失癥狀。見表1。

表1 糖水消耗

2.1.2 曠野實驗結(jié)果 整個實驗中，3組大鼠的曠野運動總距離無差異,說明3組大鼠運動能力無差異。曠野中心運動時間，束縛造模后，與對照組相比，束縛大鼠的中心運動時間顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明束縛抑郁模型成功建立。針刺結(jié)束后，與束縛組相比，束縛+針刺組大鼠中心運動時間顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明針刺可以逆轉(zhuǎn)束縛大鼠的抑郁樣行為。見表2。

表2 曠野實驗中心運動時間

2.2 芯片結(jié)果

2.2.1 芯片檢測結(jié)果 系統(tǒng)地檢測了3組大鼠海馬中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)。見表3。總共鑒定出16個差異表達(dá)的基因。與對照組大鼠相比，束縛大鼠以下物質(zhì)上調(diào)：磷脂酶A2組V(Pla2g5)，CAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(Creb1)，糖原合酶激酶3α(Gsk3a)，單胺氧化酶B(Maob)，磷脂酰肌醇3激酶催化α多肽(Pik3ca)，溶質(zhì)載體家族18(囊泡單胺)成員1(Slc18a1)，多巴脫羧酶(Ddc)，5-羥色胺(5-羥色胺)受體3B(Htr3b)，鈣離子通道依賴電壓的N型α1B亞基(Cacna1b)，3-磷酸甘油酸脫氫酶(Phgdh)，溶質(zhì)載體家族17(鈉依賴性無機磷酸鹽共轉(zhuǎn)運蛋白)8(Slc17a8)，A受體亞基alpha 6(Gabra6)和γ-氨基丁酸(GABA)C受體亞基rho 1(Gabrr1)。束縛大鼠的核受體亞家族4組A成員1(Nr4a1)，G蛋白偶聯(lián)受體激酶6(Grk6)和白介素1 beta(L11b)下調(diào)。與對照組相比，針刺后以下基因發(fā)生逆轉(zhuǎn)：Creb1，Gsk3a，Pla2g5，Cacna1b，Nr4a1。這些發(fā)現(xiàn)表明針刺在治療抑郁癥的同時影響海馬單胺神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)。

表3 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在各組中的表達(dá)

2.2.2 逆轉(zhuǎn)基因參與相關(guān)通路分析 應(yīng)用KEGG Mapper在線程序，搜索針刺后逆轉(zhuǎn)的5個基因所屬通路。主要參與多巴胺能突觸和膽堿能突觸途徑。見圖5～6。其中粉色標(biāo)注為逆轉(zhuǎn)基因及相關(guān)基因。以上兩個通路是研究抑郁癥的發(fā)病和治療的熱點。

3 討論

四神聰為經(jīng)外奇穴，位于巔頂百會穴前后左右各旁開1寸，共4穴?！夺樉馁Y生經(jīng)》記載：“神聰四穴，在百會四面各相去一寸。理頭風(fēng)目眩，狂亂風(fēng)癇，左主如花，右主如果。針三分?！彼纳衤斔谖恢门c督脈和膀胱經(jīng)關(guān)系密切，督脈入絡(luò)腦，膀胱經(jīng)從巔頂入絡(luò)腦，故具良好的醒神通竅、聰耳明目和寧心安神的功效。主治癲狂、癇證、失眠、健忘和頭暈頭痛等病癥。抑郁癥屬于中醫(yī)范圍的“癲證”，以情緒低落、欲望減低等負(fù)面情緒占主導(dǎo)。臨床上常應(yīng)用四神聰穴搭配電針或中藥聯(lián)合治療抑郁癥[17-18]，療效肯定，值得推廣使用。作為僅以疼痛為副作用的治療方法，針刺治療抑郁癥具有療效好、患者易于接受的特點。鑒于目前臨床上針刺治療抑郁癥的療效，針刺有望取代西藥而作為其主要治療手段。抑郁癥的發(fā)病有以下幾個觀點：遺傳因素、單胺假說、受體假說、神經(jīng)內(nèi)分泌假說、神經(jīng)可塑性假說、細(xì)胞因子假說和社會文化及心理因素[19-20]。單胺假說是目前比較公認(rèn)的抑郁癥病因假說，此觀點認(rèn)為抑郁癥的發(fā)生是由于中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量和功能水平下降導(dǎo)致。臨床上的一類抗抑郁藥物即為作用在單胺類神經(jīng)突觸，增加神經(jīng)遞質(zhì)的釋放而抗抑郁。本實驗探討針刺四神聰對抑郁大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的基因水平的調(diào)節(jié)作用，從基因的角度解釋針刺對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果中，行為學(xué)顯示針刺四神聰能夠逆轉(zhuǎn)束縛后抑郁大鼠的欣快感和抑郁樣行為。驗證四神聰能夠有效抗抑郁。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)芯片檢測結(jié)果顯示針刺可以逆轉(zhuǎn)抑郁大鼠以下基因：CAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(Creb1)，糖原合酶激酶3α(Gsk3a)，磷脂酶A2組V(Pla2g5)，鈣離子通道依賴電壓的N型α1B亞基(Cacna1b)，核受體亞家族4組A成員1(Nr4a1)。通路關(guān)聯(lián)分析顯示，逆轉(zhuǎn)的基因主要參與多巴胺能突觸和膽堿能突觸途徑。這5個基因歸屬于3類功能：參與神經(jīng)遞質(zhì)途徑的基因(Creb1，Gsk3a，Pla2g5)、突觸基因(Cacna1b)、多巴胺和5-羥色胺基因靶標(biāo)中涉及的基因(Nr4a1)。這3類基因主要參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)，突觸相關(guān)基因以及多巴胺和5-羥色胺。多巴胺為中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，五羥色胺則為抑制型神經(jīng)遞質(zhì)，Nr4a1參與兩者的調(diào)節(jié)，參與完成中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)的相對平衡。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)在調(diào)節(jié)腦功能和行為方面具有關(guān)鍵作用。Creb與抑郁癥、精神分裂癥和成癮等疾病密切相關(guān)，作為第二信使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要組分，在神經(jīng)的可塑性等方面發(fā)揮重要作用，一些亞型破壞后會影響認(rèn)知功能[21-22]。其對神經(jīng)元的保護(hù)作用主要體現(xiàn)在對抗細(xì)胞毒性和調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)。Gsk3廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括兩個亞型：GSK3a和GSK3β，其中Gsk3a主要存在于海馬和皮層[23]。睡眠障礙是抑郁癥患者常見的伴隨癥狀，有研究表明GSK3抑制劑鋰對抑郁癥患者的睡眠具有改善作用[24]。本研究證實針刺四神聰治療抑郁癥療效確切且調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)，為抑郁癥的針刺治療在單胺類神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)上提供基因?qū)用娴淖C據(jù)。