張耀丹

（勃林格殷格翰動物保?。ㄖ袊┯邢薰?，上海 201203）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS） 俗稱豬藍(lán)耳病，是由PRRS 病毒（PRRSV）引起的全球養(yǎng)豬業(yè)最具挑戰(zhàn)性的病毒性疾病之一。PRRSV 毒株具有多樣性并且因為容易變異、感染時間長等特征，導(dǎo)致防控難度較大。該病在我國已經(jīng)流行20 多年，至今感染率仍居高不下，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前，在非洲豬瘟肆虐的大環(huán)境下，PRRS 的防控依然是全世界養(yǎng)豬業(yè)十分關(guān)注的重大難題之一。在PRRS 的防控過程中，對PRRS 及時且準(zhǔn)確地監(jiān)測是做好防控的重要前提。實驗室的抗原檢測在多種PRRS 檢測方法中扮演著十分重要的角色，同時也是評判各項防控措施是否有效的參考標(biāo)準(zhǔn)。PRRS 抗原檢測不僅能夠了解PRRS 的病毒含量和鑒定毒株的類型，還能反映出PRRSV 的感染程度以及確定PRRSV 的感染時間等，以便從源頭解決問題。因此，PRRS抗原檢測結(jié)果的準(zhǔn)確與否，對該病的有效控制非常重要, 所以也備受關(guān)注。

PRRS 抗原檢測的重要方法之一是逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量RT-qPCR（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）， 其 靈 敏度比常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)高約100 倍，因此被廣泛用于檢測臨床組織樣品、血清及精液中PRRSV核酸。相較于其他樣品類型，組織樣品的檢測流程最為復(fù)雜。組織勻漿處理需要很多前期準(zhǔn)備工作，如剪刀、鑷子、離心管和不銹鋼珠的高壓滅菌、烘干等；之后需稱量一定重量的組織，用剪刀剪碎后，加鋼珠置于研磨儀中研磨，研磨后置于低溫離心機中離心，取上清后才能進行病毒核酸的提取。整個過程需要持續(xù)在低溫環(huán)境進行，離心管、鋼珠和PBS（磷酸緩沖液）需提前預(yù)冷，操作時必須在冰盒上進行。如果樣本研磨處理過程不能持續(xù)保持低溫, 樣本中的核酸得不到有效保護，容易導(dǎo)致病毒核酸發(fā)生降解，從而出現(xiàn)假陰性，檢測結(jié)果的真實性就難以得到保證。因此，組織樣品中病毒核酸樣品的提取及保存對檢測結(jié)果至關(guān)重要，而與其相關(guān)的研究較少。樣品保存液中一般由用于培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)菌的基礎(chǔ)緩沖液、平衡鹽或蛋白緩沖液組成，其中的蛋白質(zhì)可有效防止病毒核酸的降解。本研究采用RT-qPCR 方法，利用PRRS 陽性組織樣品比較了組織樣品保存液與傳統(tǒng)的研磨勻漿處理兩種方法對PRRSV 核酸的保護效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品保存液對PRRSV核酸在常溫甚至是高溫條件下長時間保存的保護效果比較理想，因此建議在對組織樣品核酸檢測前可以直接使用樣品保存液對病毒核酸進行保護。

1 材料方法

1.1 組織樣品的來源

組織樣品來自某豬場，已知PRRSV 陽性的豬肝臟、腎臟、脾臟混合樣品。

1.2 試劑與儀器

扶思得病毒保存液、Gibco 磷酸鹽緩沖液（PBS，不含Ca2+、不含Mg2+）、ABI 廠家5XMagMAX ?Core 核酸提取試劑盒，ABI 廠家PRRSV 分 型 NA 和 EU 熒 光 定 量PCR 檢測試劑盒、QIAGEN Tissue Lyser II 型組織研磨儀、Thermo Scientif ic Kingf isher Flex 核酸提取儀、ABI 廠家7500 熒光定量PCR儀等。

1.3 樣品處理與核酸提取

將含PRRSV 的組織樣品平均分為2 組，1 組進行勻漿機研磨處理作為對照組，1 組加入保存液浸泡處理作為實驗組。

1.3.1 樣品處理

將上述研磨處理組樣品，平均剪成3 份稱量約為0.5 g 的塊狀，用滅菌后的剪刀剪碎；各加入1 mL 預(yù)冷的PBS 和1 顆直徑5 mm 的無菌鋼珠；隨后將EP 管裝入研磨儀適配器中進行勻漿，以28 Hz 的頻率，2 min 內(nèi)重復(fù)6 次；隨后12 000 r/min，4℃離心5 min，將上清分別置于4 ℃、25 ℃和37 ℃中保存，并在第0 天、第1 天、第3 天和第7 天的同一時間點分別取樣檢測。

將另1 份保存液組樣品平均剪成3 份約1 cm3大小的塊狀，分別浸泡在3 mL 的保存液中，至于4℃、25℃和37℃中保存，并在第0 天、第1 天、第3 天和第7 天的同一時間點分別取樣。

1.3.2 核酸提取

取樣完成后，使用ABI 廠家5XMagMAX ? Core 核 酸 提 取 試劑盒和Thermo Scientif ic Kingf isher Flex 核酸提取儀進行核酸提取。

1.4 熒光定量PCR 檢測

使 用ABI 廠 家PRRSV NA 株和EU 株分型熒光定量PCR 檢測試劑盒進行熒光定量PCR，按照表1體系配置預(yù)混液：10.5 μL/孔，分裝在PCR 專用96 孔板中，加入5 μL 樣品核酸，封膜后離心。

表1 預(yù)混液

設(shè)置反應(yīng)程序，結(jié)束后保存結(jié)果（表2）。

表2 反應(yīng)程序

2 結(jié)果

2.1 保存時間對PRRSV 核酸檢出量的影響

保存液組在各個溫度條件下，第0 天到第7 天時PRRSV 核酸檢測量差異不大（見表3），核酸檢出量不因樣品保存時間的延長而降低。勻漿組在各個溫度條件下保存時，在第0 天、第1 天、第3 天時，病毒核酸檢出量呈緩慢減少的趨勢；當(dāng)保存至第7 天時，病毒核酸檢出量明顯減少，最大相差5.1 個Ct 值（約34 倍）。

表3 不同保存時間和不同保存溫度下PRRSV 核酸檢測結(jié)果

2.2 保存溫度對PRRSV 核酸檢出量的影響

保存液組PRRSV 核酸檢出量受溫度影響變化不大；而勻漿組在4℃保存測得Ct 值比25℃保存低4.5 個Ct 值（檢出量約高22 倍），4℃保存測得Ct 值比37℃保存低約12 個Ct 值（檢出量約高4 100 倍）。

2.3 病毒核酸保存效果評價

在4℃條件下，勻漿液第0 天、第1 天、第3 天Ct 值最低，檢出量最高，病毒核酸保存效果最好；其次是25℃和37℃在第0 天、第1 天、第3 天和第7 天的保存液，比4℃條件下勻漿液第0 天、第1 天、第3 天高約2.6 個Ct 值（約6 倍）；最不理想的保存條件是高溫條件下保存的勻漿液樣品，隨著溫度升高和時間延長，核酸逐步降解，甚至檢測結(jié)果為陰性。

3 討論

PRRS 是一種感染率高、發(fā)病急、病死率高的接觸性傳染病。該病在我國自1996 年首次報道以來，已廣泛流行于全國各省，造成懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎及斷奶仔豬肺炎等，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟損失。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)引起該病的病原為PRRSV。PRRSV 對溫度較敏感，低溫下保存的PRRSV 具有較好的穩(wěn)定性，而干燥的環(huán)境中則迅速失去活力，通常在37℃下能保存48 h，50℃下則45 min 就失去感染性。

在病毒感染的情況下，如果能及時并且準(zhǔn)確地鑒定出病毒的存在，則可以采取有效的措施阻止病毒的擴散傳播，從而可以大大減少由此帶來的經(jīng)濟損失。逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量RT-qPCR，被廣泛用于檢測臨床組織樣品、血清及精液中PRRSV 核 酸。但 針 對PRRSV 的檢測有諸多的局限，其中病毒樣品的保存是病毒檢測過程中關(guān)鍵的挑戰(zhàn)。由于實踐中，PRRSV 樣品的檢測往往需要運送至距離相對較遠(yuǎn)的、具備檢測條件的實驗室進行檢測。傳統(tǒng)的運輸條件需要放置干冰或冰袋運輸。干冰運送成本較高，而且對于偏遠(yuǎn)的養(yǎng)殖場且不宜獲得；足夠數(shù)量的冰袋可以暫時提供低溫環(huán)境，但冬季運輸時間超過1 ～2 d，夏季超過幾個小時冰袋就會發(fā)生融化。實驗室處理組織不僅需要提前對剪刀、鑷子和鋼珠進行滅菌處理，還需提前預(yù)冷PBS、鋼珠、研磨儀適配器和離心機，研磨結(jié)束需再次清洗使用的器械，并進行滅菌處理。如果樣品處理時間過長，或處理的環(huán)境溫度略高，樣品的質(zhì)量就會受到影響，從而可能加速病毒RNA 降解, 容易在檢測過程中出現(xiàn)假陰性結(jié)果，影響檢測的真實性；研磨過程使用的剪刀、鑷子和其他耗材增加了樣品交叉污染的可能，不利于生物安全，也影響檢測結(jié)果的真實性。因此適當(dāng)?shù)臉悠愤\輸和保存處理方法尤為重要，而關(guān)于樣品運輸和保存相關(guān)的實驗數(shù)據(jù)有限。

本研究發(fā)現(xiàn)對于含PRRSV 的組織，保存液直接浸泡即可釋放出病毒核酸，并且病毒核酸的檢出量不會隨溫度的升高和保存時間的延長而減少，即使在37℃高溫條件下保存7 d，病毒核酸的檢出量仍與4℃、25℃保存的檢出量基本一致。雖然勻漿后的組織樣品在4℃條件下病毒核酸檢出量比浸泡在樣品保存液中的樣品略高（約6倍），但對于病毒載量高的樣品來說檢測結(jié)果仍然十分可靠；并且比起25℃和37℃條件下，勻漿液中病毒核酸檢出敏感度超過2 000 倍，保存液的保存更具優(yōu)勢。勻漿液的保存對低溫和時間控制有嚴(yán)格的要求，保存溫度越高，保存時間越長，核酸降解的越快。在實踐中，樣品運輸過程的質(zhì)控面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，組織樣品的勻漿過程不僅大大增加了樣品預(yù)處理的時間，也承擔(dān)著樣品流轉(zhuǎn)過程中低溫環(huán)境難以維持的風(fēng)險。相比之下，使用保存液處理樣品時，只需養(yǎng)殖場的工作人員將組織樣品剪成1 cm3左右的塊狀物并浸泡于保存液中，便可常溫運輸?shù)綄嶒炇?；實驗室檢測人員在檢測時只需抽取部分保存液即可進行核酸提取，在保證病毒核酸檢測穩(wěn)定的前提下大大減少了工作量。