郭美亮，劉婉雯，孟琴琴，袁定芬，鄧輝

（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海 200233）

日光性角化?。ˋctinic keratosis，AK）和皮膚鱗狀細(xì)胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）都是以角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖為特征的皮膚疾病。AK是由紫外線（UV）輻射引起的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)育不良的病變，有發(fā)展為cSCC的能力，被認(rèn)為是cSCC最常見(jiàn)的癌前病變[1-2]。cSCC是最常見(jiàn)的皮膚腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率逐年累增，在皮膚腫瘤中僅次于基底細(xì)胞癌[3]。近年來(lái)，沉默信息調(diào)節(jié)蛋白（SIRT）與腫瘤的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。在癌癥中，SIRT3有抗腫瘤和促腫瘤的雙重效應(yīng)。在乳腺癌、肝癌、淋巴瘤中，SIRT3被認(rèn)為是一種腫瘤抑制蛋白并且與患者生存率的提高有關(guān)[4-6]。而在食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤等惡性腫瘤疾病中，SIRT3的高表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)因素和預(yù)后的負(fù)相關(guān)因素[7-10]。然而，SIRT3在皮膚非黑素瘤皮膚癌中的作用尚未有明確報(bào)道。本研究擬通過(guò)檢測(cè)SIRT3在正常皮膚（NS）、AK和cSCC的表達(dá)，從而初步探討SIRT3在AK、cSCC發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年6月—2020年3月于我院就診患者中，根據(jù)臨床表現(xiàn)和組織病理，確診為AK的30例和cSCC的28例石蠟組織標(biāo)本。30例皮膚正常對(duì)照組來(lái)自于良性腫物手術(shù)切除附帶的正常皮膚。

1.2 主要試劑 SIRT3抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司（AF5135），抗體使用濃度為 1∶200。免疫組化試劑盒（SA1022）和DAB顯色試劑盒（AR1022）購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。

1.3 免疫組化 將組織蠟塊4 μm切片，置于防脫載玻片上。后續(xù)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行，主要步驟包括脫蠟、梯度水化、抗原修復(fù)、滅活過(guò)氧化氫酶、破膜、胎牛血清封閉、滴加一抗、滴加生物素標(biāo)記二抗、滴加SABC復(fù)合物、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、梯度脫水、封片。

1.4 結(jié)果判定 高倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，利用Image Pro Plus軟件綜合染色陽(yáng)性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度評(píng)分進(jìn)行半定量分析。陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞率5%以下為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，75%以上為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)染色為0分，淺染色為1分，中度染色為2分，強(qiáng)染色為3分。2項(xiàng)結(jié)果評(píng)分相加，分為4個(gè)等級(jí)：0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽(yáng)性（+），4～5分為中度陽(yáng)性（++），6分以上強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，多組之間的的陽(yáng)性率比較用方差分析，其中兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT3在NS、AK和cSCC組織免疫組化染色情況 SIRT3主要表達(dá)于表皮細(xì)胞的胞質(zhì)，在NS組和AK組中，SIRT3主要呈弱陽(yáng)性或中度陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖1、2，在cSCC組中，SIRT3主要呈中度陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖3。

圖1 SIRT3在NS組織中表達(dá)（免疫組化染色 a×100，b×200，c×400）

圖2 SIRT3在AK組織中表達(dá)（免疫組化染色 a×100，b×200，c×400）

圖3 SIRT3在cSCC組織中表達(dá)（免疫組化染色 a×100，b×200，c×400）

2.2 NS、AK和cSCC組織中SIRT3表達(dá)差異 SIRT3在NS、AK和cSCC組織中的陽(yáng)性細(xì)胞率呈遞增趨勢(shì)，3組內(nèi)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。各組間陽(yáng)性細(xì)胞率的比較結(jié)果顯示cSCC組織的SIRT3陽(yáng)性細(xì)胞率顯著高于NS和AK組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而NS和AK組織之間的陽(yáng)性細(xì)胞率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。SIRT3在NS、AK和cSCC組織中強(qiáng)陽(yáng)性率呈遞增趨勢(shì)，3組內(nèi)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。組間強(qiáng)陽(yáng)性率的比較結(jié)果顯示cSCC組SIRT3表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性率顯著高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而NS組和AK組、AK組和cSCC組之間的強(qiáng)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表1 SIRT3在NS、AK和cSCC組織中的表達(dá)

表2 NS、AK和cSCC組織中SIRT3表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率的比較

表3 NS、AK和cSCC組織中SIRT3強(qiáng)陽(yáng)性率的比較

3 討論

SIRT是一種從細(xì)菌到人類都高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙酰化酶，與釀酒酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Sir2）有同源性[11]。目前，哺乳動(dòng)物體內(nèi)已經(jīng)鑒定出SIRT1-7，其有不同的亞細(xì)胞定位和生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，維持基因組穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝和衰老等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。SIRT3主要位于線粒體中，也有研究者認(rèn)為SIRT3在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá)[11-13]。SIRT3可以使氧化應(yīng)激所必需的，包括抗氧化酶和參與線粒體功能和三磷酸甘油酸（ATP）合成的多種酶去乙酰和活化，因此SIRT3對(duì)線粒體蛋白的翻譯后修飾在維持能量代謝、活性氧（ROS）水平和其他線粒體功能中起著重要作用[14]。SIRT3作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)，但SIRT3在腫瘤進(jìn)程中的作用有雙面性。一方面，作為腫瘤抑制因子，SIRT3在乳腺癌中通過(guò)抑制低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）從而抑制糖酵解和合成代謝，從而減少癌細(xì)胞增殖[15]。此外，SIRT3也能夠通過(guò)靶向B細(xì)胞淋巴瘤（Bcl-2）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而SIRT3的缺失則會(huì)通過(guò)ROS依賴途徑促進(jìn)增殖[6，16]。另一方面，作為腫瘤基因的SIRT3被認(rèn)為能維持ROS從而防止細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖[17]。另外SIRT3也能通過(guò)使脫氧核糖核酸（DNA）修復(fù)相關(guān)蛋白Ku70去乙?；瑥亩龠M(jìn)Ku70與促凋亡蛋白Bax，減少細(xì)胞凋亡[18]。腫瘤抑制蛋白p53也與SIRT3的促腫瘤過(guò)程相互關(guān)聯(lián)。細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SIRT3和p53在線粒體中存在共定位，細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)SIRT3能夠抑制p53的生長(zhǎng)抑制活性，表明p53是SIRT3調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的重要下游蛋白[18-19]。

cSCC的進(jìn)展過(guò)程一般認(rèn)為始于紫外線（UV）照射后誘發(fā)的AK，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展為原位SCC、浸潤(rùn)性SCC，最后進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性SCC[20]。約有58%的cSCC帶有UV引起的特征性突變，因此UV在cSCC發(fā)病過(guò)程中的作用可能與通過(guò)誘導(dǎo)p53失活，引起細(xì)胞基因組維持能力受損有關(guān)[21]。另外，一項(xiàng)研究顯示UV照射會(huì)引起線粒體SIRT3水平和活性氧的失調(diào)[22]，而補(bǔ)充煙酸能夠逆轉(zhuǎn)SIRT3的上調(diào)和光損傷，提示SIRT3在UV刺激后的水平變化可能是一種應(yīng)激性的改變[23]。

本研究發(fā)現(xiàn)SIRT3在cSCC患者的腫瘤組織中表達(dá)高于正常人，鑒于p53在AK和cSCC病程中的作用和SIRT3對(duì)p53的抑制功能，筆者推測(cè)包括UV在內(nèi)的各種因素誘發(fā)的SIRT3水平變化可能通過(guò)p53參與了AK和cSCC的進(jìn)展過(guò)程。其他研究發(fā)現(xiàn)口腔SCC細(xì)胞系雖然SIRT3表達(dá)升高，但其去乙酰化活性卻降低了[24]。因此，SIRT3的去乙?；钚栽贏K和cSCC中的作用仍需要更多的證據(jù)支持。